专利名称：花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶β亚基基因及其编码的蛋白质与克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程技术领域，具体涉及花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶P亚 基基因及其编码的蛋白质与克隆方法。
背景技术：
乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase, ACCase)属于生物素包含酶，它在生物 体内催化乙酰辅酶A羧化形成丙二酰辅酶A，为脂肪酸和许多次生代谢产物的合成提供底物 (Konishi T， Shinohara K， Yamada K. Acetyl-CoA carboxylase in higher plants: most plants other than gramineae have both the prokaryotic and the eukaryotic forms of this enzyme[J]. Plant Cell Physiol, 1996, 37(1): 17-122.)。生物体中ACCase有2种 类型。 一种ACCase称为同质型(Homomeric)，亦称多功能或真核型，存在于动物、酵母、藻 类及植物的胞质溶胶中，具有一个相对分子量为220 260的生物素包含亚基。另一种是异质 型(Heteromeric)，也称多亚基或原核型ACCase，存在于细菌及双子叶植物和非禾本科单子 叶植物的细胞质中。异质型ACCase包含4个亚基，即生物素羧化酶(Biotin carboxylase, BC)、生物素羧基载体蛋白(Biotin carboxyl Carrier Protein, BCCP)以及羧基转移酶的 2个亚基a -CT和0 -CT，其中前2个亚基组成BC和BCCP域，后2个亚基构成CT催化域。 这四个亚基中CTP较为特殊，它是由叶绿体基因组中的基因编码的(谢禄山，谭晓风.乙酰 辅酶A羧化酶基因研究综述[J].中南林学院学报，2005， 25(4): 89-95.)。而在禾本科植物 中，该基因或者已被短截，仅残存一个短的C端区域，如水稻，或者完全缺失，如小麦。目 前己从拟南芥、烟草、豌豆、油菜、大豆、马铃薯等多种植物中获得P-CT基因(Ji nshanK， Tuan-nan Wen. Coordinate regulation of the nuclear and plastidicgenes coding for the subunits of the heteromeric acetyl-coenzyme a carboxylase l[J]. Plant Physiology, 2000， 122: 1057-1071; Sang Sook Lee， Won Joong Jeong. Characterization of the plastid-encoded carboxyltransferase subunit (accD) gene of potato[J]. Cell, 2004， 117: 422-429.)。但花生中尚没有此基因的相关报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶P亚
基基因及其编码的蛋白质与克隆方法。使该基因在花生中获得高表达，以改良花生的品质。本发明的花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶0亚基基因，其序列由SEQ ID NO. 1中从 核苷酸第92 — 1570位的核苷酸序列构成。所述基因来自花生C4rac力^ Zy77o《sea)，命名为 爿力C7^基因。
本发明第二个目的是提供所述基因编码的蛋白质，其具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的 氨基酸序列。所述蛋白质命名为^/CT^蛋白质
同时，本发明还提供所述基因的克隆方法，包括如下步骤
(1) 提取花生叶片中的总RNA;
(2) 以获得的总RNA为模板反转录合成5，-和3， -RACE-Ready cDNA;
(3) 根据NCBI数据库中的EST信息设计5'和3'端cDNA片段引物
(4) 利用SMARTTM RACE Amplification Kit (Clontech)扩增乙酰辅酶A羧化酶羧基 转移酶e亚基基因5'和3'端基因片段，并将扩增产物回收后筛选阳性克隆；
(5) 对筛选到的阳性克隆进行序列分析，获得花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶P亚基 基因片段；
(6) 将测得的花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶e亚基基因片段序列及5'和3'端序 列进行拼接后得到花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶e亚基全长基因序列；
(7) 根据拼接得到的全长基因序列设计全长基因的扩增引物并进行扩增；
(8) 将扩增后的产物筛选阳性克隆，对筛选到的阳性克隆进行序列分析，获得花生乙酰 辅酶A羧化酶羧基转移酶0亚基基因的全长基因。
乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶3亚基是II类ACCase多肽复合物的一个亚基。该酶活性 的提高可以增强II类ACCase复合物的装配，有利于提高花生种子的含油量。本发明公开的花 生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶P亚基U力CT")基因的核苷酸序列及其编码的蛋白序列以 及基因克隆方法，可广泛应用于花生品质的改良、花生的栽培和培养，尤其是花生作为油料 作物的开发和利用等领域。
图1是本发明的蛋白质结构域示意图； 图2是本发明的蛋白质预测的三级结构。
具体实施例方式
下面结合具体实例对本发明作进一步详细的描述。
实施例1克隆花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶P亚基(A^T")基因(1) 选用E12花生叶片作为实验材料，采用Pbiozol植物组织RNA提取试剂盒提取花生 叶片中的总RNA。 RNA含量及质量可采用琼脂糖凝胶电泳检测。
(2) 以获得的总RNA为模板，采用SMARTTM RACE Amplification Kit (Clontech)，反 转录合成5'-和3， -RACE-Ready cDNA。
(3) 根据NCBI数据库中的EST信息设计5，和3，端cDNA片段引物 GSP1: 5，- CCCGTTTAGTTGACCTGTGCCTGTTT -3'
GSP2: 5' - CATCTCCTACTACTGGGGGGGTGAC -3'
(4) 利用SMARTTM RACE Amplification Kit (Clontech)扩增乙酰辅酶A羧化酶羧基 转移酶e亚基基因5'和3'端基因片段，并将扩增产物回收后与pMD18-T simple vector
(Takara)连接，连接产物转化￡ c^i Top IO感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆。
(5) 筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶 P亚基基因片段。
(6) 将测得的花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶0亚基基因片段序列及5'和3'端序 列进行拼接后得到花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶P亚基全长基因序列；
(7) 根据拼接得到的全长基因序列设计全长基因的扩增引物并进行扩增，其中，引物为 BCT-5: 5'- TGGTAATAGAGGAAAAACTC -3'
BCT-3: 5'- AATCTTTTAAGTTCTGCTAAAT -3'
扩增反应如下94。C预变性3min， 94'C变性30s， 50。C复性30s， 72。C延伸lmin， 30个 循环后，72 °C 10min;
(8) 将扩增后的产物筛选阳性克隆，对筛选到的阳性克隆进行序列分析，获得花生乙酰 辅酶A羧化酶羧基转移酶0亚基基因的全长基因。
实施例2屈CT"蛋白质的序列信息与特性分析
本发明的力力C7^基因长1636bp，其开放阅读框为1479bp，位于92-1570bp处。BioXM 软件分析表明J力C7"共编码492个氨基酸。根据PR0SITE数据库分析花生力力CT"基因编码 的492个氨基酸，发现此序列含一个CTe活性位点，位于250-469aa，如图l所示。用Protparam 预测编码蛋白的物理化学性质，推测分子式为C2464H3796N6M0775S27，分子量为55846.7，等电点为 5.14，理论推导半衰期为30h，不稳定参数是48.68，属于不稳定蛋白。该蛋白中含量相对较 多的氨基酸是Ser (11.8%), Gly (7.1%), Glu (7.5%)， Leu (8.5%), Asn (6.9%);该蛋白 中不含Pyl和Sec。总的带正电荷的残基为(Arg + Lys) : 47;总的带负电荷的残基为(Asp + Glu) :64。该蛋白亲水性平均数为-0. 446，预测该蛋白为疏水性蛋白。采用SigrmlP 3. 0 Server进行信号肽预测，表明该蛋白不含信号肽序列，为非分泌性蛋白。以Tmpred网站为基础的跨 膜结构预测表明该蛋白含3个跨膜信号区。
采用在线HNN网站预测花生AhCTP蛋白的二级结构，表明该蛋白含有29.47%的a-螺 旋，18.90%的e-折叠以及51.63%的无规则巻曲。利用3D-JIGSAW预测花生AhCT e蛋白三级 结构，结果表明该蛋白呈紧密的球状结构，如图2所示。
本发明涉及的序列及记号分列如下: (l)SEQ ID NO. 1的信息
(i) 序列特征
(A) 长度:1636bp
(B) 类型核苷酸
(C) 链性单链
(D) 拓扑结构线性
(ii) 分子类型核苷酸
(iii) 序列描述SEQ ID NO. 1
(2)SEQ ID NO. 2的信息
(i) 序列特征:
(A) 长度:492 aa
(B) 类型氨基酸
(C) 链性单链
(D) 拓扑结构线性
(ii) 分子类型蛋白质
(iii)序列描述:SEQ ID NO. 2序列表
〈110〉山东省花生研究所
〈120>花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶P亚基基因及其编码的蛋白质与克隆方法
〈歸 2
<170> Patentln version 3.3
<210〉 1
〈211〉 1636
〈212〉 腿
〈213> 花生(Arachis hypogaea)
〈220>
<221> CDS
<222〉 (92).. (1570)
<400> 1
acgcggggaa tattctatat ttatgtttaa tgatttttct tcgaatgact attcatctat 60
tgtattttaa tggtaataga ggaaaaactc t atg gaa aaa ggg tgg ttc aat 112
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304
att aga aat ttc eta tct gat aaa att ctt tta gtt agg gat aac aat 352 lie Arg Asn Phe Leu Ser Asp Lys lie Leu Leu Val Arg Asp Asn Asn 75 80 85age cga agg aac cgt tat tec ata tat ttt gat att gaa aat caa ttt 400 Ser Arg Arg Asn Arg Tyr Ser lie Tyr Phe Asp lie Glu Asn Gin Phe 90 95 100
ttg gag att tct aat gat cct tct ttt eta agt gaa cca gaa agt ctt 448 Leu Glu lie Ser Asn Asp Pro Ser Phe Leu Ser Glu Pro Glu Ser Leu 105 110 115
ttt gat agt tat aat aag aat tct age tat ctg犯t犯t gtc tct犯g 496 Phe Asp Ser Tyr Asn Lys Asn Ser Ser Tyr Leu Asn Asn Val Ser Lys 120 125 130 135
aga cac gag aat cat tac atg tat gat act aaa teg agt tgg aaa aat 544 Arg His Glu Asn His Tyr Met Tyr Asp Thr Lys Ser Ser Trp Lys Asn 140 145 150
ggc att cat犯t tgc att gaa agt tat ctt cgt tct caa ate tgt att 592 Gly lie His Asn Cys lie Glu Ser Tyr Leu Ai'g Ser Gin工le Cys lie 155 160 165
gtt agt cac att tta ggt gaa agt gat aaa tac ast gac agt tac ttt 640 Val Ser His lie Leu Gly Glu Ser Asp Lys Tyr Asn Asp Ser Tyr Phe 170 175 180
tat act tct att tgt ggt gag ggc gga aat agt agt gaa age gag ggt 688 Tyr Thr Ser lie Cys Gly Glu Gly Gly Asn Ser Ser Glu Ser Glu Gly 185 190 195
tct tec ata aaa aca act ate acg aat gag aat tta act aaa aga> gag 736 Ser Ser lie Lys Thr Thr lie Thr Asn Glu Asn Leu Thr Lys Arg Glu 200 205 210 215
gat tct aaa gat etc gat gaa act caa aaa tac aag cat tta tgg att 784 Asp Ser Lys Asp Leu Asp Glu Thr Gin Lys Tyr Lys His Leu Trp lie 220 225 230
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aaa atg aat att tgt gaa cac tgt gga tat cat ttg aaa stg age agt 880 Lys Met Asn lie Cys Glu His Cys Gly Tyr His Leu Lys Met Ser Ser 250 255 260
tea gat aga ate gaa ctt ttg att gat cca ggt act tgg aat cct atg 928Ser Asp Arg lie Glu Leu Leu lie Asp Pro Gly Thr Trp Asn Pro Met 265 270 275
gat gaa gac atg gtc tct atg gat ccc att gaa ttt cat teg gaa gag 976 Asp Glu Asp Met Val Ser Met Asp Pro lie Glu Phe His Ser Glu Glu 280 285 290 295
gaa tec gaa tec tat aag aat cgt atg gac tct tat caa aga肪g aca 1024 Glu Ser Glu Ser Tyr Lys Asn Arg Met Asp Ser Tyr Gin Arg Lys Thr 300 305 310
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<210〉 2
〈211〉 492
<212> PRT
〈213〉 花生
〈400> 2
(Arachis hypogaea)
Met Glu Lys Gly Trp Phe Asn Ser Met Leu Phe Tyr Arg Gin Leu Lys
1
5 10
15
Tyr Arg Cys Gly Leu Ser Asn Ser Met Asp Ser Phe Gly Pro Val Glu
20 25
30
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35
40 45
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50
55 60
Tyr Leu Val Gly Val Arg Asn lie Arg Asn Phe Leu Ser Asp Lys lie
65
70 75
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Leu Leu Val Arg Asp Asn Asn Ser Arg Arg Asn Arg Tyr Ser lie Tyr
85 90
95
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Leu Ser Glu Pro Glu Ser Leu Phe Asp Ser Tyr Asn Lys Asn Ser Ser 115 120 125
Tyr Leu Asn Asn Val Ser Lys Arg His Glu Asn His Tyr Met Tyr Asp 130 135 140
Thr Lys Ser Ser Trp Lys Asn Gly lie His Asn Cys lie Glu Ser Tyr 145 150 155 160
Leu Arg Ser Gin lie Cys lie Val Ser His lie Leu Gly Glu Ser Asp 165 170 175
Lys Tyr Asn Asp Ser Tyr Phe Tyr Thr Ser lie Cys Gly Glu Gly Gly 180 185 190
Asn Ser Ser Glu Ser Glu Gly Ser Ser lie Lys Thr Thr lie Thr Asn 195 200 205
Glu Asn Leu Thr Lys Arg Glu Asp Ser Lys Asp Leu Asp Glu Thr Gin 210 215 220
Lys Tyr Lys His Leu Trp lie Glu Cys Glu Asn Cys Tyr Gly Leu Asn 225 230 235 240
Tyr Arg Lys Phe Phe Lys Ser Lys Met Asn lie Cys Glu His Cys Gly 245 250 255
Tyr His Leu Lys Met Ser Ser Ser Asp Arg lie Glu Leu Leu lie Asp 260 265 270
Pro Gly Thr Trp Asn Pro Met Asp Glu Asp Met Val Ser Met Asp Pro
11275
280
285
lie Glu Phe His Ser Glu Glu Glu Ser Glu Ser Tyr Lys Asn Arg Met 290 295 300
Asp Ser Tyr Gin Arg Lys Thr Gly Leu Thr Glu Ala Val Gin Thr Gly 305 310 315 320
Thr Gly Gin Leu Asn Gly lie Pro Val Ala lie Gly lie Met Gly Phe 325 330 335
Gin Phe Met Gly Gly Ser Met Gly Ser Val Val Gly Glu Lys lie Thr 340 345 350
Arg Leu Val Glu His Ala Gly Asn Gin Leu Leu Pro Leu lie Leu Val 355 360 365
Cys Ala Ser Gly Gly Ala Arg Met Gin Glu Gly Ser Leu Ser Leu Met 370 375 380
Gin Met Ala Lys lie Ser Ser Ala Leu Tyr Glu Tyr Gin Lys Asn Lys 385 390 395 400
Arg Leu Phe Tyr Val Ser lie Leu Thr Ser Pro Thr Thr Gly Gly VaJ 405 410 415
Thr Ala Ser Phe Gly Met Leu Gly Asp lie lie lie Ala Glu Pro Asp 420 425 430
Ala Tyr lie Ala Phe Ala Gly Lys Arg Val lie Glu Gin Thr Leu Asn 435 440 445
Thr Thr lie Pro Glu Gly Ser Gin Val Ala Glu Tyr Leu Phe Gin Lys 450 455 460Gly Leu Phe Asp Ser lie Val Pro Arg Asn Pro Leu Lys Gly Val Leu 465 470 475 480
Ser Glu Leu Phe Gin Uu His Ala Phe Phe Pro Leu 485 490
权利要求
1.一种花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶β亚基基因，其特征在于所述基因序列由SEQ IDNO.1中从核苷酸第92-1570位的核苷酸序列构成。
2. 根据权利要求l所述的花生乙酰辅酶A羧化酶生物素羧化酶e亚基基因，其特征在于所 述基因编码的蛋白质具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3. —种花生乙酰辅酶A羧化酶生物素羧化酶e亚基基因的克隆方法，包括如下步骤(1) 提取花生叶片中的总RNA;(2) 以获得的总RNA为模板反转录合成5，-和3， -RACE-Ready cDNA;(3) 根据NCBI数据库中的EST信息设计5'和3，端cDNA片段引物；(4) 利用SMARTTM RACE Amplification Kit (Clontech)扩增乙酰辅酶A羧化酶羧基 转移酶0亚基基因5'和3'端基因片段，并将扩增产物回收后筛选阳性克隆；(5) 对筛选到的阳性克隆进行序列分析，获得花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶e亚基 基因片段；(6) 将测得的花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶P亚基基因片段序列及5'和3'端序 列进行拼接后得到花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶0亚基全长基因序列；(7) 根据拼接得到的全长基因序列设计全长基因的扩增引物并进行扩增；(8) 将扩增后的产物筛选阳性克隆，对筛选到的阳性克隆进行序列分析，获得花生乙酰 辅酶A羧化酶羧基转移酶P亚基基因的全长基因。
全文摘要
本发明公开了一种花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶β亚基基因及其编码的蛋白质与克隆方法。所述基因序列由SEQ ID No.1中从核苷酸第92-1570位的核苷酸序列构成；所述基因编码的蛋白质具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明公开的花生乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶β亚基(AhCT β)基因的核苷酸序列及其编码的蛋白序列以及基因克隆方法，可广泛应用于花生品质的改良、花生的栽培和培养，尤其是花生作为油料作物的开发和利用等领域。
文档编号C12P19/00GK101550421SQ200910119550
公开日2009年10月7日 申请日期2009年3月13日 优先权日2009年3月13日
发明者和亚男, 曹玉良, 杨庆利, 潘丽娟, 禹山林, 迟晓元 申请人:山东省花生研究所