专利名称：基于组织工程方法构建新型高效生物催化剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种“基于组织工程方法构建新型高效生物催化剂”的新技术。
背景技术：
组织工程的概念早在1933年由Biscgelie首次提出，但在60年后的1993年才 由Langer andVacanti在《science》杂志上发表论文给予明确定义组织工程是多学科交 叉的研究领域，它应用生命科学和工程学原理开发恢复，保持或改善组织功能的生物替代 品。自此，组织工程才成功地扩展开来，并激励着科学家和临床医师。它是以解决哺乳动物 组织资源短缺、成本高，以及移植手术可能出现并发症而提出的一项新技术。15年来，组织 工程已发展成一门新兴学科，其研究涵盖人体各个组织和器官。它的核心就是体外构建细 胞-支架3D (three-dimensional)空间复合体结构的组织工程细胞。如组织工程软骨、组 织工程皮肤、组织工程干细胞等各种生物替代品用于临床前植入或修复研究，并最终用于 临床修复，更换或再生细胞，组织或器官，恢复受损功能。组织工程必需具备三个主要条件支架材料；种子细胞；细胞增殖的体外培养条 件。天然材料如丝素蛋白、胶原、海藻酸、壳聚糖，有机聚合物或共聚物以及无机材料 等已广泛用于支架材料，并与各种组织或细胞，如骨或骨髓基质干细胞，内皮细胞，共培养 的成熟内皮细胞和初级成骨细胞等，经3D培养后分别形成相应的组织工程细胞用于临床 前实验研究。PVA能形成良好的凝胶，常用于细胞包埋固定化。其应用中常用的有PVA冷冻法， PVA化学交联法，PVA辐射交联法，国内外在这些方面有大量报道。PVA化学交联法和PVA辐 射交联法或是容易开联，或是对细胞有毒性而在实际应用时受到一定限制。本发明是PVA 应用的物理方法，即PVA冷冻法，凝胶成型利用PVA在0°C -40°C冷冻适当的时间PVA链 间的氢键和微晶区形成三维网络，从而形成物理交联的PVA水凝胶，且该凝胶具有一定的 力学强度，常温下在水中只会溶胀而不会溶解。海藻酸钠固定化细胞因其操作简便、细胞毒性较小等优点而广泛应用。但其缺点 是海藻酸钙在磷酸缓冲液及中不稳定，脱钙使得结构松散而坍塌。本发明正是利用海藻酸 钙凝胶对磷酸盐溶液或其它钙离子络合剂化学侵蚀的敏感性，通过化学侵蚀将已固定化后 含海藻酸钙凝胶中的海藻酸盐部分溶解，从而在原来的凝胶中形成空穴，达到致孔的目的， 以提高催化剂进行生物催化反应时原料和产物的传输效率。目前，国内外仍用传统包埋法固定化细胞。其形状常为透镜状(传质较好，但细胞 载量低)及球状(粒径较大，传质较差，细胞载量较低)。本发明最后成型的细胞组织工程 凝胶包衣片为药片状。包衣前的组织工程细胞采用组织工程方法制备，其技术成熟，操作简 便，易得，细胞载量高达80%以上，且内部有大量通道供底物和产物进出，从而保证了优异 的传质性能，解决了传统固定化细胞中存在的细胞载量小或传质障碍等技术难题。用CTAB等透性化剂对微生物细胞进行透性化处理是提高细胞用于生物催化反应时细胞催化能力的有效方法。本发明先用PVA复合凝胶包衣细胞组织工程片，随即用磷酸 盐溶液等进行化学侵蚀使凝胶包衣层中部分海藻酸钙胶溶解，从而形成微通道以促进小分 子原料和产物在凝胶外衣层中的传输；再对其进行透性化处理提高胞内酶活性；而常见的 固定化细胞是没有进行过透性化处理的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种把组织工程和化学技术相结合，对体外构建的细 胞-支架3D空间复合体结构的组织工程细胞进行包衣、打孔和透性化，制备透性化细胞组 织工程包衣片这种新型高效生物催化剂的方法。为了实现上述目的，本发明以蚕丝丝素蛋白或以有机聚合物、无机物等制成3D多 孔支架，以酵母细胞或其他细菌、真菌为种子细胞，经培养后种植于此支架中进行组织培 养，培养过程因3D多孔支架有大量的空间，利于营养物质进入，种植的细胞顺利地在3D空 间立体生长、增殖与分化而形成细胞_支架3D空间复合体结构的组织工程细胞片。此片支 架中所有孔道的大部分空间都生长增殖着细胞，但每个孔都留有少部分空间供原料或底物 顺利与细胞接触，产物也可顺利输出。其外部用适当比例的海藻酸钠和PVA混合液包衣，在 适当浓度的氯化钙溶液中形成凝胶外衣层，并经冻融增加外衣层的机械性能，用适当浓度 的磷酸盐溶液或其它钙离子络合剂进行化学侵蚀使部分海藻酸钙凝胶溶解，从而形成微通 道以促进小分子原料和产物在凝胶外衣层中的传输。再对其进行透性化处理提高胞内酶活 性，以制备细胞载容量高，酶活力强，扩散限制小或无限制，机械强度好而可循环使用的新 一代细胞组织工程凝胶包衣片这种高效生物催化剂，并以它替代传统的固定化细胞用于合 成手性醇等重要手性药物与医药化工中间体。
经扫描电镜拍照，倒置显微镜观察，血细胞计数法计数，亚甲蓝染色、孔隙率等检 查，这种新一代高效生物催化剂中的3D支架孔隙率达90%，细胞载量达81%，支架中生长 的细胞边缘光滑，形状整齐，体型强壮，成活率100 %，凝胶包衣层具有致密均勻的微孔分布。利用本发明可获得透性化组织工程细胞凝胶包衣片，细胞载容量高，通透性好、机 械强度高。在低温下能长期保存，在生物催化反应中能长期反复使用。这将有利于这种新 型高效生物催化剂在生物催化及生物转化工业领域中的广泛应用。具体实施事例实例一取家蚕蚕茧250g去蛹后，在IOOOmL 0. 02M Na2CO3溶液中煮沸20分钟，丝胶蛋白 充分溶解，用蒸馏水彻底冲洗提取不溶性胶状丝素蛋白。把提取的丝素蛋白加入到500mL 9. 3MLiBr溶液中，并在搅拌下于60°C保持4小时让丝素蛋白溶解，形成浓度约20%的丝素 蛋白与盐的混合液。室温下，该溶液在IOOOmL蒸馏水中透析3天以除去盐。在，温度_5°C 条件下，将透析液离心(转速5000rpm) 2次，每次20分钟，除去杂质和絮状物，得到 8w/
的丝素蛋白水溶液。储藏在4°C备用。按每2ml溶液加入4克致孔剂(氯化钠微晶)的量，在 8wt%的丝素蛋白溶液中 加入粒经为106 212 μ m的氯化钠微晶，混勻后分装在直径约IOmm的96孔板中，置于室 温风干成胶。24小时后，将96孔板浸入蒸馏水中2天，洗净氯化钠即成。备用。
种子酵母细胞的培养放大培养基:MY培养基(葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，麦芽汁0.3%。pH 6. 8)。扩大培养斜面培养一富氏培养一巴氏培养细胞接种并培养将支架浸泡在麦芽汁中并过夜，第二天取出支架后，再将巴氏瓶 中的酵母细胞接种到支架上，接种细胞量为2X IO6Cells/支架。在20°C水浴摇床上，轻微 振荡Ih后，将其移入96孔培养板中，再置于培养箱中在20°C静置培养4天，每日早晚翻动
一次。组织工程细胞凝胶包衣片的制备取PVA、海藻酸钠加热配置成浓度分别为10. 0%和1. 5%的混合液200ml。初步胶化定型将制得的混合液滴于96孔板中的细胞片表面，随后此板放入包衣 机中开冷风吹30分钟至表面胶化；翻转96孔板中的细胞片，在其表面再滴上上述混合液后 放入包衣机中开冷风吹30分钟至表面胶化。二次胶化将初步凝胶包衣片从96孔板中取出，于0. 2mol/L CaCl2溶液中搅拌20 分钟。然后用蒸馏水洗净片表面的CaCl2。冻融二次胶化的凝胶包衣片经(-20°C ) 1个循环(12小时)冻融5次，增加PVA 外衣层的机械强度。凝胶层打孔把冻融后的凝胶包衣片放入IOOml 0. IM磷酸盐溶液中振荡40分钟 进行化学侵蚀，使部分海藻酸钙凝胶溶解，从而形成微通道以促进小分子原料和产物在凝 胶外衣层中的传输。透性化组织工程细胞凝胶包衣片的制备将组织工程细胞凝胶包衣片转入0. IM磷酸钠(NaPi) pH7. 0的缓冲液中，膨化后， 溶液换成0.05M磷酸钠缓冲液。取出膨化后的组织工程细胞凝胶包衣片，再浸入IOOml 0. 1 % CTAB, 0. IM NaPi (pH7. 0)缓冲溶液于24°C保持30分钟，过滤并用重蒸水洗净，收集得 透性化细胞组织工程凝胶包衣片这种新型高效生物催化剂。用于催化合成手性醇。实例二将聚乳酸IOOg溶解于200ml氯仿溶液中，加入粒径为206 310 μ m氯化钠微晶 160g并混合均勻，按照每孔Iml装于直径约IOmm的96孔板中，风干挥去氯仿成胶。24小 时后，将96孔板浸入蒸馏水中2天，洗净氯化钠即成。备用。以短小芽孢杆菌为种子细胞。菌株在含有LB琼脂培养基的平板上生长5天。之 后接种到已在M9培养基中浸泡过夜的支架上，接种细胞量为IX IO6Cells/支架/孔。置 于培养箱中培养3天。取一定量的PVA和海藻酸钠加热至完全溶解，制成含15. 0% PVA和2. 0%海藻酸 钠的混合液200ml。冷至室温。将制得的混合液滴于96孔板中的细胞片表面，随后此板放 入包衣机中开冷风吹20分钟至表面胶化；翻转96孔板中的细胞片，在其表面再滴上上述混 合液后放入包衣机中开冷风吹20分钟至表面胶化。将初步凝胶包衣片从96孔板中取出，于0. 5mol/L CaCl2溶液中搅拌20分钟。然 后用蒸馏水洗净片表面的CaCl2。在_30°C冻融5次，每次12小时，增加PVA外衣层的机械强度。
把冻融后的凝胶包衣片放入100ml pH7. 0磷酸盐溶液中振荡40分钟进行化学侵 蚀，使部分海藻酸钙凝胶溶解，从而形成微通道。将已形成微通道的组织工程细胞凝胶包衣片浸入IOOml 0. 2 % CTAB, 0. IM磷酸钠 (NaPi) pH7. 0缓冲溶液于24°C保持30分钟，过滤并用重蒸水洗净，收集得透性化细胞组织 工程凝胶包衣片这种新型高效生物催化剂。 用于催化合成手性醇。
权利要求
基于组织工程方法构建新型高效生物催化剂，其主要步骤为a)三维多孔支架的制备用适当溶剂将组织工程支架材料和适量致孔剂微晶(水溶性无机盐)制成均匀的混合物，加入到多孔培养板中，风干成胶后，用去离子水浸出微晶制成直径5～10mm、厚度3～6mm的三维多孔支架。b)细胞接种于三维多孔支架培养先将上述支架浸泡于一定浓度培养基或麦芽汁中并过夜。将种子细胞经扩大培养后按一定量接种到支架上，置于1～50℃水浴摇床轻微振荡1～200分钟后，将其移入多孔培养板中，再置于培养箱中在4℃～40℃培养1～10天，制得组织工程细胞片。c)对组织工程细胞片进行凝胶包衣取一定量的聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠加热至完全溶解，制成PVA和海藻酸钠的混合液。冷至室温。将制得的混合液滴于多孔板中的组织工程细胞片表面，放入包衣机中冷风吹5～120分钟至表面胶化；翻转组织工程细胞片后，再在其表面再滴上上述混合液，放入包衣机中开冷风吹5～120分钟至表面胶化。将凝胶包衣片从多孔板中取出，放入一定浓度CaCl2溶液中搅拌3～180分钟。洗净表面的CaCl2。反复冻融，增加包衣层机械强度。制得组织工程细胞凝胶包衣片。d)凝胶包衣层脱钙致孔把组织工程细胞凝胶包衣片放在一定浓度磷酸盐或柠檬酸或EDTA溶液中振荡一定时间，使凝胶层中的海藻酸钙溶解形成微孔通道，便于物质传输。e)透性化将上述形成微孔通道后的组织工程细胞凝胶包衣片，放在十六烷基三甲基溴化铵溶液(CTAB)或甲苯或乙醇混合溶剂中，在4～40℃处理2～120分钟，使细胞透性化，增加凝胶包衣片中细胞的酶活性。制得透性化组织工程细胞凝胶包衣片这种新型高效生物催化剂。液体环境所述PVA水溶液在0.01％～15％(W/V)；所述海藻酸钠浓度在0.01％～6％(W/V)；所述CaCl2溶液浓度在0.1％～20％(W/V)；所述的磷酸盐或柠檬酸或EDTA浓度为0.01～1mol/L；透性化处理所用CTAB或甲苯或乙醇混合溶剂溶液为0.01％到8％；透性化时间为1～60分钟。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a)中所述的组织工程支架材料为天然 材料如丝素蛋白、胶原蛋白、明胶、海藻酸(盐)、壳聚糖、琼脂糖等，人工合成材料如脂肪族 聚酯、聚酸酐、聚乳酸等共聚物以及无机材料如羟基磷灰石等；所用溶剂为水、酸溶液、碱溶 液、有机溶剂；致孔剂微晶采用粒径50 1000微米氯化钠等水溶性无机盐，其用量为组 织工程支架材料无机盐=1 1 1 10。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b)中所述细胞为酵母或其它真菌细 胞，或细菌和基因工程改造过的微生物细胞等，质量分数2% 80%。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c)中所述的冻融条件为-80°C 0°C， 1 10次，每次1 24小时。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d)中在磷酸盐或柠檬酸或EDTA溶液 中振荡，凝胶层打孔1 80分钟。利用凝胶层海藻酸钙对磷酸盐溶液或其它钙离子络合剂 化学侵蚀的敏感性，通过化学侵蚀将细胞支架片上凝胶中的藻酸盐部分溶解，从而形成空 穴，以提高在用生物催化剂催化剂进行生物催化反应时原料和产物的传输效率。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e)中，用CTAB、甲苯或乙醇混合溶剂 进行透性化处理，从而提高细胞内的酶活性。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于使用后的支架，经过去掉包衣层，洗净细胞 后，可以再经过要求1中所述的步骤从b)、c)、d)到e)所述处理，重复应用。
全文摘要
通过结合组织工程与化学技术，制备新型高效生物催化剂的新方法。该法选用微生物为种子细胞扩大培养后接种于支架材料上再经组织培养，制成细胞-支架三维空间复合体结构的组织工程细胞片，其细胞载量达80％以上，且支架中仍有足够通道供底物或产物进出；此片经聚乙烯醇/海藻酸钠包衣、在氯化钙溶液中成型、冻融成凝胶包衣片；包衣层中的海藻酸钙胶在磷酸盐中部分溶解形成微通道利于小分子传递；然后透性化处理提高凝胶包衣片中细胞胞内酶活性。从而构建细胞载量高、催化效力强、扩散限制小、机械强度好的透性化组织工程细胞凝胶包衣片这种新型高效生物催化剂，并以此替代传统固定化细胞用于生物催化制备手性醇等重要手性药物与医药化工中间体。
文档编号C12N11/04GK101824407SQ20091010331
公开日2010年9月8日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者于明安, 侯毅, 黎刚 申请人:重庆医科大学