专利名称：毛竹微卫星分子标记的开发与应用的制作方法
毛竹微卫星分子标记的开发与应用
技术领域：
本发明涉及一种植物DNA分子标记技术，具体为毛竹微卫星分子标记的开发技术及其在刚竹属其他竹种的应用。
背景技术：
毛竹(/VyV/ostoc/y^ /w6eirera)是禾本禾斗(Gramineae)竹亚禾斗(Bambusoideae)冈lJ竹属(尸*//0^"^")植物，是我国竹类资源中最主要的竹种之一，其分布广、生长快、利用多，具有重要的经济和生态价值。竹子由于缺乏有效的有性繁育系统，多以地下茎延伸为主的无性繁殖，因而常规的育种技术无法加以利用，导致竹子的育种进程停滞不前，成为竹产业发展的主要瓶颈。分子辅助育种或将成为竹子育种的重要手段。其中微卫星标记(SSR, Simple Sequence Repeat)作为以DNA聚合酶链式反应(PCR, Polymerase Chain Reaction)技术和测序技术为基础的分子标记，是构建高密度分子遗传图谱、分析物种分类与演化、染色体结构、遗传多样性、品种保护与纯度鉴定的有效工具，被认为是当前种内遗传变异研究中分辨率最高、揭示力最强的分子标记。迄今，竹类植物中的微卫星分子标记的开发利用甚少，国内只有李淑娴在2002年利用水稻微卫星标记引物随机扩增竹子基因组，但未对条带进行测序确认为竹子微卫星的报道；此外，印度报道Nayak和Rout通过构建和筛选印度刺竹(5aw6wra fln^^"flcefl)的基因组文库，得到6个微卫星分子标记。国内外尚无毛竹微卫星分子标记相关的报道。
发明内容
针对现有技术尚未开发毛竹微卫星标记的现状，本发明要解决的问题是利用公共数据库中现有的毛竹基因组序列，应用生物信息学方法，开发出毛竹微卫星分子标记，并应用于刚竹属其他竹种，进一步开发出能够广泛应用于刚竹属竹种的微卫星分子标记。
解决本技术问题的技术方案是
本毛竹微卫星分子标记的开发方法包括如下步骤(1)毛竹DNA序列的获得用毛竹的拉丁文学名作为关键词，在美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库中检索并下载获得；(2)含有微卫星DNA序列的筛选用单机版微卫星分析程序和在线微卫星位点分析软件，对下载的序列进行筛选，获得含有微卫星位点的毛竹DNA序列；(3)引物设计和微卫星位点验证①引物设计用引物设计软件设计扩增含有微卫星位点的DNA聚合酶链式反应引物，引物含有碱基数控制在18—22个，两引物退火温度差〈4。C，扩增的DNA片段在350个碱基以内；②微卫星验证利用上述引物进行DNA聚合酶链式反应扩增、扩增产物的电泳分离、银染检测、微卫星位点的再扩增、亚克隆和测序确认工作，最后得到19对毛竹微卫星标记引物，其退火温度在46。C一59。C。
获得19对毛竹微卫星标记的引物分别是
PBM002:5，-ATGGAGC ATTCATTTGAG-3'5,- TTGACAAGTTTGGAGGGT-3'
PBM004:5，-CGATGAAGTTGCCTGTGG-3'5，- TCAAGTCGCATTGGAGTA-3'
PBM007:5,-CTCGAGGTGAAGTTAC ATTA-3'5，- TCGTAGAGCACTATCCATTT-3，
PBM011:5，-TAAAGAAGTATAATGTATTCG-3'5，- AGCTGTTTTAGCATCTATGTT-3
PBM013:5，-TTTTACTAACGTGCCCGTATT-3'5，- GGAGGATCGCTGGATTGG-3'
PBM014:5，-GCCGTCCAAACGCTCCTT-3'5，- CACCCATCCATCTTATGCTAT-3，
PBM016:5,-CCCACAGAAGGTCGCACTA-3'5，陽CCGCCGAGAACGTCTACAT-3，
PBM017:5，-TATGCCTCC AATAATCCG-3'5，隱AAGGCGTAGCCACCGAAT-3，
PBM018:5,-GACGACGAGTGTAACGCTGAG-3'5 ，- AGGATGATGCCGGTGAGG-3'
PBM019:5，-TCCTAGCCCTACCCTGTCC-3'5，- CACGGTGCTCGCTTAAATAG-3，
PBM020:5，-TCGCATCTAAACAACATC-3'5，- GAGAAGAAGAAAGGAGGA-3'
PBM021:5，-AGGGTGTTATTTGCTATTGT-3'5,- AAATCCGACGCTGGAGGC-3'
PBM022:5，-AAAGATGTTGCCTTGTTC-3 ，5，- GTGCATGTCTATTCCCTC-3'
PBM023:5，陽TTTCATGGAGGGCGACAG-3' 5，■ GCCGACCAGGAAACAAACGAA-3，
PBM025:5，-GTTGTGCCC AGCACTTTA-3'5，- TGACGCCACTCATTTCTT -3'
PBM026:5,-CTATCATCAAATGTGCCTCAA -3，5，- CCGAGCCTCACTTTCTGC-3'
PBM027:5，-AAAGC AACCACGCCATTA-3'5，- TCGGAGGAGAAGGAGAAG-3'
PBM028:5,誦CAGGTAGTCGTCTTATCGAGT-3 ，5，- ATAAGTCAATTTCGAATGAA-3'
PBM030:5，_GTTGCCCGTGGTTACTGT-3' 5 ，- CGTGAGCCATCTGAGTTT-3'编号分别为PBM002、 PBM004、 PBM007、 PBMOll、 PBM013、 PBM014、PBM016、 PBM017、 PBM018、 PBM019、 PBM020、 PBM021、 PBM022、 PBM023、PBM025、 PBM026、 PBM027、 PBM028、 PBM030的微卫星核苷酸序列两端的引物的退火温度分别为48°C、 48°C、 53°C、 50。C、 53。C、 52。C、 56°C、 55。C、52。C、 59。C、 46°C、 55。C、 47°C、 58°C、 47°C、 50。C、 49。C、 53°C、 50。C。
所说的引物，应用于篌竹、乌芽竹、雷竹、水竹、假毛竹和桂竹6个刚竹属代表竹种微卫星的开发，通过扩增和测序确认获得了 102条含有微卫星位点的刚竹属DNA序列见表(2)。
本发明的有益效果是相对于其他微卫星的开发方法，具有简单、快速、稳定、高效和低成本等优点，为毛竹等刚竹属竹种的分子辅助育种提供了有力的工具，同时有助于竹类植物遗传学和分子生物学的进一步研究。
具体实施方式
下面对本发明作进一步详述，本发明毛竹微卫星分子标记的开发及其应用经
过下列步骤
一，毛竹序列的获得
用毛竹的拉丁学名"尸/^//0对"￡%5戶6Mcem"为关键词，在美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库(GenBank: 11 0://\￥\￥ 11(^.111111.11 1.§(^/)进行检索，把得到的巳经登录了的毛竹DNA序列以.fasta文件形式全部下载下来。二，毛竹DNA序列的筛选
利用单机版微卫星位点分析程序(MISA)和在线微卫星位点分析软件(Microsatellite Repeats Finder),对下载的DNA序列进行筛选，得到含有微卫星位点的毛竹DNA序列。三，引物设计和毛竹微卫星位点验证1，引物设计
在含有微卫星位点的DNA序列上，利用引物设计软件Primer Premier 5(PRIMIER Biosoft International, CA， USA )设计DNA聚合酶链式反应扩增引物，设计引物的大小在20个碱基左右，扩增片段长度在100-300碱基，两条引物的退火温度相差不超过4°C。当一条DNA序列中含有两个微卫星位点，且相距较远时，每个位点分别设计引物；当两个微卫星位点在同一条序列中相距较近时，引物设计时就尽量使两个位点在一对引物的扩增范围内。2，微卫星位点验证
①DNA聚合酶链式反应扩增通过PCR方法用设计好的微卫星标记引物扩增毛竹基因组DNA，扩增反应体系和程序如下反应体系为20微升，其中包括10x缓冲液2微升，MgCl2(25毫摩尔/升)1.2微升，脱氧核糖核苷酸(10毫摩尔/升)0.6微升，DNA聚合酶(5单位/微升)0.25微升，DNA模板50-100纳克，引物(25毫摩尔/升)0.5微升。聚合酶链式反应的反应程序为94。C预变性5分钟，32个循环(94。C变性40秒，各引物退火温度下复性40秒，72 。C延伸90秒)，最后72 。C延伸10分钟后4。C保存。从而获得扩增产物。各引物的退火温度详见表l。
② 电泳分离和银染检测
扩增产物中加变性缓冲液，用4%变性聚丙烯酰胺胶(厚度0.4毫米)和lxTBE电泳缓冲液，在美国C.B.S.公司生产的测序胶电泳系统中进行，预电泳30分钟后上样100瓦恒功率电泳约2小时后银染检测，银染方法过程主要如下电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盘中；加入10%醋酸，在摇床上轻微震荡30分钟进行固定，然后加入去离子水漂洗3次，每次5分钟；将凝胶置入0.1%硝酸银染色液的染色盘中，在摇床上轻微震荡30分钟，然后用去离子水漂洗10秒钟；将凝胶置入0.32%碳酸钠的显色盘中，在摇床上轻微震荡直至条带清晰以及条带数不再增加为止；加入固定液，终止显色反应，用蒸馏水漂洗几分钟；去除凝胶和玻璃板上的水珠，放在乳白光灯箱上观察并用数码相机拍照。
③ 微卫星位点的再扩增和亚克隆
根据微卫星位点的特有电泳条带特征初步判定电泳图片，并通过割胶测序进一步确认。具体的步骤是割下聚丙烯酰胺凝胶中的银染信号最强的微卫星位点上的条带置于管中，加10微升TE溶液(IO毫摩尔/升Tris-HCl， 1毫摩尔/升EDTA,pH8.0)后在PCR仪上94°C加热30分钟，然后离心取上清液作为二次PCR模板，在与上述相同的PCR反应体系和反应程序下，用各位点相对应的微卫星引物进行扩增，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行分离，对目的条带用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN)进行回收，回收产物用pMD18-T载体(TAKARA)进行16。C过夜连接，转化ToplO感受态细胞(TAKARA)后进行亚克隆，最后挑取阳性克隆培养，用质粒提取用试剂盒(QIAGENPlasmidMiniKit，QIAGEN)提取质粒后进行测序。 测序确认
将上述所得的质粒，用测序试剂盒(BigDye Terminator v3.1 Cycle SequencingKit, ABI)在96孔PCR板上做测序PCR反应。反应体系为20微升，包括质粒DNA， 1微升(200纳克)；BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction mix, 1微升；5x测序缓冲液，4微升；测序引物(20微摩尔/升)，l微升；灭菌去离子水，13微升。反应条件为96°C 1分钟，25个循环(96。C 10秒，50°C 5秒，60°C 4分钟)，最后4°C保温。
PCR反应结束后用酒精/EDTA/NaAc法对测序产物进行纯化。具体的步骤如下每个反应管中加入2微升的125毫摩尔/微升EDTA、 2微升的3毫摩尔微升NaAe和50微升100%酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；3,000个离心力离心30分钟后倒置96孔板，离心至185个离心力时停止离心；每管加入70微升的70%酒精，1,500个离心力4°C下离心15分钟后倒置96孔板，离心至185个离心力时停止离心；重复1，500个离心力下的离心过程1次；室温挥发净酒精，加入10微升去离子甲酰胺溶解DNA;溶解后的样品在95°C变性4分钟，迅速置冰中冷却4分钟后，上样，在ABI公司出产的测序仪(ABI3100AvantGenetic Analyzer)上领J序。
四，毛竹微卫星分子标记在刚竹属其他竹种的应用
通过PCR方法用毛竹微卫星标记引物扩增刚竹属其他6个竹种基因组DNA、电泳分离与银染检测、微卫星位点的再扩增与亚克隆、测序确认等步骤，具体方法如上述三2。
8表1毛竹微卫星分子标记DNA聚合酶链式反应扩增引物及其退火温度
编号3'引物序列5'引物序列退火温度 (°c)
PBM002ATGGAGCATTCATTTGAGTTGACAAGTTTGGAGGGT48
PBM004CGATGAAGTTGCCTGTGGTCAAGTCGCATTGGAGTA48
PBM007CTCGAGGTGAAGTTACATTATCGTAGAGCA.CTATCCATTT53
PBM011TAAAGAAGTATAATGTATTCGAGCTGTTTTAGCATCTATGTT50
PBM013TTTTACTAACGTGCCCGTATTGGAGGATCGCTGGATTGG53
PBM014GCCGTCCAAACGCTCCTTCACCCATCCATCTTATGCTAT52
CCCACAGAAGGTCGCACTACCGCCGAGAACGTCTACAT56
PBM017TATGCCTCCAATAATCCGAAGGCGTAGCCACCGAAT55
PBM018GACGACGAGTGTAACGCTGAGAGGATGATGCCGGTGAGG52
PBM019TCCTAGCCCTACCCTGTCCCACGGTGCTCGCTTAAATAG59
PBM020TCGCATCTAAACAACATCGAGAAGAAGAAAGGAGGA46
PBM021AGGGTGTTATTTGCTATTGTAAATCCGACGCTGGAGGC55
PBM022AAAGATGTTGCCTTGTTCGTGCATGTCTATTCCCTC47
PBM023TTTCATGGAGGGCGACAGGCCGACCAGGAAACAAACGAA58
PBM025GTTGTGCCCAGCACTTTATGACGCCACTCATTTCTT47
PBM026CTATCATCAAATGTGCCTCAACCGAGCCTCACTTTCTGC50
PBM027AAAGCAACCACGCCATTATCGGAGGAGAAGGAGAAG49
PBM028CAGGTAGTCGTCTTATCGAGTATAAGTCAATTTCGAATGAA53
PBM030GTTGCCCGTGGTTACTGTCGTGAGCCATCTGAGTTT50表2:毛竹微卫星分子标记的开发与应用基因序列表
〈110〉浙江林学院
<120>毛竹微卫星分子标记的开发与应用 〈130〉植物DNA分子遗传标记技术
〈歸 102
<170> Patentln version 3. 1
〈210〉 1
<211> 209
<212> 隱
<213> Phyllostachys kwangsiensis <220〉
<221〉 repeat—region
<222> 卿 . (78) <223〉
〈400〉 1
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cacgaacaat atatatatgg acacccgttt cgtactcccg ggagtatgta ctcccacttc 120
cgatatacca gttaaacgca catattatac ttctttatca tttttagtat acttaaatac 180
caattataag atactccaat gcgacttga 209
〈210〉 2
〈211〉 291
<212> DNA
<213> Phyllostachys nidulaxia <220〉
〈221〉 repeat—region
<222> (69) . (80) <223>
<220>
<221〉 repeat—region
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<220>
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〈400〉 2 Cg3tg卿tt gCCtgtggCtactgtctcatcctcacgacc acccgaaagt ggctggggga60
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〈220〉
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<223>
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〈400〉 5
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〈210> 6
〈211> 225
〈212〉 DNA
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<210> 8
<211〉 278
<212> 讓
<213> Phyllostachys heteroclada 〈220〉
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〈213〉 Phyilostachys heteroclada 〈220>
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<400〉 9
cgatgaagtt gcctgtggct actgtctcat ccttctcatg ctgcgtggat gacccctcga 60aagtggctga gggactacga acaatatata tatatatata tgacgctcgt ttcgtactcc 120 cgggagtacg tactcccact tcgaata/tac cacttaaacg aatata/ttat acttctttat 180 cactttcagt atacttaaat accaattata agatactcca atgcgacttg a 231
<210〉 10
<211> 211 〈212〉腿
〈213> Phyllostachys heteroclada <220〉
<221〉 repeat—region
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<400〉 10
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〈210〉 11
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<213〉 Phyllostachys praecox <220〉
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〈220〉
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<400〉 11
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〈210〉 12
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〈400〉 12
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taaagaagta taatgtattc gtttccaagt ggtatattgg aagtgggagt acatactccc 60
aagagtacga aacaggcgtc ctacatatat atatatatat atatatatat atatatatgt 120
atatatateit atatatatat atatatatat atatatatag acacgacatg attgattgat 180
tgattgtcaa gcctaaaaat gtttgactaa catagatgct aaaacagct 229
<210〉 19
〈211〉 161
<212〉 隠
<213〉 Phyllostachys atrovaginata
〈220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (120).. (129) <223〉
<400> 19
ttttactaac gtgcccgtat ttaggatggt tttgctgatg tgtcacgcag acagacggat 60
gtggcgctcc tagacatctc ctcacatcac gttttcttct tcacatcacc ttttcttccc 120
atctctctct attcctctat ccccaatgcc agcgatcctc c 161
<210〉 20
<211> 163
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys nidularia
<220>
<221> repeat_region
<222〉 (122)..(131) <223〉
<400> 20
ttttactaac gtgcccgtat ttagggtggt ttcgctgatg tgtcacgctg tgaggcggac 60
gtggcgctcc tagtcgtctc ctcacatcat gttttcttcc tcacatcacc ttttcttccc 120
atctctctct ctattcctgt atccccaatg ccagcgatcc tcc 163
<210〉 21<211〉 162
<212〉 DNA
〈213〉 Phyllostachys heteroclada <220〉
〈221> repeat—region
<222〉 (122).. (129) <223>
<400〉 21
ttttactaac gtgcccgtat ttaggatggt tttactgatg tgtcacgctg acagacggat 60
gtggcgctcc tagtcatctc ctcacatcac gttttcttct tcacatcacc ttttcttccc 120
atctctctct atttcctcta tccccaatgc cagcgatcct cc 162
<210〉 22
<211> 171
〈212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys bambusoides <220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (122).. (129) <223〉
<400〉 22
ttttactaac gtgcccgtat ttagggtggt tttgctgatg tgtcacgctg tcaggcggac 60
gtggcgctcc tagtcatctc ctcacatcat gttttcttcc "tcacatcacc ttttcttccc 120
atctctctct ctctctctct attcctctat ccccaatgcc agcgatcctc c 171
<210〉 23
<211〉 292
<212〉 腿
<213〉 Phyllostachys heteroclada <220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (27) . (46) <223〉<220>
〈221〉 repeat—region
〈222〉 (176)..(187) 〈223〉
〈400〉 23 gccgtccaaacgctccttcttctgaactctctctctctctctctctcagc tcttcctcct60
cagctcgccgtcgccgtcgcctgatcgttcaccgcttcgcttcacaggga tcagtgctgt120
gacagttgctgtgtgg33Ctcttgttttagtgttgtatccacatttatga tgtatcatca180
tcatcatcttcttttttgaagtatttgtttttctttcttgtgcttgatat ggtatggcaa240
agttga卿ggc郷cagtg犯caa犯gtatstagcat犯g3tgg6ltggg tg292
<210> 24
<211〉 244
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys heteroclada <220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (27).. (34) 〈223〉
<400〉 24
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct ctctcggctc ttcctcctct gctcgccgtc 60
gccggatcgt tcaccgcttc gcctcgcagg gatcagtgat gtgatagtag ttgctgtgtg 120
gaactcttgt tttagtgttg tatccacatg tatttgaagt ctttgttttt "tctttcctgt 180
gtttcatatg gtattgcaaa gttgaaggga csgacagaag tacatagcat aagatggatg 240
ggtg 244
<210〉 25
<211> 283
<212〉 ■
<213> Phyllostachys bambusoides 〈220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (27).. (40)〈223〉
〈220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (170).. (178) <223〉
<400〉 25
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct gtcgccgtcg cctgertcgtt caccgcttcg tgtgtggaac tcttgtttta gtcttgtatc tcttttttta agtatttgtt tttctttctt ggcagacagt gaacaaaagt atatagcata
ctctctctct cagctcttcc tcagctcgcc 60
cttcacaggg atcagtgctg tgacagttgc 120
cacatttatg atgtattatc atcatcatct 180
gtgcttgata tggtatggca aagttgaaga 240
卿tggatgg gtg 283
〈210〉 26
<211> 244
<212〉 DNA
<213〉 Phyilostachys b咖busoides
<220〉
<221〉 repeat_region
〈222〉 (27) . (34) <223〉
<400〉 26
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct gccggatcgt tcaccgcttc gcctcacagg gaactcttgt tttagtgttg tatccacatg gtttcatatg gtattgcaaa gttgaeiggga ggtg
<210〉 27 <211〉 274 <212> DNA
<213〉 Phyllostachys atrovaginata
ctctcggccc ttcctcctct gctcgccgtc gatcagtgat gtgatagtag ttgctgtgtg tatttgaagt ctttgttttt tctttcctgt cagacagaag tacatagcat aagatggatg
60 120 180 240 244
<220>
<221〉 repeat—region<222> (27)..(40) <223〉
〈220〉
<221> repeat—region <222> (158),.(169) 〈223>
〈400〉 27
gccgtccaaa cgctccttct gcctgatcgt tcaccgcttc ctcttgtttt agtgttgtac aagtatttgt ttttctttct tgaacaaaag tatatagCELt
tctgaactct ctctctctct gcttcacagg gatcagtgct ccacatttat gatgtatcat tgtgcttgat atggtatggc aagatggatg ggtg
<210〉 28
〈211〉 244 <212〉腿
<213> Phyllostachys atrovaginata
cccagctcgc cgtcgccgtc gtgacagttg ctgtgcggaa catcatcatc ctctttttta asagttgasg aggc3gac3g
60 120 180 240 274
<220>
<221〉 repeat—region
<222> (27).. (34) <223〉
<400〉 28
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct ctctcggccc gccggatcgt tcaccgcttc gcctcacagg gatcagtgat gaactcttgt tttagtgttg tatccacatg tatttgaagt gtttcatatg gtattgcaaa gttgaaggga cagacagaag ggtg
ttcctcctct gctcgccgtc gtgatagtag ttgctgtgtg ctttgttttt tctttcctgt tacatagcat a3gatggatg
60 120 180 240 244
〈210〉 29
<211〉 274
<212〉 DNA
<213〉 Phyilostachys praecox
<220〉<221〉 repeat—region 〈222〉 (27).. (42) 〈223〉
<220>
<221> repeat—region 〈222> (161)..(169) <223>
〈400〉 29
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct ctctctctct
gcctgatcgt tcaccgcttc gcttcacagg gatcagtact
ctcttgtttt agtgttgtat ccacatttat gatgtattac
aagtatttgt ttttctctct tgtgcttgat atggtatggc
tgaacei3犯g tatatsgc3t aagatggatg ggtg
ctcagctcgc cgtcgccgtc gtgacagttg ctgtgtggaa catcatcatc ttcttttttg aaagttgaag aggcagatag
60 120 180 240 274
〈210〉 30
<211> 244
<212> DNA
<213〉 Phyllostachys praecox
<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (27),. (34) <223〉
<400〉 30
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct gccggatcgt tcaccgcttc gcctcacagg gaactcttgt tttagtgttg tatccacatg gtttcatatg gtattgcaaa gttgaaggga ggtg
<210〉 31 <211> 316 <212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys nidularia
ctctcggctt ttcctcctct gctcgccgtc
gatcagtgst gtgatsgt3g ttgctgtgtg
tatttgaagt ctttgttttt tctttcctgc
cagacagaag tacatagcat aagatggatg
60 120 180 240 244〈220〉
<221〉 repeat—region
〈222〉 (27) .(68) <223〉
<220>
〈221> repeat—region <222> (201).. (212) 〈223〉
<400〉 31 gccgtccaaacgctccttcttctgaactctctctctctct ctctctctctctctctctct60
ctctctctcagctcttcctcctcagctcgccgtcgccgtc gcctgatcgctcaccgcttc120
gcttcacagggatcagtgctgtgacagttgctgtgtggaa ctcttgttttagtgttttat180
ccacatttatgatgtattatcatcatcatcatcttctttt tgaagtatttgtttttcttt240
cttgtgcttgatatggtatggcaaagttgaa^ggca>gac agtg幼caaa agtatstagc300
3t犯geitggELtgggtg316
<210〉 32
<211〉 298
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys nidularia <220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (27)..(50) <223〉
<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (180).. (194) <223〉
<400〉 32
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct ctctctctct ctctctctct cagctcttcc 60
tcctcagctc gccgtcgccg tcgcctgatc gttcaccgct tcgcttcaca gggatcagtg 120
ctgtgacagt tgctgtgtgg aactcttgtt ttagtgttgt atccacattt atgatgtatc 180
atcatcatca tcatcttctt tttgaagtat ttgtttttct ttcttatgct tgatatggta 240tggcaaagtt gaagaggcag acagtgaaca aaeigtatata gcataagatg gatgggtg 298
<210> 33
〈211〉 244
<212〉 ■
<213〉 Phyllostachys nidularia
〈220〉
<221〉 repeat—region
〈222〉 (27)..(34) 〈223〉
<400〉 33
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct gccggatcgt tcaccgcttc gcctcacagg gaactcttgt tttagtgttg tacccacatg gtttcatatg gtattgcaas gttgaaggga ggtg
ctctcggctc ttcctcctct gctcgccgtc 60 gatcagtgat gtgatagtag ttgctgtgtg 120 tatttgaagt ctttgttttt tctttcctgt 180 C3gac3gaag tacat3gcat aagatggatg 240
244
<210〉 34
<211〉 294
〈212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys kwangsiensis
〈220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (69).. (78) 〈223〉
〈400〉 34 gccgtccaaacgctccttcttctg犯ctctctctctctctctctctctcagctcttcctc60
ctcetgctcgccgtcgccgtcgcctgstcgttcaccgcttcgcttcacagggatcagtgct120
gtgacggttgctgtgtggaactcttgttttagtgttgtatccacatttatgatgteittat180
catc3tcatcttcttttttgaagtatttgtttttctttcttgtgcttga/tatggtatggc240
aaagttgaagaggc卿cagtgaacaaaagtata/tagcata卿"t卿tgggtg294
<210> 35 <211〉 244<212> DNA
<213〉 Phyllostachys kwangsiensis 〈220〉
〈221> repeat—region
<222> (27).. (48) 〈223>
<220〉
<221〉 repeat—region
〈222〉 (181)..(189) <223〉
<400> 35
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct ctctcggctc ttcctcctct gctcgccgtc 60
gccggatcgt tcaccgcttc gcctcacagg gatcagtgat gtagtagtag ttgctgtgtg 120
gaactcttgt tttagtgttg tatccacatg tatttgaagt ctttgttttt tctttcctgt 180
gtttcatatg gtattgcaaa gttgaaggga cagacagaag tacatagcat aagatggatg 240
ggtg 244
<210〉 36
<211〉 104
<212> DNA
<213〉 Phyllostachys heteroclada <220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (23).. (58) <223〉
〈400〉 36
cccacagasg gtcgcactat acag3gagag agagagagag agagagagag agagagaggc 60 acaggatcgg gatggcgata ccttgatgta gacgttctcg gcgg 104
<210〉 37
<211〉 94
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys bambusoides<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (23).. (48) 〈223〉
<400> 37
cccacagaag gtcgcactat acagagagag agagagagag agagagaggc acaggatcgg 60 gatggcgata ccttgatgta gacgttctcg gcgg 94
<210〉 38
<211> 86
〈212〉 醒
〈213> Phyllostachys atrovaginata
<220〉
<221〉 repeat—region
<222> 咖..(40) 〈223〉
<400〉 38
cccacagaBg gtcgceict3t acag3gag3g 3g3g3gsgag gcacaggatc g3gatggcga 60 taccttgatg tagacgttct cggcgg 86
<210〉 39
<211〉 88
〈212〉 ■
<213〉 Phyllostachys nidularia
<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (23)..(40) <223>
<400〉 39
cccacagasg gtcgcactat acagagag3g agagagagag gggcacagga tcaggatggc 60 gataccttga tgt卿cgtt ctcggcgg 88
<210> 40〈211〉 88
〈212〉 DNA
<213〉 Phyilostachys kwangsiensis <220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (23).. (40) <223>
<400〉 40
cccacagaag gtcgcactat acag3gagag agagagagag aggcacagga tcgagatggc 60 gataccttga tgtagacgtt ctcggcgg 88
<210〉 41
<211> 126
<212> DNA
<213〉 Phyllostachys praecox
<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (66).. (73) <223〉
< 41
cccacagaag gtcgcactac agccacagcc cttacaggaa tcgtctcgca atcaagggac 60
gcactagaga gaggaaggca cacagggcgc gggacggcga taccttgatg tagacgttct 120
cggcgg 126
<210> 42
<211〉 242
<212〉 DNA
〈213> Phyllostachys heteroclada
〈220〉
<221〉 repeat_region <222> (93).. (119) <223>〈400> 42
tatgcctcca ataatccgct caacgtcata cggaggtgag gatgatcttg aacgacacct ccgcggcgcc gccgcccgcc gccatggggt cgagtggttc acctcacctc ggttgcggtt
〈210> 43 <211〉 230 <212〉 ■
<213〉 Phyllostachys heteroclada
tctattaaaa gtgacccggg agcttggggt 60 tccctcctcc tcctcctcct cctcctcctg 120 gtgggtgttg ggggaggggg gtcg卿cgc 180 tgcgtgatcg atagattcgg tggctacgcc 240
242
<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (92)..(112) 〈223〉
<400> 43
tatgcctcca ataatccgct caacgtcata ggaggtg3gg atgatcttga scgacacctt gccgccacct gccgccatgg agtgtgggtg ctcgcctcgg tcacggtttg cgtgatcgat
<210> 44
<211〉 240
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys bambusoides
gct3ttaasa gtg犯gggga gcttggggtc 60
ccctcctcct cctcctcctc ctaccgcgcc 120
ttgggggggt cgagacgccg agtggttcgc 180
agattcggtg gctacgcctt 230
<220〉
<221> repeat—region
<222〉 (92)..(118) <223〉
<400〉 44
tatgcctcca ataatccgct caacgtcaca gctattaaaa gtgaagggga gcttggggtc 60
ggaggtgagg atgatcttga acgacacctt ccctcctcct cctcctcctc ctcctcctcc 120
cgccgcggtg tcgtcgccgc catggggtgt gggtgttgag gggggggggt cgagacgccg 180
agtggttcgc ctcgcctcgg tcgcggtttg cgtgatcgat agattcggtg gctacgcctt 240
30〈210> 45
〈211> 245 <212>腿
〈213> Phyllostachys atrovaginata 〈220>
〈221> repeat—region
<222> (93).. (112) 〈223>
〈400〉 45
tatgcctcca ataatccgct caacgtcata gctattaaaa gtgaagcggg agcttggggt 60
cggaggtaag gatgatcttg aacgacacct tccctcctcc tcctcctcct cctcctcctc 120
ctgccgcggc gccgccgccc gccgccatgg ggtgtgggtg ttgggggagg ggggtcgaga 180
cgccgagtgg ttcacctcac ctcggttgcg gtttgcgtga tcgatagatt cggtggctac 240
gcctt 245
<210> 46
〈211〉 230
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys nidularia <220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (92).. (112) <223>
<400> 46
tatgcctcca ataatccgct caacgtcaca tctattaaaa gtgaagggga gcttggggtc 60
ggaggtgagg atgatcttga acgacacctt ccctcctcct cctcctcctc ctaccgcgcc 120
gccgccacct gccgccatgg agtgtgggtg ttgggggggt cgagacgccg agtggttcgc 180
ctcgcctcgg tcacggtttg cgtgatcgat agattcggtg gctacgcctt 230
<210> 47
〈211〉 285
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys heteroclada<220>
〈221> repeat—region 〈222> (244).. (252) 〈223>
〈400〉 47 gacgacgagt gt幼cgctgagaagtcctcaaaatcccctctaggtcagtc atgctctcca60
tcagtgc3gs catcctattstgagtttcctcaaagaaatcattctgaatt tgctccatct120
caagtaatct gcctcaagtctcattctgaaattcaacttgttcggccttg atttcttgca180
aagagctaag aatgagctgctgattttgaagaatctgtgc240
catcagcagc agtagcaacagcaggaacctcaccggcatcatcct285
<210〉48
〈211〉285
〈212〉DNA
〈213>Phyllostachys bambusoides
〈220〉
<221〉repeat—region
<222〉(244) . (252)
〈223〉
<400〉 48 gacgacgagt gt肌cgctgaggggtcctcaaactctctgcc犯gtca/tga aagctctcca60
tcagggcagg catcctgttatgagactcatcgaagaaatcattttgagtt cgctccatct120
cacgtaatct gcctcgagtctcactctgaaattcagcttgttcagccttg atttcttgca180
aagagctaag tatgagttgctgattctg幼gaatctatgcaagagtgcta> tcagcaggag240
catcaacagc agtagcaateigcaggagcctcaccggcatcatcct285
<210> 49
<211> 285
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys atrovaginata <220〉
<221〉 repeat—region
〈222〉 (244).. (252) <223><400> 49 gacgscg3gtgtaacgctgaggagtcctca aaatcccctc taggtcactcatgctctcca60
tC3gtgC3g3catcct3tt3tgagtttcctcaaaga犯tc eittctg犯tttgctccatct120
c犯gt犯tctacctcgagtctcattctgaa attcaacttg ttcagccttg atttcttgca180
aagagctaagaatgagctgctgattttgaa gaatctatgc aagagtgcta tcagtaggaa240
catcagcagca^gtagc肪c3gcaggaacctcaccggcatc atcct285
〈210>50
〈211〉285
〈212〉DNA
〈213〉Phyllostachys praecox
<220〉
〈221>repeat—region
〈222〉(244) . (252)
〈223〉
<400〉 50 gacgscgagtgtaacgctgaggagtcctcaaaatcccctc t犯gtcagtcatgctctcca60
tcagtgcagacatcctattatgagtttcctcagagaaatc attctgaatttgctctatct120
caagtaatcttcctcgagtctcattctg犯attcagcttg ttcagtcttgatttcttgca180
犯tgagctgctgattttg犯gaatctatgc aagagtactatC3gC3gg肪240
cat卿cagcgceiggagcctcaccggcatc atcct285
<210〉51
<211〉285
<212〉DNA
<213〉Phyllostachys nidularia
<220〉
<221〉repeat—region
〈222〉(244),. (252)
<223〉
〈400〉 51 gacgacgagtgtaacgctgeiggagtcctcaaaatcccctc taggtcagtcatgctctcca60
ttagtgcagacatcctattatgagtttcctc犯eigaaatc aittctg犯tttgctccatct120
caagt犯tctgcctcgagtctcattctg犯attcaacttg ttcagccttgatttcttgca180aagagctaag aatgagctgc tgattttgaa gaatctgtgc aagagtgcta tcagtaggaa 240 catcagcagc agtagcaaca gcaggaacct caccggcatc atcct 285
<210> 52
〈211> 285
〈212> DNA
<213> Phyllostachys bambusoides 〈220>
<221> repeat—region
<222〉 (244)..(252) 〈223>
〈400〉 52
gacgacgagt gtaacgctga ggggtcctca aactctctgc caagtcatga aagctctcca 60
tcagggcaga catcctgtta tgagactcat cgaagaaatc attctgagtt cgctccatct 120
cacgtaatct gccttgagtc tcactctgaa attcagcttg ttcagccttg atttcttgca 180
aagagcteiag aatgagttgc tgattctgaa gaatctgtgc aagagtgcta tcagcaggag 240
catcagcagc agtagcaata gcaggagcct caccggcatc atcct 285
<210> 53
〈211〉 189
<212〉 DNA
〈213> Phyllostachys heteroclada <220〉
〈221〉 repeat—region
〈222〉 (141).. (155) <223〉
〈400〉 53
tcctagccct accctgtccc cttttcggtc acgccgcccg tccctgcctc cgccgcgccc 60
gagcgccccc tttttctgcc ccttctccgt ggatctcgcc gcttctcgtc gcccgccatt 120
aaggccaccg cggcaagcct ctccctcctc ctcctccggc ccccctagcc tatttaagcg 180
3gC3CCgtg 189
<210〉 54 <211〉 202〈212> 腿
〈213〉 Phyllostachys bambusoides
〈220>
〈221〉 repeat—region 〈222> (154)..(165) 〈223>
<400〉 54 tcctagccct
ctgccgcttc
agccgccatt
gcctatttaa
accctgtccc gtctccaccg cggcgtcacc gcccatgcct tggcaccgcg ccatacctcc aatggccgac tcgactgcca tgcctcctcc
gCg3gC3CCg tg
tcccgcctcc gccgcactcg tccccatgcc gcgcgggtca tcctcctggg caccccagtc
60 120 180 202
〈210> 55
〈211〉 191
〈212〉 腿
<213〉 Phyllostachys atrovaginata
<220〉
<221〉 repeat—region
<222> (138).. (152) <223〉
<400> 55 tcctagccct
tgcgccctct
aaagccgacc
cgagcaccgt
accctgtccc gtctcccccg tgccatccgt ttttctcctc ttccccgcgc ggtcaagccg tccacctctc ctcctcctcc tcctttgggt
ccccgcctcc gtcgcgcccg gacccccccc acccgccatt ctccctgggg cctatttaag
60 120 180 191
<210〉 56
<211〉 193
<212〉 DM
<213> Phyllostachys nidularia
<220〉
<221〉 repeat—region <222〉 (146).. (157)〈223>
<400> 56
tcctagccct accctgtccc actttcggtc acgccgctca tccccgcctc cgccgcgccc gtgcaccccc cctttttgcc ccttcgccgc gattctcgcc gcttctcgcg gcccgccatt aaagccggtg cgacaacctc tccccctcct cctcctctgg gcctccccga gccctattta agcgagcacc gtg
〈210〉 57
〈211> 189
〈212> 腿
<213〉 Phyllostachys kwangsiensis
60 120 180 193
<220>
〈221〉 repeat—region
〈222〉 (142). .(153) <223>
<400〉 57
tcctagccct accctgtccc cttttcggtc gcgcgccccg cttttcccac actccacgcg agccgacctc cacctttccc cctcctcctc agcaccgtg
gcgcagcccg tcctcgcctc cgccgcagcc 60 gtaaagcctg cacccgccgc tcgccattaa 120 ctccgggtct ccctggggcc tatttaagcg 180
189
<210> 58
<211〉 117
<212〉 DNA
<213> Phyllostachys heteroclada
<220〉
<221> repeat—region
<222〉 (89).. (100) <223>
<400〉 58
tcgcatct犯acaacstcaa aacagcgggg a犯tg犯ttg atscccttgg agscgcgtgei 60 aacgctgaac aaaaacccac gaagatgatc ttcttcttct cctcctttct tcttctc 117
〈210> 59〈211> 117
<212> DNA
<213> Phyllostachys bambusoides <220>
<221> repeat—region
〈222> (89).. (100) 〈223>
<400> 59
tcgcatctaa acaacatcaa aacagcgggg aaatgaattg atacccttgg agacgcgtga 60 aacgctgaac aaaaacccac gaagatgatc ttcttcttct cctcctttct tcttctc 117
〈210> 60
〈211> 117
<212〉 DNA
〈213〉 Phyllostachys atrovaginata <220>
〈221> repeat—region
〈222〉 (89)..(100) <223>
<400〉 60
tcgcatctaa acaacatcaa ascagcgggg aaacgsattg atacccttgg agatgcatga 60 aacgctgaac aaaaacccac gaagatgata ttcttcttct cctcctttct tcttctc 117
<210> 61
〈211〉 117
<212〉 DNA
<213〉 Phyilostachys praecox <220〉
<221> repeat—region
<222> 卿 . (100) <223〉
〈400> 61
tcgcatctaa acaacatcaa aacagcgggg aaacgaatgg atacccttgg agacgcgtga 60
37aacgctgaac aaaaacccat gaagatgatc ttcttcttct cctcctttct tcttctc 117
<210> 62
<211> 117
<212> DNA
〈213> Phyllostachys nidulaxia 〈220>
〈221> repeat—region
<222> (89)..(100) 〈223>
〈400> 62
tcgcatctaa acaacatcaa aacagcgggg aaacaaattg atacccttgg agatgcgtga 60 aacgctgaac aaaaacccac gaagatgatc ttcttcttct cctcctttct tcttctc 117
〈210〉 63
<211> 117 〈212>腿
〈213> Phyllostachys kwangsiensis 〈220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (89).. (100) 〈223〉
〈400〉 63
tcgcatctaa acaacatcaa aacagcgggg aaataaattg atacccttgg agatgcgtga 60 Eiacgctgaac aaaaacccac gaagatgatc ttcttcttct cctcctttct tcttctc 117
<210〉 64
<211〉 301
<212〉 DNA
<213> Phyllostachys heteroclada <220>
<221〉 repeat—region
〈222> (147)..(155)<223〉
〈400> 64 3gggtgtt3tttgctattgtccaaccttgccacatgttat atattggcct ttggcccatt60
ggaatsgatc3gatgt3ttattctaacatggtatcagagc catgg朋eicc ctaeitcatag120
犯3CCCt3CCtccttgaccaacaaccgccgccgccactgc ccccgcgcca agcctcctac180
tgctcttctcttccttggaaccggtcta^gccacccgagt gccgcctcca tccgagcagc240
tg鄉tcgtgcggcgcctctacctgagcgccgcctccacg tcggcctcca gcgtcggatt300
t301
<210〉 65
〈211〉 279
〈212〉 DNA
〈213> Phyllostachys bambusoides 〈220〉
〈221> repeat—region
<222> (140)..(151) 〈223>
〈400> 65
agggtgttat ttgctattgt ccaaccttgt acatattata tattggcctt tggcccattg 60
gaatagacaa gatgctttat tccaaacatg gtatcagagc catagaaacc ctaaccatga 120
aaaccctacc tcttgaccag ccgccgccgc cgctgtcctg ttgctcctct ccccccagat 180
ccgcgcctga tttttggtgt cgagctctta. ccgtgccggc ctccttctcc gtcggccttc 240
atccgagcag gcccgagcgt cgcctccagc gtcggattt 279
〈210> 66
〈211〉 264
<212〉 DNA
<213> Phyllostachys atrovaginata <220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (160).. (171) <223〉
<400> 66
agggtgttat ttgctattgt gtttaacctt gtacatgtta tatattggcc tttggcccat 60
39tagaatacac aagatgcttt attccaaata tggtatcaga gctatagaaa ccctagccat 120
agaaacccta cctcttagcc aacagctgct accactgtag ccgccgccgc cattgcacat 180
cagcgtgcgg ccgcgcgcgc ccacaccagc ctctgctcac ggctcctctc cgccgcctcc 240
acatcggcct ccagcgtcgg attt 264
〈210〉 67
〈211> 331
<212> DNA
〈213> Phyllostachys praecox <220>
<221> repeat—region
<222> (145).. (153) <223>
<400> 67
鄉gtgttatttgctattgtccaatcttgt acatgttata tetctagcctt tgacctattg60
gatgcattattccaactggt atcggagtca tggaaaccct agctatagaa120
accctacctccttgaccaaccaccgccgcc gccaccatcc ctgcgccgag cttcttcccg180
ctgctcttctctctctcggattcgtgccaa cccgagcgcc gcctcctcaa ctccagccag240
cgtttgctccgcgcctctagcgacgcctcc acgccggcct cccgcgccag attcacaccg300
gcgcctgctccatgcctccagcgtcggatt t331
〈210> 68
〈211〉 146
<212〉 DNA
<213> Phyllostachys heteroclada <220〉
<221〉 repeat—region
<222> (77).. (92) <223〉
<400〉 68
aaagatgttg ccttgttcat aaatgttgta tgttcaatta ttcactgtac ttgctgagtc 60
tcggactcat tcttgctttg tttgtttgtt tgtttatttt aggtgatcgt tgatgatggc 120
tctattggga gggaatagac atgcac 146〈210> 69
<211> 146
<212〉 腿
<213> Phyllostachys bambusoides 〈220〉
〈221> repeat—region
<222> (77)..(92) 〈223>
<400> 69
aaagatgttg ccttgttcat aattgttgta tgttcaatta ttcactgtac ttgctgagtc 60
tcggactcat tcttgctttg tttgtttgtt tgtttatttt aggtgatcgt tgatgagggc 120
tctattggga gggaatagac atgcac 146
<210> 70
<211> 146
<212〉 DNA
〈213〉 Phyllostachys atrovagirmta <220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (77).. (92) <223〉
<400〉 70
aaagatgttg ccttgttcat aatggtcgta tgctcaatta ttcactgtac ttgctgagtc 60
tcggactcat tcttgctttg tttgtttgtt tgtttatttt aggtgatcgt tgatgatggc 120
tctattggga gggaatagac atgcac 146
〈210〉 71
<211〉 146
〈212〉 腿
<213> Phyllostachys praecox <220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (77)..卿〈223>
<400> 71
aaagatgttg ccttgttcat aattgttgta agttcaatta ttcactgtac ttgctgagtc 60
tcggactcat tcttgctttg tttgtttgtt tgtttatttt aggtgatcgt tgacgacggc 120
tctattggga gggaatagac atgcac 146
〈210> 72
<211> 146
〈212〉 DNA
〈213> Phyilostachys nidularia
<220〉
〈221> repeat—region
<222> (77)..卿 <223>
<400〉 72
aaagatgttg ccttgttcat aattgttgta agttcaatta ttcattgtac ttgctgagtc 60
tcgaactcat tcttgctttg tttgtttgtt tgtttatttt aggtgatcgt tgatgatggc 120
tctattggga gggaatagac atgcac 146
<210〉 73
〈211〉 138
<212〉 DNA
<213> Phyllostachys kwangsiensis
<220〉
<221〉 repeat—region
<222> (77).. (88) <223>
<400> 73
aaagatgttg ccttgttcat aattgttgta tgttcaatta ttcactgtac ttgctaagtc 60
tcggactcert tcttgctttg tttgtttgtt ttaggtgatc gttgatgatg gctctattgg 120
gagggaatag acatgcac 138
<210> 74 <211> 208〈212>腿
<213> Phyllostachys heteroclada <220>
<221> repeat—region
〈222〉 (98)..(112) 〈223>
〈400> 74
tttcatggag ggcgacaggg tgctcgccta ccacggcccc ctcctctacg aggccaaggt 60
tccctttctc ctcacttgct tcctccgttc aattcaattc cgttccgttc cgttccaatc 120
tagggttatt attacatgta ttggcattcc cctccggatg gccatgtcga atcgattctt 180
cctagctttc gtttgtttcc tggtcggc 208
<210> 75
〈211> 208
〈212〉 DNA
〈213〉 Phyllostachys bambusoides 〈220〉
〈221> repeat—region
〈222〉 (98).. (112) <223〉
<400> 75
tttcatggag ggcgacaggg tgctcgccta ccacggcccc ctcctctacg aggccaaggt 60
tccctttctc ctcacttgcc tcctccgttc aattcaattc cgttccgttc cgttccaatc 120
tagggttatt attacatgta ttggcattcc cctccggatg gccatgtcga atcgattctt 180
cctagctttc gtttgtttcc tggtcggc 208
<210> 76
<211〉 208
<212> DNA
<213> Phyllostachys atrovaginata <220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (98)..(112)
43<223>
<400> 76
tttcatggag ggcgacaggg tgctcgccta ccacggcccc ctcctctacg aggccaaggt 60
tccctttctc ctcacttgct tcctccgttc aattcaattc cgttccgttc cgttccaatc 120
tagggttatt attacatgta ttggcattcc cctccggatg gccatgtcga atcgattctt 180
cctagctttc gtttgtttcc tggtcggc 208
〈210> 77
〈211〉 208
<212> ■
<213> Phyilostachys praecox
〈220〉
〈221> repeat—region
〈222〉 (98). .(112) <223>
〈400〉 77
tttcatggag ggcgacaggg tgctcgccta ccacggcccc ctcctctacg aggccaaggt 60
tccctttctc ctcacttgct tcctccgttc aattcaattc cgttccgttc cgttccaatc 120
tagggttatt attacatgta ttggcattcc cctccggatg gccatgtcga atcgattctt 180
cctagctttc gtttgtttcc tggtcggc 208
<210> 78
<211〉 208
<212> ■
<213〉 Phyllostachys nidularia
<220>
<221〉 repeat—region
〈222〉 (98).. (112) <223〉
<400〉 78
tttcEitggag ggcgacaggg tgctcgccta ccacggcccc ctcctctacg aggccaaggt 60
tccctttctc ctcacttgct tcctccgttc aattcaattc cgttccgttc cgttccaatc 120
t鄉gttatt attacatgta ttggcattcc cctccggatg gccatgtcga atcgattctt 180
cctagctttc gtttgtttcc tggtcggc 208
44<210> 79<211> 208〈212> DNA<213> Phyllostachys kwangsiensis 〈220><221〉 repeat—region<222> (98)..(112) <223>〈400> 79 tttca_tgg￡tg ggcgac鄉gaactcgcctaccacggcccc ctcctctacg aggccaaggt60tccctttctc ctcactggaatcctccgttcaattcaattc cgttccgttc cgttccaatc120tagggttatt attacatgtattggcattcccctccggatg gccatgtcga atcgattctt180cctagctttc gtttgtttcctggtcggc208<210〉80<211〉281<212>DNA<213〉Phyilostachys heteroclada<220〉<221>repeat—region<222〉(231).. (255)<223〉<400〉 80 gttgtgccca gcactttagaagaaggttsgc鄉ggcagg caaccaatta gsgggsttga60gagagaatag agattgaataattgcatgac tttctaagca tgatcttgta120tgtcttccat ttatttgctgcatgtttttagttttttgta ggagcttact tgattacgtt180atattacatt tttctatgagcttacttgattacgctatat aaattgattt atttcatttc240atttcatttc atttcaggacaccaagaaatgagtggcgtc a281<210> 81〈211〉 281<212> DNA<213> Phyllostachys bambusoides〈220><221> repeat—region <222> (231)..(255) <223〉〈柳> 81gttgtgccca gcactttag3 ag3aggttag caagggcsgg ctacccctta gagggattgg 60aagagaatag agattgaata aaataaccaa attgcatgat tttctaagca tgatcttgta 120tgtcttccat ttatttgctg catgttttta gttttttgta ggagcttact tgattacgtt '180atattacatt tttctatgag cttacttgat tacgctatat taattgattt atttcatttc 240atttcatttc atttcaggac accaagaaat gagtggcgtc a 281〈210> 82<211> 281〈212> DNA〈213> Phyilostachys atrovaginata <220><221〉 repeat—region<222〉 (231).. (255) 〈223〉〈德82gttgtgccca gcactttaga agaaggttag caggggcagg caaagaatta gagggattgg 60gagagaatag 3gattgaata aaataactaa attgcatgat tttctaagca tgatcttgta 120tgtcttccat ttatttgctg catgttttta gttttttgta ggagcttact tgattacgtt 180atattacatt tttctatgag cttacttgat tacgcta/tat taattgattt atttcatttc 240atttcatttc atttcaggac accaagaaat gagtggcgtc a 281<210> 83<211〉 281<212> DNA<213> Phyllostachys praecox <220><221〉 repeat—region<222〉 (231).. (255)<223>〈400〉 83gttgtgccca gcactttaga agaaggttag caggggcagg caaccaatta gagggattgg 60gagagaatag agattgaata aaa/taactaa attgca/tgat tttctaagca tgatcttgta 120tgtcttccat ttatttgctg catgttttta gttttttgta ggagcttact tgattacgtt 180atattacatt tttctatgag cttacttgat tacgctatat taattgattt atttcatttc 240atttcatttc atttcaggac accaagaaat gagtggcgtc a 281〈210〉 84〈211〉 281<212> DNA〈213〉 Phyllostachys nidularia 〈220>〈221> repeat—region<222> (231),. (255) 〈223〉〈■ 84gttgtgccca gcactttaga agaaggttag caagggcagg caaccaatta gagggattgg 60gagagaatag agattgaata aaatagctaa attgcatgat tttctaagca tgatcttgta 120tgtcttccat ttatttgctg catgttttta gttttttgta ggagcttact tgattacgtt 180atattacatt tttctatgag cttacttgat tacgctatat taattgattt atttcatttc 240atttcatttc atttcaggac accaagaaat gagtggcgtc a 281<210> 85<211〉 281<212〉 ■<213> Phyllostachys kwangsiensis 〈220〉<221〉 repeat—region<222〉 (231).. (255) <223〉<400〉 85gttgtgcccB gcactttaga agaeiggttag csggggteigg caeisgastts gagggattgg 60 gagagaatag agattgaata aaataactaa attgcatgat tttctaagca tgatcttgta 120tgtcttccat ttatttgctg catgttttta attttttgta tgagcttact tgattacgtt 180 atattacatt tttctatgag cttacttggt tacgctatat taattgattt atttcatttc 240 atttcatttc atttcaggac accaagaaat gagtggcgtc a 281〈210> 86〈211〉 144〈212> DNA〈213> Phyllostachys kwangsiensis 〈220〉〈221> repeat—region〈222〉 (95).. (114) 〈223>〈400〉 86ctatcatcaa atgtgcctca atatttatgt tttctaatca cggctggggg tggataacga ta3tg3gc3g犯eigtgaggc tcgg<210〉 87<211> 268<212〉 陽<213〉 Phyllostachys heteroclada <220〉<221> repeat—region<222〉 (248).. (265) <223〉<400> 87aaagcaacca cgccattaat atactcttgg cggtccatct atgatacgca tgtaacaaat tacgtactca tcctatttac caaacatact cataaagggt tatagatcgt taccctcag3 agaatcctct ccttctcctt ctcctccg〈210〉 88 <211> 28148gaattttaaa attcaaacca ccttcccatt gccagctcgg ctcggctcgg ctcgttaagcctcacacggt tcataccgta catccagttt tagtgtcaaa ttagattaat taatcacaac taaattgatt agctattaat ttattgcaaa gctcacgacg aaaataccaa atatatcttg60 120 14460 120 180 240 268〈212> DNA〈213> Phyllostachys bambusoides<220>〈221> repeat—region <222> (259)..(276) 〈223>〈400> 88aaagcaacca cgccattaat gtactcttga ctcacacggc tcacaccgta catccagttt 60tggtccatct atacgcatgt aacaaatcag tgtcaaatta cattaataaa ccacaagtac 120aaacccttct taattattga ccaaacatac ttaaattgct tagcgattaa cctagagcaa 180atataaaggg ttaaagatcg ttaccctagg agctcacgac aaaygggcca aatatcctct 240gagatcctcg ggaatccttt ctccttctcc ttctcctccg a 281<210> 89<211> 280 <212>誰<213> Phyllostachys atrovaginata<220><221〉 repeat—region 〈222> (248).. (277) <223〉<400> 89aaagcaacca cgccattaat gtactcttga tagtccatct acgatacaca tgtaacaaat tgcgtacttt ttctatttac caaacatact tataaagggt tatagatcgt taccctcaga agaatcctct ccttctcctt ctccttctcc<210〉 90<211> 285<212〉 ■<213〉 Phyllostachys praecoxctcccacagt tcacaccgta catccagttt 60tagtgtcaaa ttagattaat taaccgcaag 120taaattgatt agagattaat ttatagcaaa 180gctcatgatg aaaataccaa atatctctcg 240ttctcctccg 280<220〉49<221> repeat—region 〈222> (253)..(261) 〈223>〈400〉 90 aaagcaacca cgccattaatatactcttgactcacacggttcac已ccgta catccaattt60cggtccatct acactacacatgcaacaaattaattagtgtcaaatteLgeit tetataaaxxa120caagtacgta ctcttcctattgaccaaacatacttatattg3ttagcgat taactta/tag180caaacateaa gggttatsgattgttacccttagagctcatgacgaaaata ctaaatatcc240ctcgagattc ctctcctcctccttctccttctccttctcctccgei285<210〉91〈211〉271<212>DNA<213>Phyllostachys nidularia<220>〈221〉repeat—region<222〉(250)., (267)<223〉<400〉 91 aaagcaacca cgccattaatgtactcttgactcacacagctctcaccgta catccagttt60tggtccatct atacgcatgttgtcaetattacattaataac ccgc肪gtac120aaactcttct taattattgattaaattgcttaacgatata acctagagca180aatataaagg gttaaagatcgttaccctcggagctcacgacaa^幼tacc 3犯tatcccg240cgagattcct ctccttctccttctcctccg3271<210> 92<211> 258<212〉 DNA<213〉 Phyllostachys kwangsiensis <220><221〉 repeat—region〈222〉 (237).. (254) <223〉<400> 92
aaagcaacca cgccattaat gtactcttga cggtccatct acgctacaca tgtaaca肪t cctatttacc aaacatactt aaattgatta atagatcgtt accctcg犯g ctcacgacgei cttctccttc tcctccga
〈210> 93
〈211〉 157
〈212〉 DNA
〈213〉 Phyllostachys heteroclada
ctcacacgat tcacaccgta aatccagttt 60 tagattaata aaccgcaagt acgtactctt 120 gcgattaatt tatagcaaac ataaagggtt 180 aaatact犯a tatctctcga gaatcctctc 240
258
〈220〉
〈221 > r印eat一reg i on
〈222〉 (102〉.. (m〉 〈223〉
〈400> 93
caggtagtcg tcttalcgag tttttcttga atttatagtt tga犯gtatt tttatgaccg ccagggtgaa ttccaatttc attcgaaatt
<210〉 94
〈211〉 157
〈212〉 纖
<213> Phyllostachys bambusoides
aattgacata gtttgattta atatcatttt 60 agctaatgag ccgagccgag ccgagccgag 120 gacttat 157
<220>
<221> repeat一region
〈222〉 (108)., (122)
〈223〉
<400> 94
caggtagtcg tcttatcgag tttttcttga atttatagtt tg犯agtatt tttatgaccg ccagggtgaa ttccaatttc attcgaaatt
aattgacata gtttgattta atatcatttt G0 agctaatgag ccgagctgag ccgagccgag 120 gacttat 157
〈210〉 95 〈211〉 157〈212> 腿
〈213> Phyllostachys atrovaginata 〈220>
〈221> repeat—region
〈222> (102).. (121)
〈223>
<400> 95
caggtagtcg tcttatcgag tttttcttga aattgacata gtttgattta atatcatttt 60
atttatagtt tgaaagtatt tttatgaccg agctaatgag ccgagccgag ccgagccgag 120
ccagggtgaa ttccaatttc attcgaaatt gacttat 157
〈210> 96
〈211〉 157
〈212〉 DNA
〈213〉 Phyllostachys praecox <220>
<221〉 repeat_region
<222〉 (108)..(122) <223>
<400> 96
caggtagtcg tcttatcgag tttttcttga aattgacata gtttgattta atatcatttt 60
atttatagtt tgaaagtatt ttt3tgaccg agctaatgag ccgagctgag ccgagccgag 120
ccagggtgaa ttccaatttc attcgaaatt gacttat 157
〈210> 97
<211〉 157
〈212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys nidularia 〈220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (102)..(121〉 〈223〉< 97
caggtagtcg tcttatcgag tttttcttga aattgacata gtttgattta atatcatttt 60
atttatagtt tgaaagtatt tttatgaccg agctaatgag ccgagccgag ccgagccgag 120
ccagggtgaa ttccaatttc attcgaaatt gacttat 157
〈210> 98
〈211> 157
〈212> DM
<213> Phyllostachys kwangsiensis 〈220〉
〈221〉 repeat—region
〈222> (102).. (121) <223>
〈婦 98
caggtagtcg tcttatcgag tttttcttga aattgacata gtttgattta atatcatttt 60
atttatagtt tgaaagtatt tttatgaccg agctaatgag ccgagctgag ccgagccgag 120
ccagggtgaa ttccaatttc attcgaaatt gacttat 157
<210> 99
<211〉 374
<212〉 DNA
〈213> Phyllostachys heteroclada <220〉
<221〉 repeat—region
<222> (122).. (127) <223〉
<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (165)..(179) <223〉
<220〉
<221〉 repeat—region 〈222〉 (208).. (213)
53〈223〉 〈400〉 99
gttgcccgtg gttactgtct catccttctc atgctgccgg ttttaatggc acaagcagcc 60
actgcttggg gctttataga gaaaagttat cacaggcggt ttcagccaca犯ccgtctat 120
gatatatact tatcacagac gattttagcc acaaaccgtc tgtgatatat acttatcaca 180
gacggttgca gccacaaacc gtctatgata tatacttatc gcagacgatt tcagccacaa 240
accgtctgtg ataggttcct atcacagacg ttttcagtta ataaccgtct gtgagagtat 300
gcatcacaga cggtttgaaa actgtctatg atgacctcat gtctttactg acccataaac 360
tcagatggct cacg 374
〈210〉 100
〈211> 255
<212〉 DNA
〈213> Phyllostachys bambusoides <220〉
<221> repeat—region
〈222〉 卿..柳 <223>
〈220〉
<221> repeat—region 〈222〉 (77)..(86) <223〉
〈400〉 100
gttgcccgtg gttactgtct catccttctc atgctgcgtg gacgatcccc ccaaagtggc 60 tgagagacta cgaacaatat atatatgatg ccggatttaa tggcacaagc agccactgct 120 tagggcttta tagagaaaag tcatcacaga cggtttgtgg ctgaaaccgt ctgtgaaagt 180 atgcatcaca gacggttcaa aactatctgt gatgacctca tgtcatcact gacccataaa 240 ctcagatggc tcacg 255
〈210> 101
<211〉 299
〈212〉 ■
<213> Phyllostachys atrovaginata〈220>
〈221> repeat—region
〈222〉 (62).. (67) <223〉
<220>
〈221> repeat—region
<222〉 (81).. (86) <223>
<400> 101 gttgcccgtg gtteictgtctcatccttctc atgctgcgtggatgattcccccaaagtggt60
tgagagacta cgaacaatacatatatgatg ccggttttaatggcac犯gcagccactgct120
tggggcttta tagagaa朋gtcatcacaga agatttcagccaca犯ccgtctatgatagg180
ttcctatcat agacggtttcagttaataac cgtctgtaaaagtatgcatcacagacggtt240
tgaaaaccgt ctgtgatgacctcsitgtcat cactgaccceitaaactcetgatggctcacg299
〈210〉102
<211〉220
〈212〉DNA
〈213〉Phyllostachys kwangsiensis
<220〉
<221>r印eat一region
〈222〉卿..(71)
<223〉
<400〉 102 gttgcccgtg gttactgtctcatcctcaca atcgcccgaaagtgactaggggacatgaac60
aata/tatata tgaagccagttttaaaggca caagcaaccactgcttggtc120
gaatacteitc acagacagtttcatccac幼actgtttgtgatagta1;gc8tctgtgatga180
tctcatgtca ttactgatctataaact卿atggctcacg220
5权利要求
1，一种毛竹微卫星分子标记的开发方法，其特征包括如下步骤(1)毛竹DNA序列的获得用毛竹的拉丁文学名作为关键词，在美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库中检索并下载获得；(2)含有微卫星DNA序列的筛选用单机版微卫星分析程序和在线微卫星位点分析软件，对下载的序列进行筛选，获得含有微卫星位点的毛竹DNA序列；(3)引物设计和微卫星位点验证①引物设计用引物设计软件设计扩增含有微卫星位点的DNA聚合酶链式反应引物，引物含有碱基数控制在18-22个，两引物退火温度差＜4℃，扩增的DNA片段在350个碱基以内；②微卫星验证利用上述引物进行DNA聚合酶链式反应扩增、扩增产物的电泳分离、银染检测、微卫星位点的再扩增、亚克隆和测序确认工作，最后得到19对毛竹微卫星标记引物，其退火温度在46℃-59℃。
2，用权利要求1所述的毛竹微卫星分子标记的开发方法，其特征是获得19 对毛竹微卫星标记的引物分别是PBM002 PBM004 PBM007 PBM011 PBM013 PBM014 PBM016 PBM017 PBM018 PBM019 PBM020 PBM021 PBM022 ATGGAGCATTCATTTGAG-3，.CGATGAAGTTGCCTGTGG-3' -CTCGAGGTGAAGTTACATTA-3， .TAAAGAAGTATAATGTATTCG-3， TTTTACTAACGTGCCCGTATT-3' .GCCGTCCAAACGCTCCTT-3，.CCCACAGAAGGTCGCACTA-3' TATGCCTCCAATAATCCG-3,.5，- TTGACAAGTTTGGAGGGT-3' 5，- TCAAGTCGCATTGGAGTA-3' 5， - TCGTAGAGCACTATCCATTT-3， 5 ，- AGCTGTTTTAGCATCTATGTT-3 ， 5'- GGAGGATCGCTGGATTGG-3' 5，- CACCCATCCATCTTATGCTAT-3' 5，- CCGCCGAGAACGTCTACAT-3' 5，- AAGGCGTAGCCACCGAAT-3'，-GACGACGAGTGTAACGCTGAG-3， 5，- AGGATGATGCCGGTGAGG-3'.5，- TCCTAGCCCTACCCTGTCC-3， 5，- TCGCATCTAAACAACATC-3， 5，- AGGGTGTTATTTGCTATTGT-3， 5 ，- AAAGATGTTGCCTTGTTC-3'.5,隱CACGGTGCTCGCTTAAATAG-3' ;，-GAGAAGAAGAAAGGAGGA-3' 5，- AAATCCGACGCTGGAGGC-3， 5，- GTGCATGTCTATTCCCTC-3'PBM023: 5 ，- TTTCATGGAGGGCGACAG-3' 5 ， - GCCGACCAGGAAACAAACGAA-3' PBM025: 5，- GTTGTGCCCAGCACTTTA-3' 5，- TGACGCCACTCATTTCTT -3' PBM026: 5，- CTATCATCAAATGTGCCTCAA -3' 5，- CCGAGCCTCACTTTCTGC-3' PBM027: 5,- AAAGCAACCACGCCATTA-3' 5，- TCGGAGGAGAAGGAGAAG-3' PBM028: 5，- CAGGTAGTCGTCTTATCGAGT-3' 5，- ATAAGTCAATTTCGAATGAA-3' PBM030: 5，- GTTGCCCGTGGTTACTGT-3' 5 ，- CGTGAGCCATCTGAGTTT-3'
3，如权力要求2所述的毛竹微卫星分子标记的开发方法，其特征是编号分 别为PBM002、 PBM004、 PBM007、 PBMOll、 PBM013、 PBM014、 PBM016、 PBM017、 PBM018、 PBM019、 PBM020、 PBM021、 PBM022、 PBM023、 PBM025、 PBM026、 PBM027、 PBM028、 PBM030的微卫星核苷酸序列两端的引物的退火 温度分别为48。C、 48°C、 53°C、 50°C、 53°C、 52°C、 56。C、 55°C、 52°C、 59°C、 46°C、 55。C、 47°C、 58。C、 47。C、 50°C、 49°C、 53°C、 50°C。
4，如权利要求2所述的毛竹微卫星分子标记的应用，其特征是所说的引物， 应用于篌竹、乌芽竹、雷竹、水竹、假毛竹和桂竹6个刚竹属代表竹种微卫星的 开发，通过扩增和测序确认获得了 102条含有微卫星位点的刚竹属DNA序列见 表(2)。
全文摘要
一种毛竹微卫星分子标记的开发，经过毛竹DNA序列的获得，含有微卫星位点的筛选，引物设计和微卫星位点的验证三步骤，最后获得19对微卫星分子标记引物，探索出其适宜的退火温度为46-59℃，再将毛竹微卫星引物经DNA聚合酶链式反应应用于其他6种刚竹属竹种，扩增并测序确认继而获得102条含有微卫星位点的刚竹属DNA序列。采用本方法开发竹类的微卫星分子标记，具有简单、快速、稳定、高效和低成本的优点，为竹子的辅助育种提供了新的工具。
文档编号C12P19/00GK101629196SQ20091010212
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月13日 优先权日2009年8月13日 公开号200910102125.发明者卢江杰, 周明兵, 汤定饮 申请人:浙江林学院 被以下专利引用 (1),