专利名称：一种新型甲型流感病毒h1n1亚型双色荧光pcr检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本试发明涉及检测新型甲型流感病毒Hmi亚型(IAV-HlNl)以及甲型流感病毒各 亚型(IAV-U)mRNA的方法，特别是涉及使用双色荧光探针定量PCR技术(PCR-双色荧光探 针法)快速准确的检测出样品(包括咽拭子标本、血清、分泌物及病死动物肺脏组织等标 本)中新型甲型流感病毒Hmi亚型以及甲型流感病毒各亚型mRNA的方法。本发明进一步 涉及用于该病毒临床检测的试剂盒。
背景技术：
新型甲型流感病毒Hmi亚型是引起猪流感(Swine Influenza, Si)的主要病原 体，该种疾病是一种急性、人畜共患呼吸道传染性疾病。1931年分离并鉴定了第一株甲型 流感病毒Hmi亚型。1976年，经典的甲型流感病毒Hmi亚型首次从意大利北部猪场中分 离到，这些病毒分离株与当时流行于美国的经典的猪流感有非常近的相关性。同年在美国 约500人感染了甲型流感病毒Hmi亚型，该病毒与当时从猪体内分离的病毒相同，首次证 实了在自然条件下，猪流感病毒可从猪传播给人。国内报道多为Hmi和H3N2导致猪流感。 近年来，世界各地都有人感染猪流感病毒病不同毒株特别是Hmi亚型的报道，但并没有大 规模流行。但是2009年4月份以来墨西哥及美国等国家地区暴发了人感染甲型流感病毒的 疫情。随后，该疫情迅速在世界范围内蔓延，短时间内，墨西哥、美国、加拿大、瑞士、奥地利、 秘鲁、西班牙、英国、澳大利亚、韩国等国家和地区陆续有人感染甲型流感病毒疫情发生，不 到一个月内，全球确诊病例和疑似累计几千例，死亡几百例，爆发之快，发展之迅速，令世人 震惊和恐惧，世界卫生组织2009年4月29日将流感警戒级别上调至第五级，表明大流行迫 在眉捷。对此疫情，我国卫生部和相关部门高度重视，已经采取相应应对措施，包括疫情预 防控制和病原检测。全国各大疾病预防控制中心、各省级疾病预防控制中心、医院、各级出 入境检验检疫局和各级动物疫病控制中心对此高度重视。根据世界卫生组织研究证实，墨西哥和美国等地区发生的人感染猪流感病毒为新 型甲型流感病毒Hmi亚型毒株，该毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基 因片断，是一种新型流感病毒。人感染后的临床早期症状与流感类似，有发烧、咳嗽、疲劳、 食欲不振等，还可以出现腹泻或呕吐等症状。病情可迅速进展，突然高热、肺炎，重者可以出 现呼吸衰竭、多器官损伤，导致死亡。新型甲型流感病毒Hmi亚型属于于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感 病毒属(Influenza virusA)。病毒颗粒呈球状，直径为80nm 120nm，有囊膜。病毒由8个 分节段的单股负链RNA组成，病毒蛋白质含有5种多肽，即血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白、 核蛋白和多聚酶。目前对于该种新型甲型流感病毒Hmi亚型以及甲型流感病毒的实验室检查主要 包括以下方面1.外周血象白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低；2.血清学诊断可使用间接ELISA、抗原捕捉ELISA、荧光免 疫法等；3.逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) ；3.病毒分离从患者呼吸道标本中(咽拭 子、口腔含漱液、鼻咽或气管吸出物、痰或肺组织等)分离并培养该病毒。但是确诊依赖于 从呼吸道标本或血清中分离到特定病毒；RT-PCR对上述标本检测，有病毒RNA存在，并要经 过测序证实。以上主要分为两类方法免疫学检测方法和核酸检测方法。免疫学方法主要 是检测血清中是否存在新型甲型流感病毒Hmi亚型病毒的特异性抗体，具体是用ELISA的 方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且 鉴于流感病的的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出 现假阳性和假阴性。从标本中分离猪流感病毒，进行鸡胚接种和细胞培养可能会比较敏感， 但是这种方法需要2-3周的时间，操作程序上比较繁琐，不宜在所有检测实验特别是一些 基层实验室，比如医院、疾病预防控制中心、检验检疫中心以及动物疫病控制中心推广。另 有普通PCR进行新型甲型流感病毒Hmi亚型核酸检测的方法比如反转录-聚合酶链式反 应(RT-PCR)，虽然具灵敏度比上述方法略有提高，但是这种方法仅是基于用一对核酸引物 进行扩增，结果容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR 扩增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作繁琐。荧光定量PCR技术其原理是在常规PCR扩增系统中加入一段与靶基因特异互补的 荧光标记探针。探针的5'端标记有报告基团，如FAM、VIC等，3'端标记有荧光淬灭基团， 如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不 到荧光信号。随着PCR扩增的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针就会将探 针切断产生荧光信号。用荧光检测仪检测荧光值的变化，即可准确判定扩增产物的量。荧 光定量PCR方法就是根据此原理。在PCR过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的 变化。当信号增强到某一阈值，此时的循环次数(用循环阈值Ct表示)就被记录下来。CT 值和PCR体系中起始模板的对数之间有着严格的线性关系，利用各梯度阳性定量标准品扩 增的Ct和定量模板数经对数拟合作图制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值就可以准确 定出起始模板核酸的数量。双色或多色荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增两 个或者多个目的基因，而每个目的基因采用的不用波长的荧光探针进行检测。荧光标记的 探针有多种，比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产 生的荧光信号不同。利用该原理发明的试剂盒在同一个标本的检测中，不但可以检测新型 甲型流感病毒Hmi亚型(IAV-Hmi)，还可以检测流感病毒各亚型(iav-u)，实现了一个标 本中同时检测新型甲型流感病毒Hmi亚型和甲型流感病毒各亚型的功能，达到实时精确 检测并对病毒进行分型的目的，应用极为方便。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光 探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性 不高容易漏诊和误诊的问题。
发明内容
本发明提供了检测新型甲型流感病毒Hmi亚型和甲型流感病毒各亚型mRNA的方 法，特别是提供了一种使用双色荧光定量PCR技术(PCR-双色荧光探针法)快速准确的检 测出样品(包括咽拭子标本、血清、分泌物及病死动物肺脏等标本)中新型甲型流感病毒HlNl亚型或者甲型流感病毒各亚型mRNA的方法。本发明进一步提供了用于该类病毒疑似 病人临床快速准确检测的试剂盒。目前针对该种新型甲型流感病毒Hmi亚型所致疾病实验室检查主要包括血清学 诊断中的间接ELISA、抗原捕捉ELISA、荧光免疫法等，核酸检测方法如逆转录-聚合酶链式 反应(RT-PCR)，.病毒分离和接种法等。但是这几种方法有分别有灵敏度和特异性差，容易 出现假阳性和假阴性的不足，甚至有些检测方法过程繁琐耗时较长，难以达到快速准确检 测的目的。为了克服现有检测技术中的缺陷和不足，本发明提供了一种使用双色荧光定量 PCR技术(PCR-双色荧光探针法)快速准确的检测出样品(包括咽拭子标本、血清、分泌物 及病死动物肺脏等标本)中新型甲型流感病毒Hmi亚型以及甲型流感病毒各亚型的mRNA 的方法。该方法包括(1)采集和运送感染或疑似病人样本(包括咽拭子标本、血清、分泌 物及病死动物肺脏等)；(2)样本预处理和提取RNA ； (3) 一步PCR-双色荧光探针体外扩增 法对样本进行检测合成特定引物和荧光探针，用双色荧光定量PCR反应技术并用新型甲 型流感病毒Hmi亚型PCR反应液(PCR MIX)对样本进行扩增检测；(4)扩增反应结束后根 据每个扩增反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中新型甲型流感 病毒Hmi亚型以及甲型流感病毒各亚型的存在并根据阳性质控品对其标本中的病毒进行 定量检测。检测新型甲型流感病毒Hmi亚型的特定寡核苷酸弓I物和荧光探针位于该型病毒 各亚型的变异区，与其他亚型基因序列没有同源性，对Genbank上所有发表的甲型流感病 毒Hmi亚型(包括新型甲型流感病毒Hmi亚型)病毒基因序列，经过生物新信息学分析， 甲型流感病毒的八个基因片段中血凝素(HA)的变异性最大，新型甲型流感病毒Hmi亚型 的HA基因某些区域与其它甲型流感病毒明显不同，其中很多基因序列发生变异和重组。经 过比对，选择如下区域作为扩增新型甲型流感病毒Hmi亚型特异性目标区域GGTACGGTTA TCACCATCA AAATGAGCAGG GGTCA GGATAGCAGCCGACC TGAAGAGCAC ACAGAATGCC ATTGACGAG A TTACTAAC(SEQ ID NO. 1)引物和探针序列如下(1)新型甲型流感病毒Hmi亚型上游引物5，-GGTACGGTTATCACCATCAAAA-3，(SEQ ID NO. 2)(2)新型甲型流感病毒Hmi亚型下游引物5，-GTTAGTAATCTCGTCAATGGCATT-3，(SEQ ID NO. 3)(3)新型甲型流感病毒Hmi亚型荧光探针5’-FAM-ATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACA-TAMRA-3’ (SEQ ID NO. 4)经过生物信息学分析，甲型流感病毒的八个基因片段中基质(M)基因的变异性 最小。经过比对，选择如下区域作为扩增甲型流感病毒各亚型也即甲型流感病毒通用型 (IAV-U)特异性目标区域TGTGCCACTT GTGAACAGAT TGCTGATTCA CAGCATCGGTCTCACAGACA GATGGCTACT ACCACCAATC CACTAATCAG GC(SEQID NO. 5)(4)甲型流感病毒通用型上游引物5，-TGTGCCACTTGTGAACAGATTG-3，(SEQ ID N0. 6)
(5)甲型流感病毒通用型下游引物5，-GCCTGATTAGTGGATTGGTG-3，(SEQ ID NO. 7)(6)甲型流感病毒通用型荧光探针5’-VIC-TGATTCACAGCATCGGTCTCACAGAC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO. 8)根据本发明的一个优选实施方案，其中所说检测病毒即为世界卫生组织2009年4 月公布的一种引起许多国家和地区流感疫情的新型甲型流感病毒Hmi亚型。该毒株包含 有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片断，是一种变异了的新型甲型流感病毒。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的样本来自被检者咽拭子标本、血清、 分泌物及病死动物肺脏等。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的样本处理过程使用的是一种病毒浓 缩液试剂并经过高速离心从而可以获得浓缩后的病毒颗粒。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的提取RNA使用的是一种Trizol reagents RNA提取液对样本充分处理。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的检测新型甲型流感病毒Hmi亚 型的特异性基因为血凝素(HA)基因，检测甲型流感病毒各亚型(甲型流感病毒通用型 (IAV-U))的特异性基因为基质蛋白(M)基因。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的双色荧光标记是指检测新型甲型流 感病毒Hmi亚型(IAV-HlNl)血凝素(HA)基因的探针的荧光标记为FAM，检测检测甲型 流感病毒各亚型(甲型流感病毒通用型(IAV-U))基质蛋白(M)基因的探针的荧光标记为 VIC，淬灭基团为TAMRA。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的新型的甲型流感病毒Hmi亚型双 色荧光定量PCR反应体系(PCR MIX)是由新型甲型流感病毒Hmi亚型(A-HlNl)特异性 上游和下游引物、一条特异性荧光探针(Fam荧光标记)、甲型流感病毒通用型(IAV-U)的 特异性上游和下游引物、一条特异性荧光探针(VIC荧光标记)、荧光定量PCR反应缓冲液 (FQ-Buffer,内含镁离子、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体(dNTPs)、PCR扩增增强剂和去离 子水等成分构成的反应体系。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的的扩增过程是在一种多通道并实时 检测荧光信号的的荧光定量扩增装置上进行的。本发明的另一个目的是提供一种用于快速检测新型的甲型流感病毒Hmi亚型 (IAV-HlNI)的试剂盒，该试剂盒包括(1)病毒核酸提取试剂；(2)逆转录酶系和Taq酶系； (3)新型甲型流感病毒Hmi亚型双色荧光PCR反应体系(PCRMIX) ； (4)新型甲型流感病毒 HlNl亚型阳性和阴性质控品。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的新型甲型流感病毒Hmi亚型阳性 质控品是指89bp的扩增片段经过克隆连接到T载体上构成的重组质粒，经过严格定量，其 浓度为107COpieS/ml。阳性质控、新型甲型流感病毒Hmi亚型(IAV-HlNl)、甲型流感病毒 普通定性PCR的扩增结果见图1。对阳性质控品进行梯度稀释，其扩增的标准曲线和动力学 曲线如图2和3。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说试剂盒由于采用的是双色荧光探针 PCR技术，不但可以检测新型甲型流感病毒Hmi亚型，还可以对甲型流感病毒各亚型进行检测，即所谓的甲型流感病毒通用型(IAV-U)的检测。也就是说本试剂盒的每份试剂一次 检测就同时具有检测两种病毒的能力。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的快速实时定量检测是通过一步 PCR-双色荧光探针体外扩增法同时对新型甲型流感病毒Hmi亚型(IAV-HlNI)和甲型流感 病毒通用型(IAV-U)RNA进行扩增并进行定量检测，无需专门的逆转录反应过程，简化了检 测流程节省了检测时间。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的荧光定量扩增装置可以是ABIPRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖)、ABI RISM7300/7500 (使用 8 联管)、MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器，也可以是LightCycler等使用毛 细管的仪器，根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的结果判断要满足阳性质控品扩增结 果的Ct值均应小于30，且呈标准S型扩增曲线。否则，此次试验视为无效，全部试验应重新 进行。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的结果分析时需要使用手动调整阈值 使阴性质控品Ct值在40以上，Ct值小于35个循环的为阳性；Ct值在35-40个循环之间， 为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct值仍然在35-40个循环之间，判断为阳 性，没有荧光值增长为阴性。为了完成本发明的方法，首先采集标本放在离心管中，密闭送检。然后取500μ1 样品液加入500 μ 1病毒浓缩液充分震荡，4°C冷冻离心机13，OOOrpm离心lOmin，去上清， 保留50 μ 1左右的样品液体，加入500 μ 1 Trizol reagents (RNA提取液)充分震荡，室温 放置5min。对于血清或血浆等，取500 μ 1血清加入500 μ 1病毒浓缩液充分震荡，4°C冷 冻离心机13，OOOrpm离心lOmin，去上清，保留50 μ 1左右的样品液体，加入500ul Trizol reagents (RNA提取液)充分震荡，室温放置5min。对于肺脏等组织等，取50mg左右组织用 玻璃勻浆器勻浆或剪刀剪碎，加入500 μ 1 Trizol reagents (RNA提取液)，研磨或振荡，转 移到1. 5mL的EP管中，室温放置5min。然后加入IOOul氯仿，用力震荡15s，室温静置5min， 4°C 13，OOOrpm离心lOmin。小心将上层水相转移到干净离心管中，加等体积异丙醇，充分混 勻，13，OOOrpm离心IOmin0弃上清，加入500 μ 1 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13，OOOrpm 离心lOmin，小心吸去大部分乙醇。将提取管敞口在室温空气中干燥5min待乙醇挥发干净， 用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀。根据根据本发明的再一个优选实施方案，取出新型甲型流感病毒Hmi亚型-PCR 反应液(PCRMIX，内含有扩增用的引物探针和离子等)、Taq酶系、逆转录酶系，室温融化并 振荡混勻后，10，OOOrpm离心10s。每个测试反应体系配制如下表 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净0.2ml离心管中，充分混勻， 10，OOOrpm离心10s，向设定每个PCR反应管中分别加入22 μ 1，向每管中加入处理后样品 (提取的RNA)、阳性质控品和阴性质控品3 μ 1，10，OOOrpm瞬时离心10秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阳性质控品、阴性质控品以及未知标本，并设 置样品名称和标记荧光基团种类(报告基团设置为FAM和VIC、淬灭基团TAMRA)。
根据本发明的再一个优选实施方案，用于扩增的条件为ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp7000 (需要剪掉反应盖)、ABI PRISM 7300/7500 (使用 8 联管)、 MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器，循环条件42°C—20分钟，然后93°C—2 分钟，然后93°C 30秒一550C 45秒，检测荧光信号，40个循环。LightCycler等使用毛细管 的仪器循环条件42°C— 20分钟，93°C— 2分钟，然后93°C 5秒一58°C 45秒，检测荧光 信号，共40个循环。反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品Ct值在40以上，Ct值 小于35个循环的为阳性；Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试 验之后，如果Ct值仍然在35-40个循环之间，判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。判断结 果时要注意以下问题阴性质控品应为全部阴性；新型甲型流感病毒Hmi亚型-阳性质控 品，阳性质控品的Ct值均应小于30，且呈标准S型扩增曲线。以上条件应同时满足，否则此 次试验视为无效全部试验应重新进行。 本发明的试剂盒主要用于检测一种新型甲型流感病毒Hmi亚型以及甲型流感病 毒各亚型，前者是一种新的变异株病毒，它整合了猪流感病毒、禽流感病毒和人流感病毒的 基因片段，是一种新的重组的病毒，它导致了 2009年四月世界范围内流感疫情的爆发。本 发明的试剂盒整个检测过程包括提取样品中甲型流感病毒Hmi亚型mRNA、一步法双色荧 光定量PCR检测病毒mRNA，以及结果的分析等步骤。为了完成这些步骤，本发明的试剂盒 又可分为病毒核酸提取试剂和双色荧光定量PCR反应试剂两个部分。其中，前者主要包括 病毒浓缩液和RNA提取液等，后者主要包括PCR 10乂(14 11各引物和探针、20(^11(1^1\501111 Tris-HCl (ρΗ8· 3)、3· 5mM MgC12、50mM KCl、25mM(NH4) 2S04 等)、逆转录酶、耐热 Taq 酶、阳 性质控品、阴性质控品和DEPC处理过的水等。本发明的试剂盒经过多次不同的重复实验验证证实，本试剂盒具有较好的重复 性、特异性和稳定性的性能和优点。本发明的方法中，由于使用了针对新型甲型流感病毒Hmi亚型以及甲型流感病 毒各亚型核酸序列所设计的引物和双色荧光探针扩增特异性基因片段，不但可以检测新型 甲型流感病毒Hmi亚型，同时还可以检测流甲型感病毒各亚型，从而实现了一个标本中同 时对新型甲型流感病毒Hmi亚型和甲型流感病毒各亚型同时实时精确检测的目的，应用 极为方便。由于该方法引入了特异性扩增引物和双色荧光探针，使得检测具有更好的灵敏 度和特异性，从而避免了其他检测方法特异性不高的问题。同时本发明引入了阳性标准品 作为实验的对照和定量标准，对新型甲型流感病毒Hmi亚型及甲型流感病毒各亚型的RNA 进行快速检测并定量。另外一个方面，本发明使用了一步法荧光定量PCR扩增技术，简化了 试验过程提高了检测效率。一般来说，从处理样本到结果的判断仅需要2小时左右。所以 与传统方法相比，本发明具还具有有操作简单、快速方便的优点。因此，本发明的试剂盒为 临床标本的快速检测和大样本普查提供了新的方法，并为疑似病人的筛查使用提供了可靠 的方法学依据。
四
图1显示常规PCR扩增特异性片段，2%的琼脂糖凝胶电泳，经PCR扩增后，其扩增产物经2 %的琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下观察，可看到与目的片段大小一致的电泳条带，从 左到右依次是分子量Marker、阳性对照、IAV-Hmi特异性扩增片段、IAV-U特异性扩增片 段、阴性对照。图2显示阳性定量标准模板PCR扩增电泳图，右侧泳道为DNA分子量Marker ； 从0到6依次对应=IOciUO1UO2UO3UO4UO5UO6稀释的阳性质控品扩增产物；图3显示阳 性质控品标准模板扩增动力曲线，梯度稀释；图4为阳性质控品标准曲线。
五具体实施例方式实施例1 标本采集适用样品类型包括咽拭子标本、血清、分泌物及病死动物肺脏等。首先，对于咽拭 子标本，需要采集病人发病3日内的咽拭子标本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和 两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有1 2ml保存液(维持液或生理盐 水)的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密闭送检；对于血清，无菌条件下 取疑似病人外周静脉血3ml，转至5ml干燥管中，室温静置30min，3000g离心5min，取Iml 血清转至1. 5ml洁净的离心管中，密闭送检。对于标本的保存，标本短期内可保存于-20°C， 长期保存可置-70°C，但不能超过6个月，标本运送应采用0°C冰壶，采集标本应立即(12h 内)送达检测。实施例2 甲型流感病毒mRNA的提取对于咽拭子等样品，取500 μ 1样品液加入500μ 1病毒浓缩液充分震荡，4°C冷冻 离心机13，OOOrpm离心lOmin，去上清，保留50 μ 1左右的样品液体，加入500 μ ITrizol reagents (RNA提取液)充分震荡，室温放置5min。对于血清或血浆等，取500 μ 1血清加 入500 μ 1病毒浓缩液充分震荡，4°C冷冻离心机13，OOOrpm离心lOmin，去上清，保留50 μ 1 左右的样品液体，加入500ul Trizol reagents (RNA提取液)充分震荡，室温放置5min。 对于肺脏等组织等，取50mg左右组织用玻璃勻浆器勻浆或剪刀剪碎，加入500 μ 1 Trizol reagents (RNA提取液)，研磨或振荡，转移到1. 5mL的EP管中，室温放置5min。然后加入 IOOul氯仿，用力震荡15s，室温静置5min，4°C 13，OOOrpm离心lOmin。小心将上层水相转移 到干净离心管中，加等体积异丙醇，充分混勻，13，OOOrpm离心lOmin。弃上清，加入500 μ 1 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13，OOOrpm离心lOmin，小心吸去大部分乙醇。将提取管敞口 在室温空气中干燥5min待乙醇挥发干净，用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀。实施例3 用本试剂盒检测新型甲型流感病毒Hmi亚型(IAV-HlNl)和甲型流感 病毒各亚型(IAV-U)取出甲型流感病毒Hmi亚型双色荧光PCR MIX、Taq酶系，逆转录酶系，室温融化 并振荡混勻后，10，OOOrpm离心10s。每个测试反应体系配制如下，PCRMIX 20μ l，Taq酶系 和逆转录酶各lul，计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净0. 2ml离心管中，充分混 勻，10, OOOrpm离心10s，向设定的PCR反应管中分别加入22 μ 1，向每管中加入处理后样品 (提取RNA)或IAV-阳性质控品和阴性质控品3 μ 1，10，OOOrpm瞬时离心10秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品，阳性质 控品以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团种类(报告基团FAM和VIC猝灭基 团 TAMRA)和循环条件ABI PRISM 7700, ABI PRISM5700, ABIGeneAmp 7000 (需要剪掉反 应盖)，ABI PRISM7300/7500(使用8联管)，MJOpticon (使用8联管)等使用薄壁管的仪器循环条件42°C— 20分钟，后93°C— 2分钟，后93°C 30秒一55°C 45秒，40个循环。 LightCycler等使用毛细管的仪器，循环条件42°C— 20分钟，93°C— 2分钟，后93°C 5秒 —580C 45秒，共40个循环。实施例4 结果分析和判定反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品Ct值在40以上，Ct值小于35个循 环的为阳性；Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果 Ct值仍然在35-40个循环之间，判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。需要满足阴性质控 品应为全部阴性；阳性质控品的Ct值均应小于30，且呈标准S型扩增曲线。以上条件应同 时满足，否则此次试验视为无效，全部试验应重新进行。实施例5 本发明方法的临床应用使用本发明的方法和试剂盒，对600份采自广东省珠海出入境检验检疫局实验室 的标本进行一步法双色荧光定量PCR检测，并于其他同类产品进行比对实验，最终经测序 实验验证。结果显示本发明方法的试剂盒，灵敏度为102copies，准确性和特异性达100%， 重复性和稳定性较好，本试剂盒的保存条件和有效期为-20°C，12个月。本方法的发明可 为新型甲型流感病毒Hmi亚型以及甲型流感病毒各亚型mRNA的检测和疫情的预防控制方 案的制定提供科学的、个体化的分子生物学实验数据，为病人的诊断提供可靠的分子病毒 学证据。如果病人咽拭子或者血清中出现甲型流感病毒Hmi亚型mRNA病毒存在，则要立 即采取相应措施，也避免产生不必要的后果。本发明的试剂盒结果的判断有如下几种情况， 见表1 表1.新型甲型流感病毒Hmi亚型双色荧光定量PCR检测试剂盒结果判断 六、序列表SEQUENCE LISTING<110>北京索奥生物技术有限公司<120> 一种新型甲型流感病毒Hmi亚型双色荧光PCR检测方法及其试剂盒<130><160>8<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>88<212>DNA0078]<213>IAV-H1N1 HA 基因0079]<400>10080]ggtacggtta tcaccatcaa aatgagcagg0081]acagaatgcc attgacgaga ttactaac0082]<210>20083]<211>220084]<212>DNA0085]<213>人工序列(引物)0086]<400>20087]ggtacggtta tcaccatcaa aa0088]<210>30089]<211>240090]<212>DNA0091]<213>人工序列(引物)0092]<400>30093]gttagtaatc tcgtcaatgg catt0094]<210>40095]<211>270096]<212>DNA0097]<213>人工序列(探针)0098]<400>40099]atatgcagcc gacctgaaga gcacaca0100]<210>50101]<211>820102]<212>DNA0103]<213>IAV-U M 基因0104]<400>50105]tgtgccactt gtgaacagat tgctgattca0106]accaccaatc cactaatcag gc0107]<210>60108]<211>220109]<212>DNA0110]<213>人工序列(引物)0111]<400>60112]tgtgccactt gtgaacagat tg0113]<210>70114]<211>200115]<212>DNA0116]<213>人工序列(引物)
ggtcaggata gcagccgacc tgaagagcac 60
88
22
24
27
cagcatcggt ctcacagaca gatggctact 60
82
<400>7gcctgattag tggattggtg20<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列(探针)<400>8tgattcacag catcggtctc acagac 2权利要求
本发明为一种新型甲型流感病毒H1N1(甲型H1N1病毒)亚型双色荧光PCR检测方法及其试剂盒，从样品中提取新型甲型流感病毒H1N1亚型(IAV-H1N1)RNA，通过一步PCR-双色荧光探针体外扩增法对新型甲型流感病毒H1N1亚型和甲型病毒各亚型RNA进行扩增，达到快速实时定量检测之目的。
2.根据权利要求ι所述的一种新型甲型流感病毒Hmi(甲型Hmi病毒)亚型双色荧 光PCR检测方法及其试剂盒，特征在于用于检测新型甲型流感病毒Hmi亚型(IAV-HlNl) 的是该型病毒变异性较强的血凝素(Hemagglutinin)基因，特异性引物和荧光探针序列如 下⑴新型甲型流感病毒Hmi亚型上游引物5，-GGTACGGTTATCACCATCAAAA-3，；⑵新型 甲型流感病毒Hmi亚型下游引物5’ -GTTAGTAATCTCGTCAATGGCATT-3’ ； (3)新型甲型流感 病毒 Hmi 亚型荧光探针5，-FAM-ATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACA-TAMRA-3，。用于检测甲型流感病毒各亚型(IAV-U)的是该型病毒较保守的的基质蛋白 (Matrix Protein)基因，特异性引物和探针序列如下(4)甲型流感病毒通用型 上游引物5，-TGTGCCACTTGTGAACAGATTG-3，； (5)甲型流感病毒通用型下游引物 5，-GCCTGATTAGTGGATTGGTG-3' ； (6)甲型流感病毒通用型荧光探针5，-VIC-TGATTCACAGCA TCGGTCTCACAGAC-TAMRA-3‘。
3.根据权利要求1所述一种新型甲型流感病毒Hmi亚型双色荧光定量PCR检测试剂 盒，其特征在于，按照如下方式配制反应体系PCR反应液(PCR MIX) 20 μ 1，Taq酶系和逆转 录酶各1 μ 1共22 μ 1加入一适当体积洁净0. 2ml离心管中，充分混勻，10，OOOrpm离心IOs, 向每管中加入处理后样品(即提取的RNA)、阳性质控品和阴性质控品进行扩增检测。
4.根据权利要求3所述PCR反应液(PCRMIX)主要为以下成分1 μ M各引物和探针、 200uMdNTP、50mM Tris-HCl (ρΗ8· 3)、5mM MgCl2、50mMKCl、25mM(NH4)2SO4组成，一步法扩增程 序为ABI PRISM 7700、ABIPRISM5700、ABIGeneAmp7000、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon 等，42°C— 20分钟，然后93°C— 2分钟，然后93°C 30秒一55°C 45秒(检测荧光)，40个 循环；LightCycler等扩增程序为42°C — 20分钟，然后93°C — 2分钟，然后93 °C 5秒 —580C 45秒(检测荧光)，共40个循环。
全文摘要
本发明提供了一种使用双色荧光定量PCR技术(PCR-双色荧光探针法)快速准确的检测出样品中新型甲型流感病毒H1N1亚型(IAV-H1N1)以及甲犁流感病毒各亚型(IAV-U)的mRNA的方法。该方法包括(1)采集和运送感染或疑似病人样本；(2)样本预处理和提取RNA；(3)一步PCR-荧光探针体外扩增法对样本进行检测(4)扩增反应结束后根据每个扩增反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中新型甲型流感病毒H1N1亚型和(或)甲型流感病毒各亚型的存在，并能够对对其进行准确定量(图3)，实现了对该新型甲型流感病毒H1N1亚型和甲型流感病毒各亚型实时快速精确检测之目的。
文档编号C12R1/93GK101886139SQ20091013663
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月11日 优先权日2009年5月11日
发明者史成军, 徐贵峰, 罗宝正 申请人:北京索奥生物技术有限公司;珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心