专利名称：：产气肠杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新菌种筛选
技术领域：
，具体的说，涉及一种产气肠杆菌及其应用。
背景技术：
：铁元素在地壳中的平均含量为5.6%，是地壳中丰度排名第二的金属。铁在自然环境中通常以难溶性Fe(III)氧化物的形式存在，铁的还原是由特定微生物介导的酶促反应，具有铁还原能力的细菌是铁氧化物还原的动力。研究表明，铁还原反应不仅影响铁的生物地球化学循环，而且参与多种土壤环境过程，包括土壤潜育化过程，营养元素(如P、K、Ca、Mg等)与微量金属元素的迁移释放，有机污染物的厌氧降解，金属的还原解毒以及抑制甲烷排放等，具有广泛的应用前景。异化铁还原(DissimilatoryIronReduction)是指微生物通过呼吸作用将电子转移至细胞外的铁氧化物表面，将Fe(III)还原成Fe(II)的过程。与同化作用不同的是，异化铁还原过程中的还原产物Fe(II)积聚于细胞外，不作为细胞成分进入胞内。铁还原细菌是指能通过氧化电子供体偶联还原Fe(III)，并从中获得能量的微生物。1987年Lovley首次在淡水沉积物中发现具有异化铁还原能力的金属还原地杆菌(Geometermeto〃^^cmsGS15)。目前，已经有100多株铁还原细菌被分离纯化，主要分布于地杆菌属(GeoZwc&rw.)、希瓦氏菌属(67^而"g〃as/,)、月兑硫杆菌属(Z)asM诉to6""m.画5p.入月兑硫弧菌属(D^"//omz'craZ^m等几个属。但这些具有铁还原活性的菌株尚存在以下缺陷1)大多数菌株只能在严格厌氧环境中生存，不利于大规模生产与实际应用；2)菌株的电子供体利用谱较窄，只能利用乙酸、乳酸等小分子量有机物作为电子供体，不能利用葡萄糖、蔗糖等分子量较大的有机物，对实际应用的环境要求相对较高。产气肠杆菌是自然界中普遍存在的菌株，但至今仍未发现具有铁还原活性的产气肠杆菌的报道。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一株具有铁还原活性、兼性厌氧、电子供体利用谱较广的产气肠杆菌。本发明的另一个目的是提供上述产气肠杆菌在三价铁还原中的应用。发明人经过大量的实验研究，从广东肇庆某地下古森林土壤中分离筛选出了产气肠杆菌(五"&rakzcferXM02)。于2007年3月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC1969。该菌株为短杆状，尺寸范围为1.01.7x0.60.8jam，菌落颜色为白色或黄色，兼性厌氧，厌氧环境下其电子供体利用谱较广，能氧化拧檬酸、丙三醇、葡萄糖、蔗糖等有机物，同时还原水铁矿、针铁矿、纤铁矿、赤铁矿、黄铁矾等铁氧化物。一、本发明菌株从广东肇庆某地下古森林土壤进行分离、纯化所得，其分离纯化方法如下1)液体分离培养基每升培养基中含l.Og葡萄糖、16g柠檬酸铁、2.5gNaHC03、0.25gNH4Cl、0.678gNaH2PO4'2H2O、O.lgKCl、维生素溶液10.0mL、微量元素溶液10.0mL;pH5.06.0。其中，维生素溶液是每升水中含2.0mg生物素、2.0mg叶酸、10.0mg维生素B6、5.0mg硫胺素、5.0mg核黄素、5.0mg烟酸、5.0mg泛酸韩、0.1mg维生素B12、5.0mg对氨基苯甲酸、5.0mg硫辛酸；微量元素溶液是每升水中含1.5g氨三乙酸、3.0gMgS04.7H20、0.5gMnS04.H20、l.OgNaCl、O.lgFeS04.7H20、O.lgCoCl2.6H20、0.1gCaCl2、O.lgZnS04-7H20、O.OlgCuS04.5H20、O.OlgA1K(S04)2.12H20、O.OlgH3B03、O.OlgNa2Mo04.2H20。2)富集:称取5g古森林土壤样品接种到lOOmL液体分离培养基，往培养液中鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)21小时；鼓气完毕后将培养物置于厌氧工作站(N2/CO2=80/20)3(TC静置培养，检测Fe(II)的产率同时观察培养液的颜色变化情况。当Fe(II)的产量不断增加时，培养液的颜色从原先的橙黄色逐渐变暗，最后变成黑色。当Fe(II)的产量超过总铁含量的50%时，以10%的接种量转接至另一新鲜的液体分离培养基中，如此反复三次。3)纯化将第四代反应后的培养液进行适当稀释后均匀涂布于固体培养基上，置于厌氧工作站(N2/CO2=80/20)3(TC培养48小时，挑取单菌落进行纯化。固体培养基的配方与液体分离培养基相同，只是每升多加了15g琼脂。二、采用以下方法来验证本发明菌株的铁还原活性，确定其电子供体与电子受体利用谱。1)从保存产气肠杆菌XM02的斜面接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于3(TC，180转/分钟摇床活化菌体9小时，使细菌数量达到指数生长期；2)在上述液体分离培养基中添加不同电子供体(如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸、乙醇、丙三醇、葡萄糖、蔗糖等)和电子受体(如柠檬酸铁、水铁矿、针铁矿、赤铁矿、黄铁矾等)，以10%的接种量接种活化菌液于上述液体分离培养基中，厌氧工作站(N2/CO2=80/20)下30。C静置培养；3)每隔一定时间(约5~10天)取4mL培养液于16mL0.5MHCl溶液(M表示每升水中含HC1的摩尔数)中180转/分钟振荡1.5小时；把菌体等沉淀滤掉，采用邻菲罗林法给滤液中的Fe(II)显色，采用紫外-可见分光光度计在510nm处测定Fe(II)的含量，验证菌株的铁还原活性。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果发明人经过大量的实验研究，筛选出了产气肠杆菌(^fera^"wMragwMXM02)。此菌株具有铁还原活性、兼性厌氧、电子供体利用谱较广。可以在好氧或厌氧环境下生存，厌氧环境下其电子供体利用谱较广，能氧化的电子供体有丙三醇、柠檬酸、葡萄糖、蔗糖等有机物；可还原的三价铁有水铁矿、针铁矿、纤铁矿、赤铁矿、黄铁矾等。图1为￡.^ragw^XM02的30000倍电子显微镜图片。具体实施例方式实施例1菌株分离1)分离培养基每升分离培养基中含l.Og葡萄糖；16g柠檬酸铁；2.5gNaHC03;0.25gNH4Cl;0.678gNaH2PO4.2H2O;O.lgKCl;维生素溶液10.0mL;微量元素溶液10.0mL;pH5.5。其中，维生素溶液是每升水中含2.0mg生物素、2.0mg叶酸、10.0mg维生素B6、5.0mg硫胺素、5.0mg核黄素、5.0mg烟酸、5.0mg泛酸钙、O.lmg维生素B12、5.0mg对氨基苯甲酸、5.0mg硫辛酸；微量元素溶液是每升水中含1.5g氨三乙酸、3.0gMgS04'7H20、0.5gMnS04.H20、l.OgNaCl、O.lgFeS04.7H20、O.lgCoCl2.6H20、O.lgCaCl2、O.lgZnS04.7H20、O.OlgCuS04.5H20、O.OlgA1K(S04)2.12H20、O.OlgH3B03、O.OlgNa2Mo04.2H20。2)富集称取5g古森林土壤样品接种到lOOmL上述液体分离培养基；往培养液中鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)1小时；鼓气完毕后将培养物置于厌氧工作站(N2/CO2=80/20)3CTC静置培养。检测Fe(II)的产率同时观察培养液的颜色变化情况。当Fe(II)的产量不断增加时，培养液的颜色从原先的橙黄色逐渐变暗，最后变成黑色。当Fe(II)的含量超过总铁含量的50%时，以10%的接种量转接至另一新鲜的上述液体分离培养基中，如此反复三次。3)纯化最后，将第四代反应后的培养液进行适当稀释后均匀涂布于上述固体分离培养基上，置于厌氧工作站(N2/CO2=80/20)30t:培养48小时，挑取单菌落进行纯化。实施例2特性鉴定(1)菌体形态特性采用常规的细菌电子显微镜观察，该菌株为短杆状，尺寸范围为1.01.7x0.60.8pm。(见图1)(2)菌落形态特性在牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上好氧培养24小时后，菌落形态为圆形，边缘整齐；表面光滑，低凸面；白色，菌落直径为23mm;在实施例1所述固体分离培养基平板上厌氧培养48小时后，菌落形态为圆形，边缘整齐；表面光滑，高凸面；黄色，菌落直径为23mm。(3)生理、生化特性根据BioLog微生物鉴定仪，分析此菌株在好氧条件下对96种不同碳源的利用情况，可初步鉴定此菌株为肠道菌。其他生理生化结果见表1:表1.菌株生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注+表示为阳性或可以利用；-表示为阴性或不能利用(4)分子生物学特性采用SDS-蛋白酶K，氯仿-异戊醇(体积比24:1)抽提，0.6体积异丙醇沉淀的方法提取细菌总DNA。采用细菌16SrDNA通用引物F8和R1542和细菌gyrB基因通用引物UP-l/UP-2rPCR扩增细菌的16SrDNA，在1500bp附近出现明显的条带，将PCR扩增产物回收后进行序列测定，将获得的DNA序列输入GenBank，以Blastn程序对数据库中的所有序列进行比较分析，结果发现本发明菌株的16SrDNA序列和与GenBank中产气肠杆菌的多个菌株具有较高的同源性，其中与产气肠杆菌的模式菌株(五"terakcfer的16SrDNA(登录号为AF395913)的同源性达到99%(同一菌种的16SrDNA序列的同源性应大于97.7%)。结合上述的BioLog微生物鉴定结果、生理生化特性、16SrDNA序列的结果，该菌株应归属于产气肠杆菌(五Mtera^cferaeragewey)，命名为五她raZacferXM02。实施例3铁还原活性电子供体为柠檬酸，电子受体为水铁矿培养基(a):在1.0L去离子水中添加2.0g柠檬酸，10.0g7jC铁矿，2.5gNaHC03，0.25gNH4Cl，0.678gNaH2PO4-2H2O，O.lgKCl，10.0mL维生素溶液，10.0mL微量元素溶液；其中，维生素溶液与微量元素溶液配方同实施例l;调节培养基(a)的pH为5.5，于121匸条件下灭菌20分钟，冷却后鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)1小时。从保存产气肠杆菌XM02的斜面接种菌体于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于3(TC，180转/分钟摇床活化菌体9小时，使细菌数量达到指数生长期，以10。/。的接种量接种活化菌液于上述培养基(a)中，3(TC静置厌氧培养，同时设置不加菌的对照。观察培养液的颜色变化情况，每隔5~10天取4mL培养液于16mL0.5MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩尔数)中180转/分钟振荡1.5小时。采用邻菲罗林比色法测定Fe(II)的含量，验证菌株的铁还原能力。Fe(II)含量变化(单位为mg/L，即表示每升样品中所含Fe(II)的毫克数)见表2:表2.XM02菌株还原水铁矿产生Fe(II)的浓度变化(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例4铁还原活性电子供体为柠檬酸，电子受体为针铁矿培养基(b):在1.0L去离子水中添加2.0g柠檬酸，9.0g针铁矿，2.5gNaHC03，0.25gNH4Cl，0.678gNaH2P04.2H20，O.lgKCl，lO.OmL维生素溶液，10.0mL微量元素溶液；其中，维生素溶液与微量元素溶液配方同实施例l;调节培养基(b)的pH为5.5，于12rC条件下灭菌20分钟，冷却后鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)l小时。从保存产气肠杆菌XM02的斜面接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30°C，180转/分钟摇床活化菌体9小时，使细菌数量达到指数生长期，以10。/。的接种量接种活化菌液于上述培养基(b)中，3CTC静置厌氧培养。观察培养液的颜色变化情况，每隔5~10天取4mL培养液于16mL0.5MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩尔数)中180转/分钟振荡1.5小时。采用邻菲罗林法给测定Fe(II)的含量，并以不加菌的培养液(b)为对照，验证菌株的铁还原能力。Fe(II)含量变化(单位为mg/L，即表示每升样品中所含Fe(II)的毫克数)见表3:表3.XM02菌株还原针铁矿产生Fe(II)的浓度变化(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例5铁还原活性电子供体为丙三醇，电子受体为水铁矿培养基(c):在1.0L去离子水中添加0.92g丙三醇，10.0g水铁矿，2.5gNaHC03，0.25gNH4Cl，0.678gNaH2P04.2H20，O.lgKCl，10.0mL维生素溶液，10.0mL微量元素溶液；其中，维生素溶液与微量元素溶液配方同实施例l;调节培养基(c)的pH为5.5，于121'C条件下灭菌20分钟，冷却后鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)l小时。从保存产气肠杆菌XM02的斜面接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30°C，180转/分钟摇床活化菌体9小时，使细菌数量达到指数生长期，以10。/。的接种量接种活化菌液于上述培养基(c)中，3(TC静置厌氧培养。观察培养液的颜色变化情况，每隔510天取4mL培养液于16mL0.5MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩尔数)中180转/分钟振荡1.5小时。采用邻菲罗林法测定Fe(II)的含量，并以不加菌的培养液(c)为对照，验证菌株的铁还原能力。Fe(II)含量变化(单位为mg/L，即表示每升样品中所含Fe(II)的毫克数)见表4:表4.XM02菌株还原水铁矿产生Fe(II)的浓度变化(mg/L)o天5天10天20天未加菌对照0.030.390.871.23力口￡.釘，腦XM020.0217.2731.3664.85实施例6铁还原活性电子供体为蔗糖，电子受体为水铁矿培养基(d):在1.0L去离子水中添加3.42g蔗糖，10.0g水铁矿，2.5gNaHC03，0.25gNH4Cl，0.678gNaH2P04.2H20，O.lgKCl，10.0mL维生素溶液，10.0mL微量元素溶液；其中，维生素溶液与微量元素溶液配方同实施例l;调节培养基(d)的pH为5.5，于121"C条件下灭菌20分钟，冷却后鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)1小时。从保存产气肠杆菌XM02的斜面接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30°C，180转/分钟摇床活化菌体9小时，使细菌数量达到指数生长期，以10。/。的接种量接种活化菌液于上述培养基(d)中，30"C静置厌氧培养。观察培养液的颜色变化情况，每隔510天取4mL培养液于16mL0.5MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩尔数)中180转/分钟振荡1.5小时。采用邻菲罗林法测定Fe(II)的含量，并以不加菌的培养液(d)为对照，验证菌株的铁还原能力。Fe(II)含量变化(单位为mg/L，即表示每升样品中所含Fe(II)的毫克数)见表5:表5.XM02菌株还原水铁矿产生Fe(II)的浓度变化(mg/L)o天5天10天20天未加菌对照0.031.263.187.97力口野，腊XM020.0361.24108.66189.3权利要求1.一种产气肠杆菌，其特征在于其为短杆状，于2007年3月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC1969。全文摘要本发明公开了一种产气肠杆菌及其应用。发明人经过大量的实验研究，筛选出了产气肠杆菌(EnterobacteraerogenesXM02)。此菌株具有铁还原活性、兼性厌氧、电子供体利用谱较广。可以在好氧或厌氧环境下生存，厌氧环境下其电子供体利用谱较广，能氧化的电子供体有丙三醇、柠檬酸、葡萄糖、蔗糖等有机物；可还原的三价铁有水铁矿、针铁矿、纤铁矿、赤铁矿、黄铁矾等。文档编号C12N1/20GK101586093SQ20091014669公开日2009年11月25日申请日期2007年6月1日优先权日2007年6月1日发明者周顺桂,李晓敏,李芳柏,雷发懋申请人:广东省生态环境与土壤研究所