专利名称：一种检测桑树花叶萎缩病病原体的方法
技术领域：
本发明涉及病原体的鉴定及桑树及其幼苗转运中的检疫等用途，尤其涉及桑树
及其幼苗在转运中的检疫等应用，属于生物检测技术领域。
背景技术：
桑花叶型萎縮病又称"癃桑"。早在1313年古农书中就有记载(王祯农书，元 代圣庆2年)。现今在江、浙蚕农所谓的"癃桑"，实际上具有多种症状。其中，叶部 呈现黄绿相间的花叶症的一种，定名为桑花叶型萎縮病(蒯元璋，1965)。此病仅分布在 中国，在我国的浙江、四川、安徽、江苏、江西、云南、上海、重庆等省、市蚕区均有 发生。因此，此病已成为国内重要的桑树病害。1990年在病桑组织内发现类似类病毒 (Viroid)的小分子RNA病原体(蒯元璋、田波等，1990)。 2007年，费建明等获得了该病 原体的部分序列(费建明等，2007)，并于2008年在GenBank数据库中登录了该病原体的 全长序列。但目前该病尚无有效的防治方法。因此，对该病的检疫将有助于防止该病的 进一步扩散。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测桑树花叶萎縮病病原体的方法。 一种检测桑 树花叶萎縮病病原体的方法，包括以下步骤 ①从待检测的桑树的叶片或芽体剪取样品，提取总RNA得到提取溶液；
②在所述提取溶液中加入DNA分解酶，待DNA分解后得到总RNA溶液；
③取总RNA溶液中的溶液，将RNA进行RNA逆转录，合成cDNA ;
对合成的cDNA进行PCR扩增； ⑤取扩增的cDNA，在琼脂糖下电泳，得到提纯的cDNA; ⑥将经过步骤⑤得到的cDNA在紫外灯下观察是否有扩增的DNA条带。 作为优选，所述的将RNA进行RNA逆转录是由腺苷酸、尿苷酸、胸腺嘧啶和尿
嘧啶随机组合的长度为6个核苷酸的随机引物的混合物为引物。 作为优选，所述步骤④中PCR扩增时使用的引物序列为引物l: 5' -GTC
CAG ACA CAC ATC T-3 ，，引物2 : 5' -TGA TGA GTT CGA AAG AAC-3'。 作为优选，所述PCR扩增条件是先于95t:变性5分钟然后进入30个PCR的循
环，循环结束后，再在72t:条件下保持10分钟。 作为优选，步骤⑥所述紫外灯观察在356bp位置进行。 作为优选，步骤①中所述的提取总RNA是以Trizol试剂作为提取剂提取总 RNA。 在琼脂糖电泳后，如果能在紫外灯下在356bp位置看见扩增的DNA条带，则表 明该桑树或苗中携带该病原体。如果样品中存在该分子，整枝植株应予以销毁，以防止 该病的扩散。
本发明的有益效果在于可通过对该病原体特征序列的扩增来检测病原体的存 在， 一般可在数小时内完成，快速灵敏。
具体实施例方式
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术 人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要 在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
实施例一 —种检测桑树花叶萎縮病病原体的方法，包括如下步骤 ①桑树叶或芽体的总RNA提取从待检测的桑树或桑苗的叶片或芽体剪取0.5 克样品，以Trizol试剂提取总RNA。在经氯仿提取除去多余的蛋白质后，在提取溶液中 加入DNA分解酶以除去溶液中的DNA获得总RNA。 ②cDNA的合成取经步骤①得到的总RNA 0.1 0.5mg，采用由腺苷酸、尿 苷酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶随机组合的长度为6个核苷酸的随机引物的混合物为引物，用 RNA逆转录酶进行RNA逆转录，42"C下保持50分钟，合成cDNA。
③特征片段的PCR扩增以合成的cDNA做模板，用引物1 : GTC CAG ACA CAC ATC T禾口引物2 : TGA TGA GTT CGA AAG AAC来扩增cDNA片段。反应液的组 成包括cDNAl微升，引物l和引物2(10纳克/毫升)各l微升，Taq酶0.5微升，10 倍的反应缓冲液2.5微升，dNTP(10纳克/毫升)l微升，水18微升，总体积25微升。 PCR扩增条件为先95t:变性5分钟，进入30个PCR的循环，即94。C停留30秒后调到 55t:30秒，再停留30秒后调到72t:，最后保持l分钟。整个循环结束后，再在72t:停 留10分钟，以达到充分延伸。 ④特异片段的鉴定取PCR反应液5微升，在2%的琼脂糖中电泳，在紫外灯下 在356bp位置观察DNA条带是否存在，如果出现条带，表明样品中含上述的病原体，应 予以控制和销毁。
实施例二 —种检测桑树花叶萎縮病病原体的方法，包括如下步骤 ①桑树叶或芽体的总RNA提取从待检测的桑树或桑苗的叶片或芽体剪取0.8 克样品，以Trizol试剂提取总RNA。在经氯仿提取除去多余的蛋白质后，在提取溶液中 加入DNA分解酶以除去溶液中的DNA获得总RNA。 ②cDNA的合成取经步骤①得到的总RNA 0.1 0.5mg，采用由腺苷酸、尿 苷酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶随机组合的长度为6个核苷酸的随机引物的混合物为引物，用 RNA逆转录酶进行RNA逆转录，4(TC下保持50分钟，合成cDNA。
③特征片段的PCR扩增以合成的cDNA做模板，用引物1 : GTC CAG ACA CAC ATC T禾口引物2 : TGA TGA GTT CGA AAG AAC来扩增cDNA片段。反应液的组 成包括cDNAl微升，引物1和引物2(10纳克/毫升)各1微升，Taq酶0.6微升，10 倍的反应缓冲液2.8微升，dNTP(10纳克/毫升)l微升，水若干微升，总体积25微升。 PCR扩增条件为先96t:变性5分钟，进入30个PCR的循环，即94。C停留30秒后调到 55t:30秒，再停留30秒后调到72t:，最后保持l分钟。整个循环结束后，再在7(TC停留10分钟，以达到充分延伸。 ④特异片段的鉴定取PCR反应液6微升，在2%的琼脂糖中电泳，在紫外灯下 在356bp位置观察DNA条带是否存在，如果出现条带，表明样品中含上述的病原体，应 予以控制和销毁。
实施例三 —种检测桑树花叶萎縮病病原体的方法，包括如下步骤 ①桑树叶或芽体的总RNA提取从待检测的桑树或桑苗的叶片或芽体剪取1.0 克样品，以Trizol试剂提取总RNA。在经氯仿提取除去多余的蛋白质后，在提取溶液中 加入DNA分解酶以除去溶液中的DNA获得总RNA。 ②cDNA的合成取经步骤①得到的总RNA 0.2 0.8mg，采用由腺苷酸、尿 苷酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶随机组合的长度为6个核苷酸的随机引物的混合物为引物，用 RNA逆转录酶进行RNA逆转录，45"C下保持50分钟，合成cDNA ;
③特征片段的PCR扩增以合成的cDNA做模板，用引物1 : GTC CAG ACA CAC ATC T禾口引物2 : TGA TGA GTT CGA AAG AAC来扩增cDNA片段。反应液的组 成包括cDNAl微升，引物l和引物2(10纳克/毫升)各l微升，Taq酶1.0微升，10 倍的反应缓冲液3.0微升，dNTP(10纳克/毫升)l微升，水若干微升，总体积25微升。 PCR扩增条件为先98t:变性5分钟，进入30个PCR的循环，即94"C停留30秒后调到 55t:30秒，再停留30秒后调到72t:，最后保持l分钟。整个循环结束后，再在75t:停 留10分钟，以达到充分延伸。 ④特异片段的鉴定取PCR反应液10微升，在2%的琼脂糖中电泳，在紫外灯 下在356bp位置观察DNA条带是否存在，如果出现条带，表明样品中含上述的病原体， 应予以控制和销毁。
权利要求
一种检测桑树花叶萎缩病病原体的方法，包括以下步骤①从待检测的桑树的叶片或芽体剪取样品，提取总RNA得到提取溶液；②在所述提取溶液中加入DNA分解酶，待DNA分解后得到总RNA溶液；③取总RNA溶液中的溶液，将RNA进行RNA逆转录，合成cDNA；④对合成的cDNA进行PCR扩增；⑤取扩增的cDNA，在琼脂糖下电泳，得到提纯的cDNA；⑥将经过步骤⑤得到的cDNA在紫外灯下观察是否有扩增的DNA条带。
2. 根据权利要求1所述的一种检测桑树花叶萎縮病病原体的方法，其特征在于所 述的将RNA进行RNA逆转录是由腺苷酸、尿苷酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶随机组合的长度为 6个核苷酸的随机引物的混合物为引物。
3. 根据权利要求1所述的一种检测桑树花叶萎縮病病原体的方法，其特征在于所 述步骤 中PCR扩增时使用的弓I物序列为引物1 : 5-GTC CAG ACA CAC ATC T-3'， 引物2 : 5' -TGA TGA GTT CGA AAG AAC-3'。
4. 根据权利要求1所述的一种检测桑树花叶萎縮病病原体的方法，其特征在于所述PCR扩增条件是先于95t:变性5分钟然后进入30个PCR的循环，循环结束后，再在 72t:条件下保持10分钟。
5. 根据权利要求4所述的一种检测桑树花叶萎縮病病原体的方法，其特征在于所 述的循环具体为94t:停留30秒后，于55t:停留30秒后，于72t:保持l分钟。
6. 根据权利要求1所述的一种检测桑树花叶萎縮病病原体的方法，其特征在于步 骤⑥所述紫外灯观察在356bp位置进行。
7. 根据权利要求1所述的一种检测桑树花叶萎縮病病原体的方法，其特征在于步 骤①中所述的提取总RNA是以Trizol试剂作为提取剂提取总RNA。
全文摘要
本发明涉及涉及一种检测桑树花叶萎缩病病原体的方法，属于生物检测技术领域。具体包括以下步骤①从待检测的桑树的叶片或芽体剪取样品，提取总RNA得到提取溶液；②在所述提取溶液中加入DNA分解酶，待DNA分解后得到总RNA溶液；③取总RNA溶液中的溶液，将RNA进行RNA逆转录，合成cDNA；④对合成的cDNA进行PCR扩增；⑤取扩增的cDNA，在琼脂糖下电泳，得到提纯的cDNA；⑥将经过步骤⑤得到的cDNA在紫外灯下观察是否有扩增的DNA条带。本发明可通过对该病原体特征序列的扩增来检测病原体的存在，可在数小时内完成，快速灵敏。
文档编号C12Q1/70GK101691616SQ200910101859
公开日2010年4月7日 申请日期2009年9月3日 优先权日2009年9月3日
发明者施国方, 李玉峰, 王文兵, 白雪川, 费建明 申请人:湖州市农业科学研究院