专利名称：抗igf-i受体抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及与人胰岛素样生长因子-I受体(IGF-I受体)结合的抗体。更具体地说，本发明涉及可抑制IGF-I受体的细胞功能的抗IGF-I受体抗体。更具体地，本发明涉及可拮抗IGF-I，IGF-II和血清对肿瘤细胞生长和存活的作用的抗体，它们基本上缺乏激动剂活性。本发明也涉及所述抗体的片段，所述抗体的人源化(humanized)和表面重构(resurfaced)的形式，所述抗体的偶联物(conjugates)，抗体衍生物(derivatives)，和它们在诊断，研究和治疗应用中的用途。本发明进一步涉及改良的抗体或其片段，它们可从上述的抗体及其片段制成。在另一个方面，本发明涉及编码所述抗体或其片段的多聚核苷酸，以及含有所述多聚核苷酸的载体。
背景技术：
胰岛素样生长因子-I受体(IGF-I受体)是一种跨膜异源四聚体蛋白，其具有两个细胞外α链和两个跨膜β链，通过二硫键连接成β-α-α-β构型。胰岛素样生长因子-I(IGF-I)和胰岛素样生长因子-II(IGF-II)作为配体通过IGF-I受体的细胞外结构域结合到其上，从而激活其细胞内的酪氨酸激酶结构域， 引起该受体的自体磷酸化(autophosphorylation)和底物磷酸化。IGF-I受体与胰岛素受体同源，在β链的酪氨酸激酶结构域中有84％的高度序列相似性，在α链的细胞外富含半胱氨酸的结构域中有48％的较低序列相似性(Ulrich，A.等，1986，EMBO，5，2503-25 12；Fujita-Yamaguchi，Y.等，1986，J.Biol.Chem.，261，16727-16731；LeRoith，D.等，1995，Endocrine Reviews，16，143-163)。IGF-I受体及其配体(IGF-I和IGF-II)在大量的生理学过程中扮演者重要角色，包括在胚胎发生，成体的代谢，细胞增殖和细胞分化过程中的生长和发育(LeRoith，D.，2000，Endocrinology，141，1287-1288；LeRoith，D.，1997，New England J.Med.，336，633-640)。
IGF-I和IGF-II可在血液中作为内分泌激素而发挥作用，此时它们主要与IGF结合蛋白以复合物的形式存在，IGF-I和IGF-II还可作为局部产生的旁分泌和自分泌生长因子而发挥作用(Humbel，R.E.，1990，Eur.J.Biochem.，190，445-462；Cohick，W.S.和Clemmons，D.R.，1993，Annu.Rev.Physiol.55，131-153)。
IGF-I受体被认为涉及促进肿瘤细胞的生长，转化和存活(Baserga，R.等，1997，Biochem.Biophys.Acta，1332，F105-F126；Blakesley，V.A.等，1997，Journal of Endocrinology，152，339-344；Kaleko，M.，Rutter，W.J.和Miller，A.D.1990，Mol.Cell.Biol，10，464-473)。因此，已经知道数种类型的肿瘤表达的IGF-I受体水平较正常水平高，包括乳癌，结肠癌，卵巢癌，滑膜肉瘤和胰腺癌(Khandwala，H.M.等，2000，EndocrineReviews，21，215-244；Werner，H.和LeRoith，D.，1996，Adv.Cancer Res.，68，183-223；Happerfield，L.C.等，1997，J.Pathol，183，412-417；Frier，S.等，1999，Gut，44，704-708；van Dam，P.A.等，1994，J.Clin.Pathol.，47，914-919；Xie，Y.等，1999，Cancer Res.，59，3588-3591；Bergmann，U.等，1995，Cancer Res.，55，2007-2011)。在体外，IGF-I和IGF-II显示可以作为数种人类肿瘤细胞系有效的有丝分裂原，如肺癌，乳癌，结肠癌，骨肉瘤和宫颈癌(Ankrapp，D.P.和Bevan，D.R.，1993，Cancer Res.，53，3399-3404；Cullen，K.J.，1990，Cancer Res.，50，48-53；Hermanto，U.等，2000，Cell Growth & Differentiation，11，655-664；Guo，Y.S.等，1995，J.Am.Coil.Surg.，181，145-154；Kappel，C.C.等，1994，Cancer Res.，54，2803-2807；Steller，M.A.等，1996，Cancer Res.，56，1761-1765)。这些肿瘤和肿瘤细胞系中的数种也可表达高水平的IGF-I或IGF-II，它们可以自分泌或旁分泌的方式刺激其生长(Quinn，K.A.等，1996，J.Biol.Chem.，271，11477-11483)。
流行病学研究已经显示，较高的IGF-I血浆水平(和IGF结合蛋白-3的较低水平)与前列腺癌，结肠癌，肺癌和乳癌的危险性增加有关(Chan，J.M.等，1998，Science，279，563-566；Wolk，A.等，1998，J.Natl.Cancer Inst.，90，911-915；Ma，J.等，1999，J.Natl.Cancer Inst.，91，620-625；Yu，H.等，1999，J.Natl.Cancer Inst.，91，151-156；Hankinson，S.E.等，1998，Lancet，351，1393-1396)。已经有建议，可以采用降低血浆中IGF-I水平或抑制IGF-I受体功能的策略来预防癌症(Wu，Y.等，2002，Cancer Res.，62，1030-1035；Grimberg，A和Cohen P.，2000，J.Cell.Physiol，183，1-9)。
IGF-I受体可保护肿瘤细胞免受生长因子缺失(growth factordeprivation)，贴壁非依赖性(anchorage-independence)或细胞毒性药物处理所引起的凋亡(Navarro，M.和Baserga，R.，2001，Endocrinology，142，1073-1081；Baserga，R.等，1997，Biochem.Biophys.Acta，1332，F105-F126)。对其促有丝分裂，转化和抗凋亡活性至关重要的IGF-I受体结构域已经通过突变分析被鉴定出来。
例如，IGF-I受体的酪氨酸1251残基被鉴定对于抗凋亡和转化活性非常重要，但与其促有丝分裂活性无关(O′Connor，R.等，1997，Mol.Cell.Biol，17，427-435；Miura，M.等，1995，J.Biol.Chem.，270，22639-22644)。通过配体活化的IGF-I受体的细胞内信号通路涉及胰岛素受体底物(IRS-1和IRS-2)的酪氨酸残基的磷酸化，它们可将磷脂酰肌醇-3-激酶(PI-3-激酶)招集(recruit)至膜上。PI-3激酶的膜结合磷脂产物可活化丝氨酸/苏氨酸激酶Akt，其底物包括促凋亡蛋白BAD，它可被磷酸化成为非活化状态(Datta，S.R.，Brunet，A.和Greenberg，M.E.，1999，Genes & Development，13，2905-2927；Kulik，G.，Klippel，A.和Weber，M.J.，1997，Mol.Cell.Biol 17，1595-1606)。在MCF-7人乳癌细胞中IGF-I受体的促有丝分裂信号需要PI-3-激酶，不依赖有丝分裂原活化的蛋白激酶，而在分化的大鼠嗜铬细胞瘤PCI2细胞中的存活信号需要PI-3-激酶和有丝分裂原活化的蛋白激酶通路(Dufourny，B.等，1997，J.Biol.Chem.，212，31163-31171；Parrizas，M.，Saltiel，A.R.和LeRoith，D.，1997，J.Biol.Chem.，272，154-161)。
已经显示，通过反义(anti-sense)策略下调IGF-I受体可降低几种肿瘤细胞系在体内和体外的致肿瘤性，如黑色素瘤，肺癌，卵巢癌，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤和横纹肌肉瘤(Resnicoff，M.等，1994，Cancer Res.，54，4848-4850；Lee，C.-T.等，1996，Cancer Res.，56，3038-3041；Muller，M.等，1998，Int.J.Cancer，77，567-571；Trojan，J.等，1993，Science，259，94-97；Liu，X.等，1998，Cancer Res.，58，5432-5438；Shapiro，D.N.等，1994，J.Clin.Invest.，94，1235-1242)。而且，据报道，IGF-I受体的显性负突变体(dominant negative mutant)可降低过度表达IGF-I受体的转化Rat-1细胞在体内的致肿瘤性和体外的生长(Prager，D.等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，2181-2185)。
表达IGF-I受体mRNA的反义分子的肿瘤细胞当被注射进入动物中时，在生物扩散腔(biodiffusion chambers)中会发生大量的凋亡。这种观察使得IGF-I受体成为一种有吸引力的治疗靶标，这是基于这样的假设，即通过抑制IGF-I受体可使肿瘤细胞较正常细胞更易凋亡(Resnicoff，M.等，1995，Cancer Res.，55，2463-2469；Baserga，R.，1995，Cancer Res.，55，249-252)。
在肿瘤细胞中抑制IGF-I受体的功能的另一个策略是应用抗IGF-I受体的抗体，所述抗体可与IGF-I受体的细胞外结构域结合，并抑制其活化。据报道，已经进行了几种尝试来开发抗IGF-I受体的鼠单克隆抗体，其中获得了两种抑制性抗体IR3和1H7，它们的应用已经在几个IGF-I受体研究中被报道。
应用胰岛素受体的部分纯化的胎盘制剂来免疫小鼠，产生选择性地结合胰岛素受体的抗体IR1，以及两种抗体IR2和IR3，这两种抗体显示出对IGF-I受体(生长调节素-C受体)的优先沉淀，但也能微弱地沉淀胰岛素受体，由此开发出IR3抗体(Kull，F.C.等，1983，J.Biol.Chem.，258，6561-6566)。
通过用纯化的IGF-1受体胎盘制剂免疫小鼠开发出1H7抗体，在这个过程中除了产生抑制性抗体1H7外，还产生三种刺激性抗体(Li，S.-L.等，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.，196，92-98；Xiong，L.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，89，5356-5360)。
在另一个报道中，通过用表达高水平的IGF-I受体的转染3T3细胞免疫小鼠，获得一系列针对人IGF-I受体的特异性鼠单克隆抗体，通过结合竞争研究及其对IGF-I与转染3T3细胞结合的抑制或刺激可将它们分为7类(Soos，M.A.等，1992，J.Biol.Chem.，267，12955-12963)。
因此，尽管IR3抗体是体外IGF-I受体研究中最常用的抑制性抗体，但它有一些缺点，即它对表达人IGF-I受体的转染3T3和CHO细胞显示有激动活性(agonistic activity)(Kato，H.等，1993，J.Biol.Chem.，268，2655-2661；Steele-Perkins，G.和Roth，R.A.，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.，171，1244-1251)。同样，在由Soos等人开发的一系列抗体中，最具抑制性的抗体24-57和24-60也在转染3T3细胞中显示出激动活性(Soos，M.A.等，1992，J.Biol.Chem.，267，12955-12963)。尽管，据报道IR3抗体可抑制IGF-I(但不是IGF-II)与完整细胞中表达的受体的结合，在溶解后，它显示出在体外抑制IGF-I和IGF-II刺激细胞中DNA合成的能力(Steele-Perkins，G.和Roth，R.A.，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.，171，1244-1251)。IR3抗体的结合表位已经从嵌合的胰岛素-IGF-I受体构建物中推导出来，是IGF-I受体的223-274区域(Gustafson，T.A.和Rutter，W.J.，1990，J.Biol.Chem.，265，18663-18667；Soos，M.A.等，1992，J.Biol.Chem.，267，12955-12963)。
MCF-7人乳癌细胞系通常被用作模型细胞系来证明体外IGF-I和IGF-II的生长响应(Dufourny，B.等，1997，J.Biol.Chem.，272，31163-31171)。在MCF-7细胞中，IR3抗体可不完全地阻断在无血清的条件下外源性添加的IGF-I和IGF-II的刺激效应的大约80％。而且，IR3抗体在10％的血清中并不很明显地抑制(小于25％)MCF-7细胞的生长(Cullen，K.J.等，1990，Cancer Res.，50，48-53)。在体外，IR3抗体对血清刺激的MCF-7细胞生长的这种微弱抑制作用与体内研究的结果一致，在体内，IR3抗体的处理并不能明显抑制裸鼠中MCF-7异种移植物的生长(Arteaga，C.L.等，1989，J.Clin.Invest.，84，1418-1423)。
由于IR3和其他已报道的抗体的微弱激动活性，以及它们不能明显抑制肿瘤细胞如MCF-7细胞在血清刺激这样更加生理化的条件下生长(这里所述的血清刺激不同于在无血清条件下外源添加的IGF-I或IGF-II的刺激作用)，因此需要能够明显抑制肿瘤细胞的血清刺激性生长，但其本身不显示出明显的激动剂活性的新的抗IGF-I受体抗体。
发明概述 因此，本发明的一个目的是提供可特异结合胰岛素样生长因子-I受体并通过拮抗该受体而抑制该受体的细胞活性的抗体，抗体片段和抗体衍生物，它们实质上也不具有对该受体的激动剂活性。
因此，在第一个实施方案中，提供了鼠抗体EM 164，在此对其进行了完整的表征，即其轻链和重链可变区的氨基酸序列，轻链和重链可变区的基因的cDNA序列，其CDR(互补决定区)的鉴定，其表面氨基酸的鉴定，和将其以重组形式进行表达的手段。
在又一个实施方案中，提供了重构表面或人源化的抗体EM 164，其中所述抗体或其片段的暴露于表面的残基在轻链和重链中被重置以便更接近已知的人抗体表面。这种人源化抗体与鼠EM164相比，在作为治疗或诊断试剂方面的实用性要更强。人源化的抗体EM164的特征在此也完全被揭示，包括其轻链和重链可变区各自的氨基酸序列，轻链和重链可变区的基因的DNA序列，CDR的鉴定，其表面氨基酸的鉴定，和其以重组形式进行表达的方式的公开。
在第三个实施方案中，提供了一种抗体，它能够在生长刺激物存在的情况下抑制癌症细胞的生长超过大约80％，所述刺激物例如血清，胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II。
在第四个实施方案中，提供了一种抗体或抗体片段，其具有重链和轻链，所述重链包含分别具有SEQ ID NOS1-3中所示的氨基酸序列的CDR SYWMH (SEQ ID NO1)， EINPSNGRTNYNEKFKR (SEQ ID NO2)， GRPDYYGSSKWYFDV(SEQ ID NO3)； 所述轻链包含分别具有SEQ ID NOS4-6中所示的氨基酸序列的CDR RSSQSIVHSNVNTYLE (SEQ ID NO4)； KVSNRFS(SEQ ID NO5)； FQGSHVPPT (SEQ ID NO6)。
在第五个实施方案中，提供了抗体，其重链具有的氨基酸序列与SEQ ID NO7中所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性(identity) QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTNYNEKFKRKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDYYGSSKWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQID NO7)。
同样，提供了抗体，其轻链具有的氨基酸序列与SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性 DVLMIQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO8)。
在第六个实施方案中，提供了抗体，其具有人源化或重构表面的轻链可变区，该区域具有与SEQ ID NOS9-12中之一对应的氨基酸序列 DVVMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO9)； DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR (SEQ ED NO10)； DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO11)；或 DVVMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO12)。
同样，提供了抗体，其具有人源化或重构表面的重链可变区，该区域具有与SEQ ID NO13对应的氨基酸序列 QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTNYNQKFQGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDYYGSSKWYFDVWGQGTTVTVSS (SEQID NO13)。
在第七个实施方案中，提供了具有改良的特性的本发明抗体或抗体片断。例如，对IGF-I受体具有更强的亲和性的抗体或抗体片段可通过本发明的抗体或片段的亲和力成熟(affinity maturation)来制备。
本发明进一步提供了所述抗体的偶联物，其中细胞毒性试剂直接地或者通过一个可断裂的或不可断裂的连接物(linker)共价连接于本发明的抗体或抗体的表位(epitope)结合片段。在优选的实施方案中，所述细胞毒性试剂是紫杉醇，maytansinoid，CC-1065或CC-1065类似物(analog)。
本发明进一步提供了被进一步标记的可在研究或诊断应用中被使用的抗体或其片段。在优选的实施方案中，所述标记是放射标记，荧光团(fluorophore)，生色团(chromophore)，显影剂(imaging agent)或金属离子。
也提供了一种诊断方法，其中所述的被标记的抗体或片段被施于怀疑患有癌症的受试者，并测定或监测受试者体内的标记物的分布。
在第八个实施方案中，本发明提供了通过将本发明的抗体，抗体片段或抗体偶联物单独施用或者与其他细胞毒性试剂或治疗试剂联合施用来治疗患有癌症的受试者的方法。所述癌症可以是下列的一种或者多种，例如乳癌，结肠癌，卵巢癌，骨肉瘤，宫颈癌，前列腺癌，肺癌，滑膜肉瘤，前列腺癌或其他被确定其中IGF-I受体水平升高的癌症。
图1显示了纯化的EM164抗体与过量表达人Y1251F IGF-I受体或人胰岛素受体的细胞的特异结合的荧光激活细胞拣选(FACS)分析。
图2显示了EM164抗体与生物素化人IGF-I受体结合的结合滴定曲线。
图3显示了EM164抗体对生物素化IGF-I与人乳癌MCF-7细胞结合的抑制。
图4显示了EM164抗体对MCF-7细胞中IGF-I刺激的IGF-I受体自体磷酸化的抑制。
图5显示了EM164抗体对MCF-7细胞中IGF-I刺激的IRS-1磷酸化的抑制。
图6显示了EM164抗体对SaOS-2细胞中IGF-I刺激的信号转导的抑制。
图7图示了在无血清、+IGF-I或+1.25％血清的条件下，抗体对MCF-7细胞的生长和存活的影响，显示了通过MTT分析检测的EM164抗体对不同的生长条件下，MCF-7细胞的生长和存活的影响。
图8显示了在不同血清浓度(0.04-10％血清浓度)下EM164抗体对MCF-7细胞的生长和存活的影响。
图9显示了EM164抗体对IGF-I和血清刺激的NCI-H838细胞生长和存活的抑制作用。
图10显示了EM164抗体，紫杉醇或EM164抗体和紫杉醇的联合处理对小鼠中Calu-6肺癌异种移植物生长的影响。*由于一个肿瘤的快速生长而致死的组。
图11显示了人源化EM164抗体(v1.0(1.0型))与固定的生物素化IGF-I受体的结合和鼠EM164抗体(1.06-10.6倍摩尔浓度范围)的结合之间的竞争。
图12显示了鼠抗IGF-I受体抗体EM164的轻链引导区和可变区的cDNA(SEQ ID NO49)和氨基酸序列(SEQ ID NO50)。箭头标记了构架1的起始点。3个CDR的序列根据Kabat被划线标出。
图13显示了鼠抗IGF-I受体抗体EM164重链引导区和可变区的cDNA(SEQ ID NO51)和氨基酸序列(SEQ ID NO52)。箭头标记了构架1的起始点。3个CDR序列根据Kabat被划线标出。
图14显示了抗体EM164的轻链和重链CDR氨基酸序列，根据Chothia典型分类定义(Chothis canonical class definitions)确定。也显示了AbM建模软件对重链CDR的定义。轻链CDR1是SEQ ID NO4，CDR2是SEQ ID NO5，CDR3是SEQ ID NO6。重链CDR1是SEQ IDNO1，CDR2是SEQ ID NO2，和CDR3是SEQ ID NO3。AbM重链CDR1是SEQ ID NO53，CDR2是SEQ ED NO54，CDR3是SEQ ED NO55。
图15图示了胚系序列比较，显示了Crl(SEQ ID NO56)和J558.c(SEQ ID NO57)基因的胚系序列与抗IGF-I受体抗体EM164的轻链和重链氨基酸序列的比对。短划线(-)表示序列的同一性。
图16图示了克隆和哺乳动物表达质粒图谱，显示了用于构建和表达重组的嵌合的和人源化的EM164抗体的质粒。A)轻链克隆质粒，B)重链克隆质粒，C)哺乳动物抗体表达质粒。
图17图示了10个最同源轻链序列的比对，显示了从结构文件组中的127个抗体中筛选出的轻链的10个最同源的氨基酸序列，被用来预测EM164的表面残基，em164LC(SEQ ID NO58)，2jel(SEQ ID NO59)，2pcp(SEQ ID NO60)，1nqb(SEQ ID NO61)，lkel(SEQ ID NO62)，1hyx(SEQ ID NO.63)，ligf(SEQ ID NO64)，1tet(SEQ ID NO65)，1clz(SEQ ID NO66)，1bln(SEQ ID NO67)，1cly(SEQ ID NO68)，保守序列(SEQ ID NO69)。
图18图示了10个最同源重链序列的比对，显示了从结构文件组中的127个抗体中筛选出的重链的10个最同源的氨基酸序列，被用来预测EM164的表面残基，em1·64HC(SEQ ID NO70)，1nqb(SEQ ID NO71)，1ngp(SEQ ID NO72)，1fbi(SEQ ID NO73)，lafv(SEQ ID NO74)，1yuh(SEQ ID NO75)，1plg(SEQ ID NO76)，1d5b(SEQ ID NO77)，1ae6(SEQ ID NO78)，laxs(SEQ ID NO79)，3hfl(SEQ ID NO80)，保守序列(SEQ ED NO81)。
图19显示了所述10个最同源结构的每个(A)轻链和(B)重链可变区残基的平均可及性。数字代表在Kabat抗体序列中的位置编号。
图20图示了鼠和人源化的EM164抗体的轻链可变区氨基酸序列，显示了鼠EM164(muEM164)和人源化EM164(huEM164)的轻链可变区氨基酸序列。muEM164(SEQ ID NO82)，huEM164V1.0(SEQED NO83)，huEM164V1.1(SEQ ED NO84)，huEM164V1.2(SEQED NO85)，huEM164V1.3(SEQ ED NO86)。
图21图示了鼠和人源化的EM164抗体的重链可变区氨基酸序列，显示了鼠EM164抗体(muEM164，SEQ ID NO87)和人源化EM164抗体(huEM164，SEQ ED NO88)的重链可变区氨基酸序列。
图22显示了huEM164v1.0轻链可变区DNA和氨基酸序列(DNA，SEQ ID NO89，氨基酸SEQ ID NO90)和重链可变区DNA和氨基酸序列(DNA，SEQ ID NO91，氨基酸SEQ ID NO92)。
图23显示了人源化EM164v1.1的轻链可变区DNA和氨基酸序列(DNA，SEQ ID NO93；氨基酸SEQ ID NO94)，v1.2的轻链可变区DNA和氨基酸序列(DNA，SEQ ID NO95；氨基酸SEQ ID NO96)和v1.3的轻链可变区DNA和氨基酸序列(DNA，SEQ ID NO97；氨基酸SEQ ID NO98)。
图24显示了人源化EM164v1.0抗体(6-25微克/毫升)和鼠EM164抗体(5-10微克/毫升)对IGF-I刺激的MCF-7细胞生长和存活的抑制作用的比较。
图25图示了EM164抗体对MCF-7细胞的细胞周期阻遏，显示EM164可抑制IGF-I刺激的MCF-7细胞周期。
图26图示了EM164抗体对NCI-H838肺癌细胞的凋亡的诱导(通过caspase对细胞角蛋白CK18蛋白的切割来进行测定)，显示EM164可抑制IGF-I和血清的抗凋亡效应。用EM164进行的处理可引起细胞凋亡式的细胞死亡，这通过被切割的CK18蛋白水平升高证实。
图27图示了EM164抗体作为单一试剂或者与吉西他滨联合进行处理对小鼠中人BxPC-3胰腺癌异种移植物生长的抑制，显示了使用EM164抗体，吉西他滨(gemcitabine)或EM164和吉西他滨的联合进行的处理对免疫缺陷小鼠中人BxPC-3胰腺癌异种移植物生长的影响。
发明详述 本发明发现和改良了可与细胞表面上的人胰岛素样生长因子-I受体(IGF-IR)特异结合的新的抗体。所述抗体和片段具有独特的抑制受体的细胞功能的能力，而没有活化受体本身的能力。因此，以前已知的可特异结合和抑制IGF-IR的抗体即使在缺少IGF-IR配体的情况下也可活化受体，而本发明的抗体或片段可拮抗IGF-IR却又实质上缺少激动剂活性。而且，本发明的抗体和抗体片段可抑制人肿瘤细胞如MCF-7细胞在有血清条件下的生长超过80％，其抑制程度高于使用以前已知的抗IGF-IR抗体所获得的程度。
本发明的实施源自一种鼠抗IGF-IR抗体，在此称为EM164，对此进行了完全的表征，包括轻链和重链的氨基酸序列，CDR的鉴定，表面氨基酸的鉴定，以及其以重组形式进行表达的方式。
在图15中显示了胚系序列(germline sequence)，并将其与EM164的序列进行比对。这样的比较鉴定出EM164中可能的体细胞突变(somatic mutation)，包括在轻链CDR1中的一个和重链CDR2中的一个。
抗体EM164和其人源化形式的轻链和重链的一级氨基酸和DNA序列在此被公开。但本发明的范围不限于包含这些序列的抗体和片段。相反，与胰岛素样生长因子-I受体特异结合，并拮抗该受体的生物学活性，而又实质上缺少激动剂活性的所有抗体和片段都包括在本发明的范围之内。因此，抗体和抗体片段可能在其骨架(scaffold)，CDR，轻链和重链的氨基酸序列上与抗体EM164或人源化衍生物有区别，并仍然包括在本发明的范围之内。
通过建模(modeling)和其分子结构而鉴定的抗体EM164的CDR已经被预测。另外，尽管所述CDR对于抗原结合部位(epitope)的识别很重要，但它们对于本发明的抗体和片段并不是必需的。因此，提供了具有改善的性质的抗体和片段，例如可通过本发明的抗体的亲和力成熟来产生。
多样的抗体和抗体片段，以及抗体模拟物(mimics)可以很容易地通过在位于一套特定的CDR的侧面的可变区和恒定区序列中进行突变，删除和/或插入而产生。因此，例如，对于一套既定的CDR，可以通过不同重链的取代而得到不同类型的Ab，由此产生例如IgGl-4，IgM，IgAl-2，IgD，IgE型抗体和同型(isotypes)抗体。同样，在本发明范围内的人造抗体可通过将一组既定的CDR嵌入进整个合成的骨架中而产生。术语“可变的(variable)”在此用来描述可变结构域的某些部分，它们的序列在抗体之间是不同的，可用于各种特定抗体与其抗原的特异性结合。然而，可变性通常并不是在抗体的可变结构域中平均分布的。这种可变性典型地集中在轻链和重链可变结构域内的称为互补性决定区(complementarity determining regions，CDR)或高变区(hypervariable regions)的三个片段内。可变结构域的更加高度保守的部分称为构架(framework，FR)。重链和轻链的可变结构域每个都包含4个构架区，大部分采取β-片层构型，通过三个CDR连接，形成环状连接，在一些情况下形成β-片层结构的一部分。各条链中的CDR通过FR区紧靠在一起，并和来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点(E.A.Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，1991，NIH)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示有多种效应器功能(effector function)，如该抗体参与抗体依赖的细胞毒性。
人源化抗体或不受其他哺乳动物排斥的抗体可以采用几种技术来产生，如表面重构(resurfacing)和CDR移植(CDR grafting)。在表面重构技术中，将分子建模，统计分析和诱变技术结合起来调整可变区的非CDR表面以使其类似于靶宿主的已知抗体的表面。抗体表面重构的策略和方法和降低抗体在不同宿主中的免疫原性的其它方法在美国专利5,639,641中公开，在此引入以供参考。在CDR移植技术中，鼠重链和轻链CDR被移植进人的整个构架序列中。
本发明也包括在本说明书中描述的抗体的功能等价物(functionalequivalents)。功能等价物具有与所述抗体相当的结合特性，包括例如，嵌合的，人源化的和单链的抗体以及其片段。产生这样的功能等价物的方法在PCT申请WO 93/21319，欧洲专利申请239,400；PCT申请WO89/09622；欧洲专利申请338,745；和欧洲专利申请EP 332,424中公开，分别在此整体引入以供参考。
功能等价物包括有其氨基酸序列实质上与本发明的抗体的可变区或高变区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“实质上相同”在用于描述氨基酸序列时是指与另一条氨基酸序列具有至少大约90％，更优选至少大约95％的序列同一性的序列，这种同一性可以根据Pearson和Lipman的FASTA搜索方法测定，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，2444-2448(1988)。
嵌合抗体优选具有实质上或全部地源自人抗体恒定区的恒定区以及实质上或全部地源自除人之外的哺乳动物的可变区序列的可变区。抗体的人源化形式的制备例如可通过将鼠抗体的互补性决定区放进人构架结构域中来完成，例如，见PCT申请
发明者R·辛格, D·J·塔瓦雷斯, N·E·达地吉恩 申请人:伊缪诺金公司