新的stra6多肽的制作方法

专利名称：新的stra6多肽的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及鉴定和分离新的DNA，涉及重组产生具有类似于鼠 Stra6(—种鼠视黄酸易感蛋白)序列的新多肽。早些时候曾经将这些分子中的 一些称为"PRO10282"，但在下文中也将之称为"Stra6"多肽。
背景技术：
膜结合蛋白
膜结合蛋白和受体在多细胞生物的构造、分化和维持方面发挥重要作 用。许多单个细胞的命运，如增殖、迁移、分化或与其它细胞相互作用，通 常被接收自其它细胞和/或即时环境的信息所控制。这种信息常常由分泌多肽 进行传输(例如，致有丝分裂因子，存活因子，细胞毒因子，分化因子，神 经肽和激素)，而分泌多肽反过来被各种细胞受体或膜结合蛋白接收并翻译。 此类膜结合蛋白和细胞受体包括但不限于细胞因子受体、受体激酶、受体 磷酸酶、细胞-细胞相互作用中所涉及的受体，以及细胞粘附分子如选择蛋 白和整联蛋白。举例来说，调节细胞生长和分化的信号转导部分程度上受各 种细胞蛋白质的磷酸化作用的调节。蛋白酪氨酸激酶(催化磷酸化过程的酶)， 也起着生长因子受体的作用。实例包括成纤维细胞生长因子受体和神经生长 因子受体。
膜结合蛋白和受体分子具有多种工业用途，包括作为药剂和诊断剂。比 如，受体免疫粘附素可用作阻断受体-配体相互作用的治疗剂。膜结合蛋白 也可用于筛选相关受体/配体相互作用的潜在的肽或'J、分子抑制剂。
工业和学术界都在进行着鉴定新的、天然受体或膜结合蛋白的不懈努 力。许多努力集中在筛选哺乳动物重组DNA文库上以确定新受体或膜结合 蛋白的编码序列。本发明Stra6多肽与鼠蛋白Stra6具有序列同源性(73 %相同和81 %相 似)，所述鼠蛋白Stra6的表达是由视黄酸诱导的。(Bouillet等，Dev. Biol. 170: 420-433 [1995]; Bouillet等，Mech. Dev. 63:173画186[1997]; Chazaud等，Dev. Genet. 19:66-73[1996])。既然视黄酸是脊推动物发育过程中一重要的信号分 子，那么，认为应答视黄酸而诱导的基因在胚胎发育的生长和分化中发挥着 重要作用。使用设计的为鉴定和分离视黄酸诱导基因的扣除杂交法，从P19 鼠胚胎癌性细胞中分离出鼠Stra6 cDNA，后者并未显示出与前面描述的蛋白 质具有相似性。它含有与多个跨膜结构域相应的高度疏水伸展(stretches)的氨 基酸残基，此是膜内在蛋白的一个特征。基于其表达模式，Stra6被认为在 胚胎发育过程的早期对于背腹侧肢(dorsoventral limb)的结构形式和后期对软 骨内成骨的控制方面起着重要作用(Chazaud等，Dev. Genet. 19:66-73[1996])。
本文公开的Stra6多肽含有多个可能是构成跨膜结构域的高度疏水区， 其表明Stra6多肽是膜内在蛋白。它们可以作为未知配体的受体发挥作用， 并可能是影响细胞生长、发育或分化的信号转导通路的一部分。
肿瘤细胞中的基因扩增
在美国，恶性肿瘤(癌)是导致死亡的居心脏疾病之后的第二位主要原因 (Boring等，CA Cancel J. Clin., 43:7[1993])。
恶性肿瘤的特征是，异常细胞数量增加或衍生自正常组织的肿瘤细胞增 生形成肿瘤块，这些赘生的肿瘤细胞侵袭毗邻组织，并且增生的恶变细胞逐 渐经血液或淋巴系统扩散到局部淋巴结和远端部位(转移)。在癌性状态下， 细胞在正常细胞不生长的环境下增生。恶性肿瘤本身表现出多种形态，均以 不同程度的侵袭性和侵犯性为特征。
基因表达的改变与不受抑制的细胞生长和去分化密切相关，而不受抑制 的细胞生长和去分化是所有恶性肿瘤的共同特征。业已发现， 一些进行过较 好研究的肿瘤的基因组显示出隐性基因的表达减弱，隐性基因通常指肿瘤抑 制基因，正常功能是抑制恶变细胞生长和/或抑制那些促进恶性肿瘤生长的某 些优势基因如致癌基因的过度表达。这些中的每一种遗传学变化显得是肿瘤 具有某些特性的原因，集合起来，则表现出全部的肿瘤表型(Hunter, Cell, 64:1129[1991]和Bishop, Cell, 64:235-248[1991])。
众所周知，肿瘤细胞中基因(例如，致癌基因)过度表达机制是基因扩增。 这是在祖细胞染色体中产生特定基因多拷贝的过程。该过程涉及含有特定基因的染色体区域的异常复制，然后将复制的片段再重组回染色体中(Alitalo 等，Adv. Cancer Res., 47:235-281[1986])。据信，基因过度表达与基因扩增 相平行，即与生产的拷贝数成正比。
已经确定，编码生长因子和生长因子受体的原癌基因在各种人类恶性肿 瘤(包括乳腺癌)的病因学中起着重要作用。例如，业已发现编码与表皮生长 因子受体(EGFR)有关的185 kd跨膜糖蛋白受体(pl85^"， HER2)的人ErbB2 基因(e^B2，也称为/2^2或c-e^B-2)，在约25% ~30%的人乳腺癌中过度 表达(Slamon等，Science 235:177-182 [1987]; Slamon等，Science 244:707-712 [1989])。
据报道，原癌基因的基因扩增是更大恶性程度的恶性肿瘤中通常涉及的 事件，并且可以起到临床发病预报器的作用(Schwab等，Genes Chromosomes Cancer, 1:181-193[1990]; Alitalo等，同上)。因此，erbB2过度表达一般被 认为是预后差的预示，尤其对累及腋窝淋巴结的原发性疾病的患者而言 (Slamon等，[1987]和[1989],同上；Ravdin和Chamness , Gene , 159:19-27[1995]; 以及Hynes and Stern , Biochim. Biophys. Acta ， 1198:165-184[ 1994])，而且与对激素治疗和化学疗法的敏感性和/或抗性相 关，所述化学疗法包括CMF(环磷酰胺，曱氨蝶呤，和氟尿嘧啶)和蒽环霉素 (Baselga等，Oncology, 11 (3 Suppl 1) : 43-48 [1997])。然而，尽管erbB2过 度表达与预后差有关，但是HER2-阳性患者对用taxanes治疗的临床反应几 率却比HER2-阴性患者的反应几率大3倍以上(同上)。重组人源化抗 ErbB2(抗-HER2)单克隆抗体(鼠抗ErbB2抗体4D5的人源化版本，称作 rhuMAb HER2或HERCEPTIN ,对已经接受过广泛抗癌治疗的ErbB2过度 表达型转移性乳腺癌患者进行的临床治疗有效(Basdga等，J. Clin. Oncol. 14: 737-744 [1996])。
据上所述，显然存在着对于鉴定在诊断和治疗与基因扩增有关的肿瘤中 有用的新的分子、方法和组合物的极大兴趣。
发明概述
已经鉴定了与编码鼠视黄酸易感蛋白Stra6并编码667个氨基酸的新 多肽(在本申请中称为全长天然序列人"PRO10282")的核酸具有同源性的人 cDNA克隆(本文中指定为DNA148380-2827)。已经鉴定了编码658个氨基酸
6的新多肽 (PRO 19578)的另 一 人 cDNA克隆(本文指定为 DNA148389-2827-l),显示出与鼠Stra6和天然序列人PRO10282均具有显 著序列同源性，它被认为是天然序列人PRO10282的剪切变体。正如后面将 要讨论的那样，根据与鼠Stra6的同源性，也将本发明PRO10282多肽(包括 天然序列和变体分子)称为"Stra6"多肽。
在一实施方案中，本发明提供分离的含有编码PR010282多肽的核苷酸 序列的核酸分子。
一方面，分离的核酸分子含有与(a)编码具有图2(SEQ ID NO: 2)所示从 约1至约667位氨基酸的序列(包括两端残基在内)的PR010282多肽的DNA 分子，或者(b)编码具有图7(SEQ ID NO: 5)所示从约1至约658位氨基酸的 序列(包括两端残基在内)的PR019578多肽的DNA分子，或者(c) (a)或(b)所 述DNA分子的互补链，具有至少约80%、优选至少约81%、更优选至少约 82 % 、更优选至少约83 % 、更优选至少约84 % 、更优选至少约85 % 、更优 选至少约86% 、更优选至少约87% 、更优选至少约88% 、更优选至少约89% 、 更优选至少约90 % 、更优选至少约91 % 、更优选至少约92 % 、更优选至少 约93%、更优选至少约94%、更优选至少约95%、更优选至少约96%、更 优选至少约97%、更优选至少约98%或约99%核酸序列同源的核苷酸序列。
另一方面，该分离的核酸分子含有(a)编码具有图2(SEQIDNO: 2)所示 从约1至约667位氨基酸的序列(包括两端残基在内)的PRO10282多肽的核 苷酸序列，或者(b)编码具有图7(SEQ ID NO: 5)所示从约1至约658位氨基 酸的序歹'K包括两端残基在内)的PR019578多肽的核苷酸序列，或者(b) (a) 或(b)所述核苷酸序列的互补序列的核酸分子。
再一方面，该分离的核酸分子含有与(a)

图1 (SEQ ID NO: l)所示由约 斗9至约2049位核苦酸的序列(包括两端残基在内)的DNA分子，或者(b)图 6 (SEQ ID NO: 4)所示由约186至约2159位核苷酸的序列(包括两端残基在内) 的DNA分子，或者(a)或(b)所述DNA分子的互补序列，具有至少约80 % 、 优选至少约81 % 、更优选至少约82% 、更优选至少约83% 、更优选至少约 84%、更优选至少约85%、更优选至少约86%、更优选至少约87%、更优 选至少约88% 、更优选至少约89% 、更优选至少约90% 、更优选至少约91 % 、 更优选至少约92 % 、更优选至少约93 % 、更优选至少约94 % 、更优选至少 约95%、更优选至少约96%、更优选至少约97%、更优选至少约98%或约99 %核S交序列同源的核芬酸序列。
另一方面，该分离的核酸分子含有图1 (SEQIDNO: 1)所示由约49至约 2049位核苷酸的序歹'K包括两端残基在内)，或者(b)图6(SEQIDN0:斗)所示 由约186至约2159位核芬酸的序列(包括两端残基在内)，或者(c) (a)或(b)核 香酸序列的互补序列。
此外，本发明涉及分离的核酸分子，其含有与(a)编码由2000年1月 11日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1181 (DNA 148380J8Z7)的人蛋白 cDNA编码的相同成熟多肽的DNA分子，或者(b)编码由2000年2月23 日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1405 (DNA 148389-2827-l)的人蛋白 cDNA编码的相同成熟多肽的DNA分子，或者(c) (a)或(b)所述DNA分子的 互补序列，具有至少约80%、优选至少约81%、更优选至少约82%、更优 选至少约83 % 、更优选至少约84 % 、更优选至少约85 % 、更优选至少约86 % 、 更优选至少约87%、更优选至少约88%、更优选至少约89%、更优选至少 约90%、更优选至少约91%、更优选至少约92%、更优选至少约93%、更 优选至少约94 % 、更优选至少约95 % 、更优选至少约96 % 、更优选至少约 97%、更优选至少约98%或约99%核酸序列同源的核苷酸序列。在一优选 的实施方案中，分离的核酸分子含有(a)编码与2000年1月11日在ATCC保 藏的ATCC保藏号为PTA-1181 (DNA 148380-2827)的人蛋白cDNA编码的相 同成熟多肽的核苦酸序列，或者(b)编码由2000年2月23日在ATCC保藏 的ATCC保藏号为PTA-1405 (DNA 148389-2827-1)的人蛋白cDNA编码的相 同成熟多肽的核苷酸序列，或者(c)(a)或(b)所述核苷酸序列的互补序列。
另一方面，发明涉及分离的核酸分子，其含有与(a)2000年1月11日在 ATCC保藏的ATCC保藏号为PT-1181 (DNA148380-2827)的人蛋白cDNA的 全长多肽编码序列，或者(b) 2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏号 为PTA-1405 (DNA 148389-2827-1)的人蛋白cDNA的全长多肽编码序列，或 者(c) (a)或(b)所述核香酸序列的互补序列，具有至少约80%、优选至少约 81%、更优选至少约82%、更优选至少约83%、更优选至少约84%、更优 选至少约85 % 、更优选至少约86 % 、更优选至少约87 % 、更优选至少约88 % 、 更优选至少约89% 、更优选至少约90% 、更优选至少约91 % 、更优选至少 约92%、更优选至少约93%、更优选至少约94%、更优选至少约95%、更 优选至少约96%、更优选至少约97%、更优选至少约98%或约99%核酸序
8列同源的核苷酸序列。
在一优选的实施方案中，分离的核酸分子含有(a) 2000年1月11曰在 ATCC保藏的ATCC保藏号为PT-1181 (DNA148380-2827)的人蛋白cDNA的 全长多肽编码序列，或者(b) 2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏号 为PTA-1405 (DNA 148389-2827-1)的人蛋白cDNA的全长多肽编码序列，或 者(c) (a)或(b)所述核苷酸序列的互补序列。
还一方面，发明涉及编码下面定义的活性PR010282多肽的分离的核酸 分子，其包括能与编码图2(SEQ ID NO: 2)中1 ~约667位氨基酸(包括两个 端点氨基酸残基在内)的核酸序列的互补序歹'j，或者与编码图7(SEQIDNO: 5) 中1~约658位氨基酸(包括两个端点氨基酸残基在内)的核酸序列的互补序 列杂交的核苷酸序列，其中该分离的核酸分子不是编码鼠Stra6的DNA。优 选地，杂交在严格杂交条件和洗涤条件下发生。
另一方面，发明涉及编码下面定义的活性PR010282多肽的分离的核酸 分子，其包括与图l(SEQIDNO: l)所示核苷酸约49和约2049之间(包括两 个端点残基在内)核酸序列的互补序列，或者与图6(SEQIDNO: 4)所示核苷 酸约186和约2159之间(包括两个端点残基在内)核酸序列的互补序列杂交的 核苦酸序列，其中该分离的核酸分子不是编码鼠Stra6的DNA。优选地，杂 交在严格杂交条件和洗涤条件下发生。
再一方面，发明涉及具有至少约765个核苷酸的分离的核酸分子，其是 在严格条件下使测试DNA分子与(a)编码含图2(SEQ ID NO: 2)所示从约1 至约667的氨基酸序列(包括两端残基在内)的PRO10282多肽的DNA分子， 或者(b)编码含图7(SEQ ID NO:"所示从约1至约658的氨基酸序列(包括 两端残基在内)的PR019578多肽的DNA分子，或者(c) (a)或(b)所述DNA分 子的互补序列进行杂交而产生的，而且，如果该测试DNA分子与(a)或(b)具 有至少约80 % 、优选至少约81 % 、更优选至少约82 % 、更优选至少约83 % 、 更优选至少约84%、更优选至少约85%、更优选至少约86%、更优选至少 约87% 、更优选至少约88% 、更优选至少约89% 、更优选至少约90。/。、更 优选至少约91%、更优选至少约92%、更优选至少约93%、更优选至少约 94 % 、更优选至少约95 % 、更优选至少约96 % 、更优选至少约97 % 、更优 选至少约98%、更优选至少约99%的核酸序列同一性，则分离该测试DNA 分子。另一方面，发明涉及分离的核酸分子，其含有与(a)编码含图2(SEQID NO: 2)所示从约1至约667的氨基S^歹'J(包括两端残基在内)，或者(b)编码 含图7(SEQIDNO: 5)所示从约1至约658的氨基酸序列(包括两端残基在内) 相比，具有至少约80%、优选至少约81%、更优选至少约82%、更优选至 少约83 % 、更优选至少约84 % 、更优选至少约85 % 、更优选至少约86 % 、 更优选至少约87%、更优选至少约88%、更优选至少约89%、更优选至少 约90%、更优选至少约91%、更优选至少约92%、更优选至少约93%、更 优选至少约94%、更优选至少约95%、更优选至少约96%、更优选至少约 97%、更优选至少约98%、更优选至少约99%评分阳性的多肽的核苷酸序 列，或者含有(c)(a)或(b)所述核苷酸序列的互补序列。
本发明的另一特定方面，本发明提供包含编码PR010282的核苷S吏序列 的分离的核酸分子，该核苷酸序列要么编码跨膜结构域缺失或者跨膜结构域 失活，要么与此编码核苷酸序列互补，其中跨膜结构域已被试验性地确定为 在图2 (SEQ ID NO: 2)所示序列中，从约氨基酸54位向约氨基酸69位延伸、 从约氨基酸102位向约氨基酸119位延伸、从约氨基酸148位向约氨基酸166 位延伸、从约氨基酸207位向约氨基酸222位延伸、从约氨基酸301位向约 氨基酸320位延伸、从约氨基酸364位向约氨基酸380位延伸、从约氨基酸 431位向约氨基酸451位延伸、从约氨基酸474位向约氨基酸489位延伸、 和从约氨基酸512位向约氨基酸531位延伸；而在图7 (SEQ ID NO: 5)所示 序列中，从约氨基酸54位向约氨基酸71位延伸、从约氨基酸93位向约氨 基酸111位延伸、从约氨基酸140位向约氨基酸157位延伸、从约氨基酸197 位向约氨基酸214位延伸、从约氨基酸291位向约氨基酸312位延伸、从约 氨基酸356位向约氨基酸371位延伸、从约氨基酸425位向约氨基酸481位 延伸、从约氨基酸505位向约氨基酸522位延伸。因此，本发明所述PRO 10282 多肽的可溶性细胞外结构域也在考虑之内。
在这点上，本发明的另一方面涉及分离的核酸分子，其含有与(a)编码 图2 (SEQ ID NO : 2) 1至X氨基酸的DNA分子，其中X是图2 (SEQ ID NO : 2)中自49到59的任何氨基酸，或(b) (a)中DNA分子的互补序列具有至少约 80 % 、优选至少约81 % 、更优选至少约82 % 、更优选至少约83 % 、更优选 至少约84% 、更优选至少约85% 、更优选至少约86% 、更优选至少约87% 、 更优选至少约88%、更优选至少约89%、更优选至少约90%、更优选至少约91%、更优选至少约92%、更优选至少约93%、更优选至少约94%、更 优选至少约95% 、更优选至少约96% 、更优选至少约97% 、更优选至少约 98%、更优选至少约99%同一性的核苷酸序列。在一特定方面，该分离的核 酸分子含有(a)编码图2 (SEQ ID NO : 2)或图7 (SEQ ID NO : 5)中1至X氨 基酸的核苷酸序列，其中X是图2 (SEQ ID NO : 2)中自49至59的任何氨 基酸，或者(b)(a)中DNA分子的互补序列。 一特定方面，该分离的核酸分子 含有(a)编码图2 ISEQ ID NO : 2)，或图7 (SEQ ID NO : 5)中1至X的氨基 酸，其中X是图2 (SE ID NO : 2),或图7 (SEQ ID NO : 5)自49至59的任 何氨基酸(包括两端氨基酸残基在内)，或者(b)(a)中DNA分子的互补序列的 核苷酸序列。
本发明还有一方面，分离的核酸分子(a)编码与图2(SEQIDN0 : 2), 或图7 (SEQ ID NO : 5)中约1至X残基氨基酸序列，其中X是图2 (SEQ ID NO:2)中自49至59的任何氨基酸，或者(b)(a)中DNA分子的互补序列相比， 具有至少约80 % 、优选至少约81%、更优选至少约82 % 、更优选至少约83 % 、 更优选至少约84 % 、更优选至少约85 % 、更优选至少约86 % 、更优选至少 约87%、更优选至少约88%、更优选至少约89%、更优选至少约90%、更 优选至少约91 % 、更优选至少约92% 、更优选至少约93% 、更优选至少约 94% 、更优选至少约95% 、更优选至少约96% 、更优选至少约97% 、更优 选至少约98% 、更优选至少约99%阳性评分的多肽。
另一实施方案，涉及PR010282多肽编码序列片段，这些片段例如可用 作杂交探针，或者可任选地编码含抗-PR010282抗体结合位点的PRO10282 多肽的编码片段。此类核酸片段长度通常至少约20个核苷酸，优选至少约 30个核苷酸，更优选至少约40个核苷酸，更优选至少约50个核香酸，更优 选至少约60个核芬酸，更优选至少约70个核苷酸，更优选至少约80个核 苷酸，更优选至少约90个核香酸，更优选至少约100个核芬酸，或者至少 约110个核苷酸，更优选至少约120个核芬酸，更优选至少约130个核苦酸， 更优选至少约140个核苷酸，或者至少约150个核苷酸，更优选至少约160 个核香酸，更优选至少约170个核苷酸，更优选至少约180个核芬酸，或者 至少约190个核芬酸，更优选至少约200个核芬酸，更优选至少约250个核 苷酸，更优选至少约300个核苷酸，更优选至少约350个核苷酸，更优选至 少约400个核苦酸，更优选至少约450个核苷酸，更优选至少约500个核苷
ii酸，更优选至少约600个核苷酸，更优选至少约700个核苷酸，更优选至少 约800个核苷酸，更优选至少约900个核芬酸，更优选至少约1000个核苷 酸，其中本文术语"约"是指核苷酸序列有关长度加或减10%。本发明核酸 片段不同于鼠Stra6天然编码序列的片段。在一优选的实施方案中，该核苷 酸序列片段衍生自图1 (SEQIDNO: 1)或图6(SEQ ID NO: 4)所示核苷酸序 列的任何编码区。应当指出，可用常规方法测定编码PR010282多肽的核芬 酸序列的新片段，所述方法是通过使用众多公知的序列对比程序中任何一 个，将编码PRO102S2多肽的核苷酸序列与其它已知核苷酸序列对比，测定 出其中哪个或哪几个编码PR010282多肽的核苷酸序列片段是新的。本文考 虑到了所有这类编码PR010282多肽的核苷酸序列，并且可以用不繁瑣的实 验予以测定。也考虑到由这些核苷酸分子片段编码的PRO10282多肽片段， 优选是含有抗-PRO10282抗体结合位点的那些PRO10282多肽片段。
在另 一实施方案中，本发明提供含有编码PRO10282或其变体的核香酸 序列的载体。该载体可含有上述鉴定的任何分离的核酸分子。
也提供含有此类载体的宿主细胞。例如，宿主细胞可以是CHO细胞、 大肠杆菌或酵母。进一步提供生产PRO10282多肽的方法，包括在适宜表达 PRO 10282的条件下培养宿主细胞并从细胞培养物中回收PRO 10282。
在另一实施方案中，发明提供由上面鉴定的任一分离的核酸序列所编码 的分离的PRO10282多肽。
一特定方面中，本发明提供分离的天然序列的PRO10282多肽，它在某 些实施方案中包括含有图2(SEDIDND:2)中自约1至约667残基，或者图 7 (SEQID NO : 5)自约1至约658残基的氨基酸序列。
另一方面，本发明涉及分离的PRO10282多肽，其包括与图2(SEQID NO: 2)中约1到约667残基所示氨基酸序列(包括两端残基在内)，或与图7 (SEQIDNO : 5)中从约1至约658的残基氨基酸序列(包括两端氨基酸残基在 内)具有至少约80%、优选至少约81%、更优选至少约82%、更优选至少 约83 % 、更优选至少约84 % 、更优选至少约85 % 、更优选至少约86 % 、更 优选至少约87%、更优选至少约88%、更优选至少约89%、更优选至少约 90 % 、更优选至少约91 % 、更优选至少约92 % 、更优选至少约93 % 、更优 选至少约94 % 、更优选至少约95 % 、更优选至少约96 % 、更优选至少约97 % 、 更优选至少约98% 、或更优选至少约99%同一性的氨基酸 列。再一方面，本发明涉及分离的PRO10282多肽，其含有与2000年1月 11日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1191 (DNA148380-2827)或2000 年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1405 (DNA148389-2827-1) 的人蛋白cDNA编码的氨基酸序列具有至少约80% 、优选至少约81 % 、更 优选至少约82 % 、更优选至少约83 % 、更优选至少约84 % 、更优选至少约 85%、更优选至少约86%、更优选至少约87%、更优选至少约88%、更优 选至少约89 % 、更优选至少约90 % 、更优选至少约91 % 、更优选至少约92 % 、 更优选至少约93 % 、更优选至少约94% 、更优选至少约95 % 、更优选至少 约96%、更优选至少约97%、更优选至少约98%或至少约99%同一性的氨 基酸序列。在一优选的实施方案中，分离的PRO10282多肽含有2000年1 月11日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1191 (DNA148380-2827)或2000 年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1405 (DNA 148389-2827-1) 的人蛋白cDNA编码的氨基酸序列。
另一方面，发明涉及分离的PRO10282多肽，其含有与图2(SEQ ID NO: 2)中约1到约667位残基的氨基酸序列(包括两端残基在内)或图7 (SEQ ID NO: 5)中约1到约659位残基的氨基酉l/f列(包括两端残基在内)相比，具有 至少约80%、优选至少约81%、更优选至少约82%、更优选至少约83%、 更优选至少约84%、更优选至少约85%、更优选至少约86%、更优选至少 约87 % 、更优选至少约88 % 、更优选至少约89 % 、更优选至少约90 % 、更 优选至少约91 % 、更优选至少约92% 、更优选至少约93 % 、更优选至少约 94%、更优选至少约95%、更优选至少约96。/。、更优选至少约97%、更优 选至少约98% 、或更优选至少约99%评分阳性的氨基酸序列。
本发明另一方面提供分离的PRO10282多肽，其要么跨膜结构域缺失 要么跨膜结构域失活。本文也描述产生该多肽的方法，该方法包括在适宜 PRO10282多肽表达的条件下培养含有适合编码核酸分子的载体的宿主细 胞，并从细胞培养物中回收PRO10282多肽。
照这样，本发明一方面涉及分离的可溶性PR010282多肽，其含有与图 2 (SEQ ID NO : 2),或图7 (SEQ ID NO : 5)中1至X氨基酸(所述X是图2 (SEQ ID NO : 2),或图7 (SEQ ID NO : 5)中自49至59的任何氨基酸)具有 至少约80%、优选至少约81%、更优选至少约82%、更优选至少约83%、 更优选至少约84%、更优选至少约85%、更优选至少约86%、更优选至少
13约87% 、更优选至少约88% 、更优选至少约89% 、更优选至少约90% 、更 优选至少约91%、更优选至少约92 % 、更优选至少约93 % 、更优选至少约 94%、更优选至少约95%、更优选至少约96%、更优选至少约97%、更优 选至少约98%、或更优选至少约99%序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的又一方面，该分离的可溶性PR010282多肽含有与图2(SEQ IDNO:2)或图7(SEQIDNO:5)中约1至X的残基氨基酸序列相比时，(其 中X是图2 (SEQ ID NO : 2)或图7 (SEQ ID NO : 5)中自49至59的任何氨 基酸)具有至少约80% 、优选至少约81 % 、更优选至少约82% 、更优选至少 约83 % 、更优选至少约84% 、更优选至少约85 % 、更优选至少约86% 、更 优选至少约87 % 、更优选至少约88 % 、更优选至少约89 % 、更优选至少约 90%、更优选至少约91%、更优选至少约92%、更优选至少约93%、更优 选至少约94 % 、更优选至少约95 % 、更优选至少约96 % 、更优选至少约97 % 、 更优选至少约98% 、或更优选至少约99%评分阳性的氨基酸序列。
还有一方面，本发明涉及分离的PRO10282多肽，其含有图2(SEQID N0 : 2)中从1约至约667残基的氨基酸序歹'j(包括两端氨基酸残基在内)，或 图7 (SEQ ID NO : 5)中从1约至约658残基的氨基酸序列(包括两端氨基酸残 基在内)，或其生物活性片段，或足以提供与抗-PR01282抗体结合位点的片
片段的鉴定，可以用本领域公知的常规技术来完成。这里的片段不是鼠Stra6 多肽的片段。优选地，PRO10282片段在性质上保留天然PRO10282多肽的
生物活性。
再一方面，本发明提供如下制备的多肽(i)在严格条件下，使测试DNA 分子与(a)编码具有图2(SEQIDNO: 2)中约1至约667残基的氨基酸序列(包 括两端残基在内)的PR010282多肽的DNA分子，或者(b)编码具有图7 (SEQ ID NO: 5)中约1至约658残基氨基酸序歹ll(包括两端残基在内)的PR019578 多肽的DNA分子，(c)(a)或(b)所述DNA分子的互补序列，进行杂交，且如 果该测试DNA分子与(a)或(b)或(c)具有至少约80% 、优选至少约81 % 、更 优选至少约82%、更优选至少约83%、更优选至少约84%、更优选至少约 85%、更优选至少约86%、更优选至少约87%、更优选至少约88%、更优 选至少约89 % 、更优选至少约90 % 、更优选至少约91 % 、更优选至少约92 % 、 更优选至少约93 % 、更优选至少约94 % 、更优选至少约95 % 、更优选至少约96%、更优选至少约97%、更优选至少约98%或至少约99%的核酸序列 同 一性，则(ii)在适宜表达该多肽的条件下培养含有该测试DNA分子的宿主 细胞，和(iii)从细胞培养物中回收该多肽。
在另 一实施方案中，本发明提供含有与异源多肽或氨基酸序列融合的 PRO10282多肽的嵌合分子，其中PROl0282多肽可含有前述任何PROl0282 多肽或其变体或片段。此嵌合分子的 一个实例是含有与免疫球蛋白表位标签 序列或Fc区融合的PRO10282多肽的嵌合分子。
在另一实施方案中，发明提供下述定义的与前述PR010282多肽特异结 合的抗体。任选地，抗体是单克隆抗体、抗体片段或单链抗体。
在另一实施方案中，本发明涉及下述定义的天然PRO10282多肽的激动 剂和拮抗剂。在一具体实施方案中，激动剂或拮抗剂是抗-PR010282抗体或 小分子。
在另一实施方案中，发明涉及鉴定PR010282多肽的激动剂或拮抗剂的 方法，方法包括使PR010282多肽与候选分子接触，并检测由所述PR010282 多肽介导的生物活性。优选地，PRO10282多肽是天然PRO10282多肽。
在另外一个实施方案中，本发明涉及含有本文所述PRO10282多肽、 PRO10282多肽的激动剂或拮抗剂、或抗-PR010282抗体、以及载体的组合 物。任选地，载体是可药用载体。
本发明另一实施方案涉及本文所述PRO10282多肽或其激动剂或拮抗 剂或抗-PR010282抗体在制备用于治疗对PRO10282多肽、其激动剂或拮抗 剂、或抗-PRO 10282抗体敏感的病症的药物中的应用。
再一方面，本发明涉及与PRO10282多肽特异结合的抗体。优选地，该 抗体诱导表达PR010282多肽的细胞死亡。在一具体优选的实施方案中，细 胞是与相同组织类型的正常细胞相比过度表达PR010282多肽的癌细胞。抗 体优选是人源化的或人抗体，并且包括抗体片段单链抗体。
另一方面，本发明涉及含有与PRO10282多肽特异结合的抗体的组合物。
还有一方面，本发明涉及编码与PRO10282多肽特异结合的抗体的分离 的核酸分子、含有该核酸的载体以及含有该载体的宿主细胞。本发明也涉及 生产抗-PRO 10282抗体的方法。
在另外一个实施方案中，本发明涉及检测在怀疑含有PRO10282多肽的样品中是否存在该多肽的方法，方法如此进行将样品暴露于抗-PR010282 抗体(或PRO10282的另一拮抗剂)，并测定样品中该抗体(或拮抗剂)与 PRO10282多肽的结合。在一具体重要的实施方案中，样品取自癌细胞。
在一不同的实施方案中，本发明涉及诊断哺乳动物肺瘤的方法，包括检 测在(a)取自该哺乳动物的测试组织样品中，和(b)取自相同细胞类型的已 知正常组织细胞的对照样品中，编码PR010282多肽的基因的表达水平。与 对照样品相比，测试样品中表达水平较高，表明测试组织所取自的哺乳动物 存在肿瘤。
根据本发明的另一方法，如下步骤诊断哺乳动物中的肿瘤(a)将抗 PRO10282抗体与取自该哺乳动物组织细胞的测试样品进行接触，和(b)检 测测试样品中抗体与PRO10282多肽之间复合物的形成。复合物形成，表明 哺乳动物中存在肿瘤。
另一方面，本发明涉及癌诊断试剂盒，其含有抗-PR010282抗体(或 PRO10282的不同拮抗剂)和在适宜包装中的载体。任选地，试剂盒也含有 指导使用抗体或其它拮抗剂来检测样品中存在PRO10282多肽的说明书。
还有一方面，本发明涉及抑制肿瘤细胞生长的方法，通过使表达 PRO10282多肽的肿瘤细胞暴露于抑制PRO10282多肽生物活性的有效量的 制剂中，从而抑制肿瘤细胞的生长。制剂可以例如是抗-PR010282抗体或 PRO10282的另一拮抗剂。肿瘤细胞可进一步暴露于常规的肿瘤治疗中，如 放射治疗、用细胞毒性剂和/或化疗剂治疗等。
另一不同方面，本发明涉及抑制肿瘤细胞生长的方法，通过使表达 PRO10282多肽的胂瘤细胞暴露于抑制该多肽表达的有效量的制剂中，从而 抑制肿瘤生长。
本发明进一步涉及阻止或减緩(减弱)以PRO10282多肽过度表达为特征 的肿瘤发展、生长或扩散的类似方法。该治疗可直接减少肿瘤细胞的病变， 或者使得肿瘤细胞对于其它治疗剂的治疗(例如放疗和/或化疗)更为敏感。本 发明特别包括控制异常或转移，控制对毗邻组织正常功能的干扰、控制细胞 因子或其它分泌产物非正常水平释放、控制炎症或免疫应答的抑制或加重等 的方法。
本发明进一步涉及一种制品，包括 一容器，贴在容器上的标签，和装 在容器中的含有活性剂的组合物；其中组合物对于抑制肿瘤生长是有效的，而贴在容器上的标签则注明该组合物用于治疗以肿瘤细胞中过度表达
PRO10282多肽为特征的病症是有效的。
再有一方面，本发明涉及鉴定抑制PRO10282多肽生物学或免疫学活性 的化合物的方法在控制条件下，使候选化合物与PRO10282多肽接触足够 长时间，以使两种组分相互作用，并检测PRO10282多肽的生物学或免疫学 活性是否被抑制。
另 一方面，本发明涉及鉴定抑制PRO10282多肽活性的化合物的方法， 包括下列步骤(a)在存在PR010282多肽、适宜由PR010282多肽正常地诱 导细胞应答的条件下，使细胞与被筛选的候选化合物接触，和(b)检测所述 细胞应答的诱导情况，以决定测试化合物是否是有效的拮抗剂。细胞应答诱 导缺乏，表明测试化合物是有效的拮抗剂。
本发明还涉及鉴定抑制在表达PRO10282多肽的细胞中表达该肽的化 合物的方法，通过使细胞与候选化合物接触，并测定表达是否被抑制。
本发明特别涉及通过本文筛选方法鉴定的PRO10282激动剂和拮抗剂。 此类激动剂和拮抗剂包括但不限于抗-PRO10282抗体、多肽、肽、和具有 激动剂或拮抗剂特性的小的有机分子。
本发明涉及以下各项
1. 一种分离的核酸分子，其包含与如下DNA分子有至少约80%序列 同 一性的DNA,所述如下DNA分子是指(a)编码PRO10282多肽的DNA分 子，该多肽包含图2(SEQIDNO:2)中从约1到约667位氨基酸残基的序列， 或(b)编码PR019578多肽的DNA分子，该多肽包含图7 (SEQ ID NO:5)中从 约1到约658位氨基酸残基的序列，或(c) (a)或(b)所述DNA分子的互补体。
2. 项l的分离的核酸分子，其包含(a)图l(SEQ ID NO:l)中从约49到 约2049位的核苷酸序列或(b)图6(SEQ IDNO:4)中从约186到约2159位的核 芬酸序列，或(c)(a)或(b)所述核苷酸序列的互补体。
3. 项1的分离的核酸分子，其包含图l(SEQ ID NO:l)或图6(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列。
4. 项1的分离的核酸分子，其包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序歹'j: (a)图2(SEQIDNO:2)中从约1到约667位氨基酸残基的序歹'J,或(b)图7(SEQ IDNO:5)中从约1到约658位氨基酸残基的序列。
5. —种分离的核酸分子，其包含与如下DNA分子有至少约80%序列同 一性的DNA: (a)编码同 一种成熟多肽的DNA分子，所述多肽由2000年 1月11日保藏在ATCC、保藏号为PTA-1181的人蛋白cDNA (DNA148380-2827)编码，(b)编码同一种成熟多肽的DNA分子，所述多肽由 2000年2月23日保藏在ATCC、保藏号为PTA-1405的人蛋白cDNA (DNA148389-2827-l)编码，或(c)(a)或(b)所述DNA分子的互补体。
6. 项5的分离的核酸分子，其包含编码同一种成熟多肽的DNA,所述 多肽由(a) 2000年1月11日保藏在ATCC、保藏号为PTA-1181的人蛋白 cDNA(DNA148380-2827)编码,或由(b)2000年2月23日保藏在ATCC、保 藏号为PTA-1405的人蛋白cDNA(DNA148389-2827-l)编码。
7. —种分离的核酸分子，其包含与如下序列有至少约80%序列同一性 的DNA: (a)2000年l月11日保藏在ATCC、保藏号为PTA-1181的人蛋白 cDNA(DNA148380-2827)的全长多肽编码序列，或(b)2000年2月23日保藏 在ATCC、保藏号为PTA-1405的人蛋白cDNA (DNA148389-2827-l)的全长 多肽编码序列，或(c)(a)或(b)的编码序列的互补体。
8. 项7的分离的核酸分子，其包含(a)2000年1月11日保藏在ATCC、 保藏号为PTA-1181的人蛋白cDNA(DNA148380-2827)的全长多肽编码序 列，或(b) 2000年2月23日保藏在ATCC、保藏号为PTA-1405的人蛋白 cDNA(DNA148389-2827-1)的全长多肽编码序列。
9. 一种分离的编码PRO10282多肽的核酸分子，其包含与以下核酸序 列的互补体杂交的DNA,所述以下核酸序列编码(a)图2(SEQ ID NO:2)中1 到约667位氨基酸或(b)图7(SEQIDNO:5)中1到约658位氨基酸。
10. 项9的分离的核酸分子，其中(a)编码图2(SEQ ID NO:2)中1到约 667位氨基酸的核酸包含图l(SEQ ID NO:l)中49到约2049位的核苷酸，和 (b)编码图7(SEQ ID NO:5)中1到约658位氨基酸的核酸包含图6(SEQ ID NO:4)中186到约2159位的核苦酸。
11. 项9的分离的核酸分子，其中所述杂交在严谨的杂交和洗涤条件下进行。
12. —种分离的核酸分子，其包含编码一种多肽的DNA,所述多肽与 如下氨基酸序列相比时阳性分值至少是80%: (a)图2(SEQ ID NO:2)中从1 到约667位的氨基酸残基的序列，或(b)图7(SEQ ID NO:5)中从1到约658 位的氨基酸残基的序列，或(c)(a)或(b)的DNA的互补体。13. —种分离的核酸分子，其包含至少约765个核苷酸，并且通过使待 测DNA分子在严谨杂交条件下与如下DNA分子杂交再分离该待测DNA分 子来制备(a)编码包含图2(SEQ IDNO:2)中从1到约667位氨基酸残基的序 列的PRO10282多肽的DNA分子，或(b)编码包含图7(SEQ ID NO:5)中从1 到约658位氨基酸残基的序列的PR019578多肽的DNA分子，或(c)(a)或(b) 的DNA分子的互补体。
14. 项13的分离的核酸分子，其具有与(a), (b)或(c)至少约80%的序列 同一性。
15. 包含项1至14任一项的核酸分子的载体。
16. 项15的载体，其中所述核酸分子可操作地连接到被该载体转化的 宿主细胞能识别的调控序列上。
17. 保藏在ATCC、保藏号为PTA-1181的核酸分子(DNA148380-2827) 或PTA-1405的核酸分子(DNA148389-2827-l)。
18. 包含项15的载体的宿主细胞。
19. 项18的宿主细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
20. 项18的宿主细胞，其中所述细胞是大肠杆菌。
21. 项18的宿主细胞，其中所述细胞是酵母细胞。
22. 制备Stra6多肽的方法，其包含在适合所述Stra6多肽表达的条件 下培养项18的宿主细胞并从细胞培养物中回收所述Stra6多肽。
23. 包含下述氨基酸序列的分离的Stra6多肽，所述氨基酸序列与(a)图 2(SEQ ID NO:2)中从约1到约667位的氨基酸残基的序列，或(b)图7(SEQ ID NO:5)中从约1到约658位的氨基酸残基的序列有至少约80%的序列同一性。
24. 项23的分离的Stra6多肽，其包含图2(SEQ ID NO:2)中从1到约 667位的氨基酸残基，或图7(SEQIDNO:5)中从1到约658位的氨基酸残基。
25. —种分离的Stra6多月大，其与(a)由2000年1月11日保藏在ATCC、 保藏号为PTA-1181的载体(DNA148380-2827)的cDNA插入子编码的多肽， 或(b)由2000年2月23日保藏在ATCC、保藏号为PTA-1405的载体 (DNA148389-2827-1)的cDNA插入子编码的多肽有至少大约80%的序列同 一性。
26. 项25的分离的Stra6多肽，其由(a) 2000年1月11日保藏在ATCC、 保藏号为PTA-1181的载体(DNA148380-2827)的cDNA插入子，或(b) 2000年2月23日保藏在ATCC、保藏号为PTA-1405的载体(DNA148389-2827-l) 的cDNA插入子编码。
27. —种分离的Stra6多肽，其与(a)图2(SEQ ID NO:2)中从1到约667 位的氨基酸残基的序歹'J，或(b)图7(SEQIDNO:5)中从1到约658位氨基酸残 基的序列比较时，阳性分值至少是80%。
28. —种分离的Stra6多肽，其包含(a)图2(SEQ ID NO:2)中从1到约667 位氨基酸残基的序列，或(b)图7(SEQ ID NO:5)中从1到约658位氨基酸残基 的序列，或(c)足以提供抗Stra6抗体结合位点的(a)或(b)的片段。
29. —种分离的多肽，其通过如下步骤制备(i)在严谨条件下使待测 DNA分子与编码Stra6多肽的DNA分子杂交，所述多肽包含(a)图2(SEQ ID NO:2)中1到约667位氨基酸残基的序列，或(b)图7(SEQ IDNO:5)中1到约 658位氨基酸残基的序列，或(c)(a)的DNA分子的互补体，(ii)在适合所述多 肽表达的条件下培养包含所述待测DNA分子的宿主细胞，和(iii)从所述细胞 培养物中回收所述多肽。
30. 项29的分离的多肽，其中所述待测DNA与(a)或(b)有至少约80 % 的序列同一性。
31. —种嵌合分子，其包含与异源氨基酸序列融合的Stra6多肽。
32. 项31的嵌合分子，其中所述异源氨基酸序列是表位标签序列。
33. 项31的嵌合分子，其中所述异源氨基酸序列是免疫球蛋白的Fc区。
34. 特异性结合Stra6多肽的抗体。
35. 项34的抗体，其诱导表达所述多肽的细胞死亡。
36. 项35的抗体，其中所述细胞是与同一组织类型的正常细胞相比所 述多肽过表达的癌症细胞。37.项34的抗体，其是单克隆抗体。38.项37的抗体，其包含非人的互补决定区(CDR)或人的框架区(FR)。39.项34的抗体，其是标"i己的抗体。40.项34的抗体，其是抗体片段或单链抗体。41.项34的抗体，其是人源化的抗体。42.一种物质组合物，其包含项34的抗体，所述抗体与可药用载体混43.项42的物质组合物，其包含治疗有效量的所述抗体。44. 项42的物质组合物，其进一步包含细胞毒制剂或化疗制剂。
45. —种分离的核酸分子，其编码项34的抗体。
46. 包含项45的核酸分子的载体。
47. 包含项46的载体的宿主细胞。
48. —种制备与Stra6多肽结合的抗体的方法，该方法包含在足以允许 所述抗体表达的条件下培养项47的宿主细胞，并从所述细胞培养物中回收 所述抗体。
49. 一种Stra6多肽的激动剂。
50. —种Stra6多肽的拮抗剂。
51. 项50的拮抗剂，其中所述拮抗剂抑制肿瘤细胞的生长。
52. —种物质组合物，其包含与可药用载体混合的(a) Stra6多肽，(b) Stra6 多肽的激动剂，(c) Stra6多肽的拮抗剂，或(d)抗Stra6抗体。
53. —种分离的核酸分子，其包含一种核苷酸序列，该核苷酸序列与如 下DNA分子有至少大约80%的序列同一性(a)编码图2(SEQ ID NO:2)或图 7(SEQ ID NO:5)中1到X位氨基酸的DNA分子，其中X是图2(SEQ ID NO:2) 或图7(SEQIDNO:5)中从49到59位的任何氨基酸。或(b)(a)的DNA分子的 互补体。
54. 项53的分离的核酸，其包含(a)编码图2(SEQIDNO:2)中1到X位 氨基酸的核苷酸序列，其中X是图2(SEQ ID NO:2)中49到59位的任何氨 基酸，或(b)(a)的核苷酸序列的互补体。
55. —种分离的核酸分子，其包含(a)编码一种多肽的核苷酸序列，该多 肽与图2(SEQ ID NO:2)或图7(SEQ ID NO:5)中从大约1到X位残基的氨基 酸序列相比时，阳性分值至少是大约80%,其中X是图2(SEQ ID NO:2)或 图7(SEQ ID NO:5)中从49到59位的任何氨基酸，或(b)(a)的核苷酸序列的 互^卜体。
56. —种分离的可溶性Stra6多肽，其包含一种氨基酸序列，该氨基酸 序列与图2(SEQ ID NO:2)或图7(SEQ ID NO:5)中1到X位的氨基酸有至少 大约80%的序列同一性,其中X是图2(SEQIDNO:2)或图7(SEQ ID NO:5) 中从49到59位的任何氨基酸。
57. 项56的可溶性Stra6多肽，其包含图2(SEQ ID NO:2)中1到X位 的氨基酸，其中X是图2(SEQ ID NO:2)中从49到59位的任何氨基酸。58. —种分离的可溶性Stra6多肽，其包含一种氨基酸序列，该氨基酸 序列与图2(SEQ ID NO:2)或图7(SEQ ID NO:5)中从1到X位氨基酸的氨基 酸序列相比时，阳性分值至少是大约80%,其中X是图2(SEQ ID NO:2)或 图7(SEQIDNO:5)中从49到59位的任何氨基酸。
59. —种确定怀疑有Stm6多肽的样品中所述多肽的存在的方法，该方 法包含使该样品暴露于抗Stra6抗体，并检测所述抗体与所述样品中所述多 肽的结合。
60. 项59的方法，其中所述样品包含怀疑含有Stra6多肽的细胞。
61. 项60的方法，其中所述细胞是癌症细胞。
62. —种"^断哺乳动物肿瘤的方法，该方法包含^r测如下纟羊品中编码 Stra6多肽的基因的表达水平(a)来自哺乳动物组织细胞的待测样品，和(b) 来自相同细胞类型的已知正常组织细胞的对照样品，其中，与对照样品相比 较，待测样品中较高的表达水平提示，该待测组织细胞的来源哺乳动物中肿 瘤的存在。
63. —种诊断哺乳动物肿瘤的方法，该方法包含(ayf吏抗Stra6抗体与来 源于哺乳动物组织细胞的待测样品接触，和(b)检测所述抗体与所述待测样品 中Stra6多肽之间复合物的形成，其中复合物的形成提示所述哺乳动物中肿 瘤的存在。
64. 项63的方法，其中所述抗体带有可检测的标记。
65. 项63的方法，其中所述组织细胞的待测样品是从怀疑有肿瘤细胞 生长或增生的个体获得的。
66. —种癌症诊断试剂盒，其在适当包装中包含抗Stra6抗体和一种载体。
67. 项66的试剂盒，其进一步包含使用所述抗体检测怀疑有Stra6多肽 的样品中该多肽的存在的i兌明。
68. —种抑制肿瘤细胞生长的方法，该方法包含使表达Stra6多肽的肺 瘤细胞暴露于有效量的一种制剂，该制剂抑制所述多肽的生物活性，从而抑 制所述肺瘤细胞的生长。
69. 项68的方法，其中所述胂瘤细胞与相同组织类型的正常细胞相比， 所述Stra6多肽是过表达的。
70. 项68的方法，其中所述制剂是抗Stra6抗体。71. 项70的方法，其中所述抗Stra6抗体诱导细胞死亡。
72. 项68的方法，其中所述肺瘤细胞进一步暴露于放射治疗，细胞毒 制剂，或化疗制剂。
73. 项68的方法，其中所述肿瘤细胞进一步暴露于刺激编码Stra6的基 因表达的制剂。
74. 项73的方法，其中所述制剂是视黄酸或其类似物。
75. 项68的方法，其中所述制剂是一种与编码Stra6多肽的核酸杂交的 反义寡核苷酸或其互补体。
76. 项75的方法，其中所述肿瘤细胞进一步暴露于放射治疗，细胞毒 制剂，或化疗制剂。
77. 项75的方法，其中所述肿瘤细胞进一步暴露于刺激编码Stra6的基 因表达的制剂。
78. 项77的方法，其中所述制剂是^f见黄酸或其类似物。
79. —种制品，其包含 一种容器
容器上的标签；和
一种组合物，所述组合物包含容纳在所述容器中的活性制剂，其中所述 组合物可有效抑制肿瘤细胞的生长，并且所述容器上的标签提示该组合物可 有效治疗以所述肿瘤细胞相对于相同组织类型的正常细胞而言过表达Stra6 多肽为特征的情况。
80. 项79的制品，其中所述活性制剂抑制所述Stra6多肽的生物活性和
81. 项80的制品，其中所述活性制剂是抗Stra6抗体。
82. 项81的制品，其中所述活性制剂是一种反义寡核苷酸。
83. —种鉴定抑制Stra6多肽的生物学或免疫学活性的化合物的方法， 该方法包含使候选化合物与所述多肽在足以使这两种成分相互作用的条件 下和时间内接触，并确定所述多肽的生物学或免疫学活性是否被抑制。
84. 项83的方法，其中所述候选化合物或所述Stra6多肽被固定在一种 固体支持物上。
85. 项84的方法，其中的非固定成分带有可冲企测的标记。
86. —种鉴定抑制Stra6多肽活性的化合物的方法，该方法包含如下步骤(a)在适于通常由所述Stra6多肽诱导的细胞应答被诱导的条件下，在所 述Stra6多肽存在下，使细胞与待筛选的候选化合物接触，并(b)测定所述细 胞应答的诱导，以确定该待测化合物是否是Stra6活性的有效抑制剂，其中 所述细胞应答的诱导的缺失提示所述化合物是有效的抑制剂。
87. 鉴定抑制表达Stra6多肽的细胞中所述多肽表达的化合物的方法， 其中所述方法包含使所述细胞与候选化合物接触，确定所述Stra6多肽的表 达是否受到抑制。
88. 项87的方法，其中所述候选化合物是一种抗体。
89. 项87的方法，其中所述候选化合物是一种反义寡核苷酸。
90. —种抑制Stra6多肽的生物学或免疫学活性的化合物，其通过如下 方法鉴定，该方法包括使候选化合物与所述Stra6多肽在足以使这两种成分 相互作用的条件下和时间内接触，确定所述Stra6多肽的生物学或免疫学活 性是否被抑制。
91. 项90的化合物，其是一种抗体。
92. 项90的化合物，其是一种小分子、。
93. 抑制Stra6多肽活性的Stra6拮抗剂化合物，其通过包括如下步骤 的方法鉴定(a)在适于通常由所述Stra6多肽诱导的细胞应答被诱导的条件 下，在所述Stra6多肽存在下，使细胞与待筛选的候选化合物接触，(b)测定 所述细胞应答的诱导，以确定该待测化合物是否是有效的拮抗剂，其中所述 细胞应答的诱导的缺失提示所述化合物是有效的Stra6拮抗剂。
94. 项93的化合物，其是一种抗体。
95. 项93的化合物，其是一种小分子。
附图简述
图1显示含有编码天然序列PRO10282的核苷酸序列(核香酸 l-2732)cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO: 1),其中该核苷酸序列(SEQ ID NO: l)是本文称为"DNA 148380-2827'，的克隆。也以粗字体和下划线标出各自的 起始和终止密码子的位置。
图2显示衍生自SEQ ID NO: 1中编码序列的天然序列PRO10282多肽 的氨基酸序列(SEQIDNO: 2)。也显示各种其它重要多肽结构域的近似位置。
图3A-3D显示使用ALIGN-2序列比较计算机程序，用下述方法测定氨基酸序列同一性％ (表3 (A-B))和核酸序列同一性。/。(表3 (C-D))的假设的 例证，其中"PRO"表示假设的目标PRO10282多肽的氨基酸序列，"对照蛋白 质"表示使目标"PRO"多肽与其进行比较的多肽的氨基酸序列，"PRO-DNA" 表示假设的编码PRO10282的目标核酸序列，"对照DNA"表示使目标核酸分 子"PRO-DNA"与其进行比较的核酸分子的核苷酸序列，"X"、 Y"和"Z"各自 代表不同的假定氨基酸残基，而"N"、 "L"和"V"各自代表不同的假定核苷酸。
图4A-4Q提供ALIGN2序列对比计算机程序的全部源序列码。为在 UNIX操作系统上使用，可以对该源序列码进行常^见编制，以提供ALIGN2 序列对比计算机程序。
图5显示本文指定为DNA100038 (SEQ ID NO : 3)的核芬酸序列。
图6显示含有编码天然序列人Stra6多肽变体的核苷酸序列(核苷酸 l-2778)的cDNA的核苦酸序列(SEQIDNO:4),其中核苷酸序列(SEQ ID NO :4)是本文指定为"DNA148389-2827-l"的克隆。也以4且体和下划线标出 各自起始和终止密码子的位置。
图7显示衍生自SEQ ID ND : 4编码序列的天然序列人Stra6多肽变体 的氨基酸序列(SEQ ID NO : 5)。也显示各种其它重要多肽结构域的近似位 置。
图8是图式表示DNA 148380-2827 (天然的人PRO10282)编码的鼠 Stra6和人Stra6蛋白。
图9显示DNA 148380-2827 (天然的人PRO10282)编码的天然序列人 Stra6蛋白的疏水性。
图10显示DNA148380-2827编码的天然序列人Stra6蛋白在各种正常 人组织中的相对RNA表达情况。
图11显示用定量PCR测定，DNA148380-2827编码的天然序列人Stra6 蛋白在人结肠肿瘤组织中相对于在同一患者正常粘膜中RNA表达的RNA 折叠(fold)表达。数据来自同一试验中所作的一式三份实验。使用不同套PCR 引物，至少重复试验2次。
图12A显示使用看家基因GAPDH作对照，DNA 148380-2827编码的天 然序列人Stra6蛋白在人结肠组织中相对于在同一患者正常粘膜中RNA表 达的RNA表达。
图12B显示通过原位杂交，Stra6在结肠腺癌的上皮肿瘤细胞上的定位。图13显示DNA148380-2827编码的天然人Stra6蛋白在人乳腺、肾、 结肠和肺胂瘤细胞系中相对于在相应正常细胞系中的RNA表达。
图14图例说明衍生自DNA148380-2827编码的天然序列人Stra 6蛋 白的肽片段在大肠杆菌中的表达。
图15描述人结肠癌细胞中，分别在存在和不存在全反式视黄酸(ATRA) 和9-顺式-视黄酸(9cRA)的条件下，Stra6 RNA的表达。
图16是Stra6在肿瘤切片上的原位杂交情况。显示出证明银粒(A， C， E, G)的暗视野图像和对应的苏木精-伊红染色的明亮视野图像(B， D， F, H)。在恶性黑素瘤冲，中等密度的银粒压在肿瘤细胞上而不压在血管上(A， B)。在子宫内膜腺癌中，肿瘤上皮被适度地标记上而肿瘤基质呈阴性(C， D)。 在Wilm's肿瘤的发育不全的区域显示高表达水平，而肿瘤基质呈阴性(E, F)。嗜铬细胞瘤显示非常高的Stra6mRNA表达，而相邻的正常肾上腺皮质 则呈阴性(G, H)。 刻度棒=100微米。
图17 (A)对9-顺式-RA或全反-RA应答，在C57MG/ Parent和 C57MG/Wnt-1细胞中Stra6 mRNA表达的诱导。(B)对条件介质中的 Wnt-3A和9-顺式-RA应答，在C57MG/Parent细胞中Stra6 mRNA表达的 诱导。(C)视黄酸处理后，在HCT116和WiDr结肠腺癌细胞中Stra6 mRNA 表达的诱导。(D)用视黄酸处理前(上组)和处理后(下组)，经在HCT116细胞 原位杂交证明Stra6表达的暗野图像。(E)视黄酸治疗前(-RA)和治疗后 (+RA),通过用直接针对人Stra6肽B的单克隆抗体进行的Western印迹， 观察到WiDr细胞中Stra6蛋白的表达。(F)在未用视黄酸处理(左组)或用 视黄酸处理(右组)的WiDr细胞中Stra6的膜定位。用抗人Stra6肽B单克隆 杂交瘤培养物上清液(克隆12F4. 2H9. 1D5)进行免疫组织化学检测。试验用 A-F表示，用视黄酸处理细胞48小时。完成定量PCR反应(每个进行40循 环)后得到的Stra6产物示于下面每一图的A-C中。
图18 (A) Wnt-l诱导RARy-l表达。在不含四环素0、 24、 48或72 小时的条件下，得自四环素可抑制细胞C57MG/Wntl细胞的蛋白-等量的全 细胞溶解产物，接受SDS-PAGE以及RARy-l和ERK2的免疫印迹分析。 (B)在Wnt-l转基因小鼠增生的乳腺和乳腺肿瘤中RAR y -1 mRNA的表达。 用定量RT-PCR测定mRNA的表达，相对于野生型乳腺中mRNA的表达， 数据用表达倍数进行表述。优选实施方案详述 I.定义
术语"PR010282多肽"、"PRO10282蛋白"、"PRO10282"、 "Stra6多肽"、 "Stra6蛋白"和"Stra6"互换使用，并涵盖天然序列PRO10282 (Stra6)和 PRO10282 (Stra6)多肽变体(本文将作进一步定义)。PRO10282 (Stra6)多肽可
以是从各种来源(如人组织或其它来源)分离得到的，或者是用重组和/或合成 方法制得。
"天然序列PRO10282"或"天然序列Stra6"，包括具有与得自天然 PRO10282相同的氨基酸序列的多肽。此天然序列PRO10282 (Stra6)可以是 从自然界分离得到的，或者是用重组和/或合成方法制得的。术语"天然序列 PRO10282"或"天然序列Stra6"，特别包括PR010282的天然截短型或分泌型 (例如，细胞外结构域序列)、天然变体型(例如，可替换式剪切型)和天然等 位变体。在本发明一实施方案中，天然序列PRO10282是包括图2(SEQ ID NO: 2)中1至667氨基酸的成熟或全长天然序列PRO10282。在本发明另一实施 方案中，天然序列PRO10282多肽是包括SEQ ID NO: 5中1至658氨基酸 的成熟或全长天然序列PR019578多肽，后者据信是SEQ ID NO: 2的天然 序列PRO10282的可替换式剪切型。并且，尽管图2 (SEQ ID NO: 2)和图7 (SEQ ID NO: 5)公开的PRO10282多肽显示由本文定义为位置1的蛋氨酸残 基开始，但是图2 (SEQ ID NO: 2)或图7 (SEQ ID NO: 5)中氨基酸1位上游或 下游的另一蛋氨酸残基作为PRO10282多肽的起始氨基酸残基是可以想象到 的和可能的。
PRO 10282多肽(Stra6)"细胞外结构域"或"ECD",是指PRO 10282多肽 基本上不含跨膜和胞质结构域的一种形式。通常，PRO10282多肽ECD具 有小于约1 %的此类跨膜和/或胞质结构域，优选具有小于约0.5%的此类 结构域。应当懂得，所确定的本发明PRO10282多肽的任何跨膜结构域(一个 或多个)是依据本领域在鉴定疏水结构域类型中常规使用的标准而确定的。 跨膜结构域的精确的边界会有不同，但在最初确定的结构域的两末端之一最 多不超过约5个氨基酸。因此，在本发明的一实施方案中，人PRO10282多 肽的细胞外结构域包括氨基酸1至X;其中X是图2 (SEQ ID NO : 2)或图7 (SEQ ID NO : 5)中从氨基酸49到59的任何氨基酸。"PRO10282变体多肽"或"Stra6变体多肽"，这些术语是可互换使用的， 它们指如下定义的与下列氨基酸序列具有至少约80 %氨基酸序列同 一性的 活性PRO10282多肽(Stra6): (a)图2 (SEQ ID NO: 2)所示PRO10282多肽的 1至667残基或图7(SEQIDNO: 5)所示PRO10282多肽的1至658残基的氨 基酸序列，(b)图2(SEQIDNO:2)或图7 (SEQ ID NO: 5)中1至X残基的氨 基酸序列，其中X是图2(SEQIDNO: 2)或图7 (SEQ ID NO: 5)中氨基酸49 至59的任何氨基酸，或者(c)衍生自图2 (SEQ ID NO: 2)或图7 (SEQ ID NO: 5)所示氨基酸序列的另一特定片段。此类PRO10282(Stra6)变体多肽包括，例 如，在图2 (SEQ ID NO: 2)或图(SEQ ID NO: 5)中所示序列的N-和/或C-末 端以及在一个或多个内部结构域内增加或删减一个或多个氨基酸残基的 PRO10282多肽。通常，PRO10282变体多肽与(a)图2 (SEQ ID NO: 2)所示 PRO10282多肽的1至667残基的氨基酸序列或图7 (SEQ ID NO: 5)所示 PRO10282多肽的1至658残基的氨基酸序列，(b)图2 (SEQ ID NO: 2)或图 7 (SEQ ID NO: 5)中1至X残基的氨基酸序列，其中X是图2 (SEQ ID NO: 2) 或图7(SEQIDNO:5)中氨基酸49至59的任何氨基酸，或者(c)衍生自图2 (SEQIDNO:2)或图7 (SEQ ID NO: 5)所示氨基酸序列的另 一特定片段，具 有至少约80% 、优选至少约81 % 、更优选至少约82% 、更优选至少约83 % 、 更优选至少约84%、更优选至少约85%、更优选至少约86%、更优选至少 约87%、更优选至少约88%、更优选至少约89%、更优选至少约卯％、更 优选至少约91 % 、更优选至少约92% 、更优选至少约93 % 、更优选至少约 94 % 、更优选至少约95 % 、更优选至少约96 % 、更优选至少约97 % 、更优 选至少约98%或至少约99。/。的氨基酸序列同一性。PR010282变体多肽不包 括天然PRO10282多肽序列。 一般地，PRO10282变体多肽的长度是至少约 10个氨基酸，经常是至少约20个氨基酸，更经常是至少约30个氨基酸，更 经常是至少约40个氨基酸，更经常是至少约50个氨基酸，更经常是至少约 60个氨基酸，或者至少约70个氨基酸，更经常是至少约80个氨基酸，更经 常是至少约90个氨基酸，更经常是至少约100个氨基酸，或者至少约150 个氨基酸，更经常是至少约200个氨基酸，更经常是至少约250个氨基酸， 更经常是至少约300或更多个氨基酸，并且不同于鼠Stra6序列的片段，见 Bouillet等，Mechanisms of Development 63, 173-186 (1997)。
关于本文鉴定的PRO10282 (Stra6)多肽序列的"氨基酸序列同一性百分比(％)",是指候选序列的氨基酸残基，在进行序列对比并在必要时导入空隙 以获取最大百分比的序列同 一性，而不将任何保守取代视为序列同 一性时，
与PRO10282序列的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域各种方法进行
序列对比以便测定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用公众可得到的计算
才几软件如BLAST、 BLAST-2、 ALIGN、 ALIGN誦2或Megalign (DNASTAR) 软件。本领域技术人员可以决定测量对比的适宜参数，包括针对所比较的序 列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为此目的，氨基酸序列同一性％ 值是使用下述序列对比计算机程序ALIGN-2而获得的，其中ALIGN-2程序 的全部源代码见表4A-Q 。 ALIGN-2序列对比计算机程序的作者是 Genentech， Inc.,表4A-Q所示源代码和用户数据 一起已经提交地处 Washington D. C., 20559的美国版权局，其美国版4又注册登记号为 TXU510087。 乂〉众通过Genentech， Inc., South San Francisco, California可 以得到ALIGN-2程序，或者可从表4A-Q提供的源代码进行编制。ALIGN2 程序应当为在UNIX操作系统，优选在数码UNIX V4.0D使用而进行编制。 ALIGN-2程序设定了所有序列对比参数并且不变。
为了本发明目的，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的氨基 酸序列同一性％(或者这样说给定氨基酸序列A具有或含有给定氨基酸序 列B相同氨基酸序列的％ )如下计算
X/Y比值乘以100
其中X是用序列对比程序ALIGN-2比较A和B的氨基酸残基后计算出 的相同氨基酸数，其中Y是B的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序 列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的氨基酸序列同一性％ 将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％ 。作为计算氨基酸序列同一性％ 的一个实例，表3A-B说明如何计算指定为"对照蛋白"的氨基酸序列与指定 为"PRO"的氨基酸序列的序列同 一性％ 。
除非另外特别声明，否则本文所用所有氨基酸序列同 一性％值是按照上 述使用ALIGN-2序列对比计算机程序获得的。然而，氨基酸序列同一性％ 也可使用序列对比程序NCBI-BLAST2 (Altschul等，Nucleic acids Res. 25: 3389-3402 (1997))进行测定。NCBI-BLAST2序列对比程序可从http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov下载。NCBI-BLAST2使用数种检索参数，其中所有这些 参数设定为默认值，包括例如，非掩蔽=是(yes),链(strand)=全部(^1),预期的出现=10，最低复杂长度=15/5，多-程e-值二0.01,多-程常数=25,最 终缺口化对比的陡降(dropoff)- 25，和评分矩阵=BLOSUM62。
当使用NCBI-BLAST2进行氨基酸序列比较时，给定氨基酸序列A针对 给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者说，给定氨基酸序列A具有 或含有与给定氨基酸序列B相同的氨基酸序列的％)如下计算
X/Y比^f直乘以100
其中X是用序列对比程序NCBI-BLAST2比较A和B氨基酸残基后计 算出的相同氨基酸数量，其中Y是B的氨基酸残基总数量。可以理解，当 氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A针对B的氨基酸序列同 一性％将不等于B针对A的氨基S1^列同 一性％ 。
"PRO10282变体多核香酸"或"PR010282变体核酸序歹'「'是指编码下述 定义的活性PRO10282多肽的多核苷酸分子，它与(a)编码图2(SEQ ID NO: 2) 所示PRO10282多肽的1至667残基的氨基酸序列的核苦酸序列或编码图7 (SEQ ID NO: 5)中1至658残基的氨基酸序列的核苷酸序列，(b)编码图2 (SEQIDNO: 2)或图7(SEQIDNO: 5)中1至X氨基酸的核苦酸序列，其中X 是图2 (SEQ ID NO: 2)或图7 (SEQ ID NO: 5)中49至59的任何氨基酸，或 者(c)编码衍生自图2(SEQ ID NO: 2)或图7(SEQ ID NO: 5)所示氨基財列 的另'一特定片段的核苷酸序列，具有至少约80%的氨基酸序列同一性。通常， PRO10282变体多核苷酸与(a)编码图2 (SEQ ID NO: 2)所示PRO10282多肽 的1至667残基的氨基酸序列的核苷酸序列或编码图7 (SEQ ID NO: 5)中1 至658残基的氨基酸序列的核苷酸序列，(b)编码图2(SEQIDNO:2)或图7 (SEQIDNO: 5)中1至X氨基酸的核苷酸序歹寸，其中X是图2(SEQIDNO: 2) 或图7 (SEQ ID NO: 5)中49至59的任何氨基酸，或者(c)编码衍生自图 2(SEQ ID NO: 2)或图7(SEQ ID NO: 5)所示氨基酸序列的另一特定片段的核 芬酸序列，具有至少约80%、优选至少约81%、更优选至少约82%、更优 选至少约83 % 、更优选至少约84 % 、更优选至少约85 % 、更优选至少约86 % 、 更优选至少约87%、更优选至少约88%、更优选至少约89%、更优选至少 约90%、更优选至少约91%、更优选至少约92%、更优选至少约93%、更 优选至少约94% 、更优选至少约95% 、更优选至少约96% 、更优选至少约 97%、更优选至少约98%或至少约99%的核酸序列同一性。PRO10282多核 苦酸变体不包括天然PRO10282核苷酸序列或天然PR019578核苦酸序列。一般地，PRO10282(Stra6)变体多核香酸的长度是至少约30个核苷酸， 经常是至少约60个核苷酸，更经常是至少约90个核苦酸，更经常是至少约 120个核苷酸，或者至少约150个核芬酸，更经常是至少约180个核芬酸， 更经常是至少约210个核苷酸，更经常是至少约240个核苦酸，或者至少约 270个核苷酸，更经常是至少约300个核苦酸，更经常是至少约450个核苷 酸，或至少600个核芬酸，或至少900或更多个核芬酸，而且特别排除包含 在鼠Stra6核苦酸序列内的多核香酸，参见Bouillet等，Mechanisms of Development 63, 173 -186 (1997)所公开的内容。
有关本文鉴定的编码PROl0282(Stra6)多肽的核酸序列的"核酸序列同 一性百分比(％)",是指候选序列中与编码PR010282多肽的核酸序列相比时， 具有相同核苷酸的百分数，这是在对比序列，和如果必要则引入空隙，以达 到最大序列同一性百分比的前提下获得的。为测定核苷酸序列同一性百分比 而进行的序列对比，可使用本领域各种方法，例如，使用公众可得到的计算 才几软件如BLAST 、 BLAST-2、 ALIGN 、 ALIGN-2或Megalign(DNASTAR) 软件。本领域技术人员可以决定用于测量对比的适宜参数，包括针对所比较 序列的全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为此目的，核芬酸序列同 一性％值是如下述使用序列对比计算机程序ALIGN-2而获得的，其中 ALIGN-2程序的全部源代码见表4A-Q。 ALIGN-2序列对比计算机程序的作 者是Genentech， Inc.,表4A-Q所示源代码和用户数据一起已经提交地处 Washington D. C. ， 20559的美国版权局，其美国版权注册登记号为 TXU510087。公众通过Genentech, Inc., South San Francisco, California可 以得到ALIGN-2程序，或者从表1提供的源代码进行编制。ALIGN2程序应 当为在UNIX操作系统，优选在数码UNIX V4.0D使用而进行编制。ALIGN-2 程序设定了所有序列对比参数并且不变。
为了本发明目的，给定核酸序列C相对于给定核酸序列D的核酸序列 同一性％(或者这样说给定核酸序列C具有或含有与给定核酸序列D相同 的核酸序列的％)如下计算
W/Z比〗直乘以100 其中W是用序列对比程序ALIGN-2比较C和D后计算出的相同核苷 酸的数量，和其中Z是D的核苷酸总数量。可以理解，当核酸序列C与核 酸序列D的长度不相等时，C针对D的核酸序列同一性％将不等于D针对C的核酸序列同一性％。作为计算核酸序列同一性％的一个实例，表3C-D 说明如何计算指定为"对照DNA"的核酸序列与指定为"PRO-DNA"的核酸序 列的同一性％。
除非另外特别声明，否则本文所用所有核酸序列同 一性％值是按照上述 使用ALIGN-2序列对比计算机程序获得的。然而，核酸序列同一性％也可 使用序列对比程序NCBI-BLAST2 (Altschul等，Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))进行测定。NCBI-BLAST2序列对比程序可从http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov下载。NCBI-BLAST2使用数种检索参数，其中所有这些 参数设定为默认值，包括例如，非掩蔽yes,链=全部，预期的出现=10, 最低复杂长度=15/5，多-程e-值=0.01，多-程常数=25，最终缺口化对比的 陡降=25,和评分矩阵=BLOSUM62。
当使用NCBI-BLAST2进行序列比较时，给定核酸序列C与给定核M^ 列D的核酸序列同一性％(或者说，给定核酸序列C具有或含有与给定核酸 序列D相同的核S吏序列的。/。)如下计算
W/Z比值乘以100
其中W是用序列对比程序NCBI-BLAST2比较C和D后计算出的相同 核苷酸数量，和其中Z是D的核苷酸总数量。可以理解，当核酸序列C与 核酸序列D的长度不相等时，C针对D的核酸序列同一性。/o将不等于D针 对C的核酸序列同一性。/。。
在其它实施方案中，PRO10282(Stra6)变体多核苷酸是编码活性 PRO10282多肽的核酸分子，它能够与编码图2(SEQIDNO: 2)或图7(SEQ ID NO: 5)所示全长PRO10282多肽的核苷酸序列杂交(优选地在严格杂交和洗 涤条件下杂交)。PRO10282变体多肽可以是由PRO10282变体多核苦酸编码 的那些多肽。
在如上述进行氨基酸序列同一性比较时使用的术语"阳性"，不仅包括所 比较的序列中相同的氨基酸残基，也包括其中具有相似特性的氨基酸残基。 针对目的氨基酸残基评分为阳性值的氨基酸残基是那些与目的氨基酸残基 相同或是目的氨基酸残基的首选取代的氨基酸残基。(见下表l中定义)。
为了本发明目的，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的氨基 酸序列阳性值％(或者这样说给定氨基酸序列A具有或含有与给定氨基酸 序列B相同的氨基酸序列的阳性％ )如下计算X/Y比值乘以100
其中X是用上述序列对比程序ALIGN-2比较A和B后得出的如上定义 的评分阳性氨基酸数量，其中Y是B的氨基酸残基总数量。可以理解，当 氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A针对B的阳性％将不等 于B针对A的阳性％。
当用"分离的"来描述本文的各种多肽时，是指已从天然环境的组成中鉴 定和分离和/或回收的多肽。优选地，分离的多肽与其天然结合的所有组分没 有任何结合。多肽的天然环境中的污染成分是那些将干扰使用多肽进行诊断 和治疗的物质，可包括酶、激素和其它蛋白性或非-蛋白性溶质。在优选的 实施方案中，多肽被纯化为(l)使用转杯式蛋白测序仪，达到足以获得N-末端或内部氨基酸序列至少15个残基的程度，或者(2)达到在非-还原或还原 条件下经SDS-PAGE电泳和考马斯蓝或优选银染色证实为同质性的程度。分 离的多肽包括在重组细胞内的原位多肽，因为PRO10282(Stra6)自然环境中 的至少一个组分是不存在的。然而，通常用至少一个纯化步骤来制备分离的 多肽。
编码PRO10282(Stra6)多肽的"分离的"核酸分子，是从PRO10282编码 核酸的天然来源中通常与其结合的至少一种杂质核酸分子中鉴定并分离的 核酸分子。优选地，所述分离的核酸与其天然结合的所有组分没有任何结合。 一分离的编码PRO10282的核酸分子不同于其天然形式或组合(setting)。因 此，分离的编码PR010282的核酸分子区别于其在天然细胞中的存在形式。 但是，编码PRO10282(Stra6)多肽的分离的核酸分子，包括通常表达 PRO10282的细胞中所含的PRO10282-编码核酸分子，例如，所述核酸分子 与天然细胞中相应核酸分子所在的染色体位置不同。
术语"控制序列"，指在特定宿主生物中使可操作连接的编码序列表达所 需的DNA序列。适于原核生物的调控序列可包括如启动子，任选搡纵子序 列，和核糖体结合位点。已知真核生物细胞利用启动子、聚腺苦酸化信号和 增强子。
当 一种核酸与另 一种核S臾序列处于功能相关的位置时，该核酸与该另一 种核酸"可操作相连"。例如如果一种多肽表达为参与该多肽的分泌的前体 蛋白，则将前序列或分泌前导序列的DNA与该多肽的DNA可操作相连； 启动子或增强子当能影响编码序列的转录时可与该编码序列可操作相连；或核糖体结合位点当其位置能促进翻译时可与编码序列可操作相连。通常"可
操作相连"指被连接的DNA序列是相邻的，而且，如果是分泌前导序列，
则相邻且为阅读状态。然而，增强子不必是相邻的。连接可通过在方便的限 制性位点相连而实现。如果不存在这样的位点，可根据常规实践使用合成的 寡核苷酸衔接子或接头。
本文所用术语"抗体"是指最广义上的抗体，并特别包括例如单链抗
-PRO10282单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体)、具有多表位特异 性的抗-PRO 10282抗体组合物、单链抗-PRO 10282抗体和抗-PRO 10282抗体 的片段(见下述)。本文中术语"单克隆抗体"，是指来自基本上同质的抗体群 的抗体，即除了可能少量存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。
杂交反应的"严格度"由本领域技术人员很容易地确定，通常根据经验在 考虑探针长度、洗涤温度和盐浓度的基础上计算得出。 一般而言，长的探针 需要较高的温度以便正确退火，而短的探针需要较低温度。杂交通常取决于 变性的DNA在低于解链温度的环境中存在互补序列时的重退火能力。探针 和杂交序列之间所需同源程度越高，则可使用的相对温度越高。结果是，相 对温度较高将使反应条件趋于更加严格，而较低温度则使反应的严谨度较 小。有关杂交反应的严格度的其它细节和解释，见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biologv, Wiley Interscience Publishers, (1995)。
本文的"严格条件"或"高度严格条件"，可以定义为(l)使用低离子强度 和高温洗涤，例如，50°C 0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1 %十二烷基 硫酸钠；(2)在杂交过程中42。C使用变性剂如曱酰胺，譬如，含0.1%牛血 清白蛋白的50 % (v/v)曱酰胺/0.1 % Ficoll/0.1 %聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠 緩冲液pH 6.5及750 mM氯化钠，75 mM柠檬酸钠；或者(3) 42。CM吏用50 % 甲酰胺、5xSSC(0.75MNaCl， 0.075 M杵檬酸钠)、50 mM磷酸钠(pH6.8)、 0.1 %焦磷酸钠、5 x Denhardt's溶液、超声处理的鲑精DNA(50 |ig/ml)、 0.1 % SDS和10%硫酸葡聚糖，于42。C在0.2 x SSC(氯化钠/杼檬酸钠)中和于55 。C在50%曱酰胺中洗涤，接着于55。C用含EDTA的0.1 x SSC进行高度严 格洗涤。
"中等严格条件"可以按照Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ， New York: Cold Spring Harbor Press, 1989的定义，包括使用严格度低于前述的洗涤溶液和杂交条件(例如，温度，离子强度和SDS。/。)。中等严
;f各条件的一个实例是，于37。C在如下组成的溶液中过夜温育20%曱酰胺， 5xSSC(150mMNaCl， 15 mM柠檬酸三钠)，50 mM磷酸钠(pH 7.6)， 5x Denhardt's溶液，10%硫酸葡聚糖和20 mg/ml变性剪切的鲑精DNA,接着 于37-50。C在l x SSC中洗涤杂交膜。本领域熟练技术人员懂得如何必要地 调整温度、离子强度等条件以适应诸如探针长度等因素。
本文使用的术语"表位标签"，是指含有与"标签多肽"融合了的 PRO10282多肽的嵌合多肽。该标记多肽具有足够多的残基以提供针对所制 备抗体的表位，而且要足够短以便它不干预与其融合的多肽的活性。标记多 肽也优选确实是独一无二的，以便该抗体与其它表位基本上不发生交叉反 应。通常，适宜的标记多肽至少有6个氨基酸残基， 一般为约8 50个氨基 酸残基(优选为约10~20个氨基酸残基)。
本文所用术语"抗体"是指最广义上的抗体，并特别包括例如单链抗 -PRO10282(抗-Stra6)单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体)、具有多 表位特异性的抗-PR010282抗体组合物、单链抗-PRO 10282抗体和抗 -PRO10282抗体的片段(见下述)。
本文中术语"单克隆抗体"，是指来自基本上同质的抗体群的抗体，即除 了可能少量存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。
"抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选是完整抗体的抗原结合或可变 区。抗体片段的实例包括Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片段；二价抗体；线形抗 体(Zapata等，Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]);单链抗体分子；和由抗 体片段形成的多特异抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体可产生两个相同的各带有单个抗原结合位点的抗 原结合片段(称为"Fab"片段)和残余的"Fc"片段，Fc段的名称反应了其 易于结晶的能力。经胃蛋白酶处理可产生具有两个抗原结合位点并仍然能交 联抗原的F(ab')2片段。
"Fv"是含有完整的识别和结合位点的最小抗体片段。此区由一个重链 可变区与一个轻链可变区紧密地非共价连接形成的二聚体组成。在这个构象 中每个可变区的三个CDR相互作用，在Vh-Vl二聚体表面限定一个抗原結 合位点。这六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个 可变区(或Fv的一半仅含有三个抗原特异性CDR)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其比完整的结合位点具有较低的亲和力。
Fab段还包括轻链恒定区和重链的第一个恒定区(CHl)。Fab，与Fab的差 别在于Fab在重链CH1的羧基末端多出几个残基，其包括抗体铰链区的一 个或多个半胱氨酸。Fab，-SH在本文中是指恒定区半胱氨酸残基中至少有一 个游离巯基的Fab，。 F(ab，)2抗体片段在最初产生为Fab，片段对，在它们之间 具有铰链区半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联是众所周知的。
脊稚动物任何物种的抗体(免疫球蛋白)的"轻链"，可依据其恒定区氨 基酸序列而归为完全不同的两型(称为k和入)中的一型。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为不同类。主要有 5类免疫球蛋白IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM，其中一些还可进一步分成"亚 类"(同种型)，例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl和IgA2。对应于不同 类抗体的重链恒定区，分别称为oc、 5、 s、 y和4。不同类免疫球蛋白的 亚单位结构和三维构象是众所周知的。
术语"二价抗体"是指具有两个抗原结合位点的小分子抗体片段，这些 片段在一条多肽链(vh-VO上含有相连的一个重链可变区(vh)和一个轻链可 变区(VD。利用一种非常短的接头，其使得同一条链上的两个结构域无法配 对，不得不与另一条链上的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。 例如，在EP404， 097; W093/11161;和Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 90: 6444-6448(1993)中有对二价抗体的更详细描述。
"分离的"抗体是已从其天然环境的组成中鉴定、分离和/或回收的抗 体。其天然环境的污染成分是干扰抗体的诊断或治疗应用的物质，可包括酶、 激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。在优选的实施方案中，该抗体的纯度应 达到(l)经Lowery法确定的抗体重量的95%以上，最优选所述重量的99% 以上，(2)足以获得用旋转杯状(spinning cup)序列分析仪所测至少15个残基 的N端或内部氨基酸序列，(3)通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE以及 考马斯亮蓝染色、优选银染色所证实的同质性。分离的抗体包括重组细胞内 的原位抗体，因为该抗体的自然环境中的至少一种组分已不存在。然而，一 般情况下分离的抗体可通过至少一个纯化步骤来制备。
术语"可变"是指可变区某些部分的序列在抗体之间有很大差异，它们 可在各个抗体对其特定抗原的结合和特异性方面发挥作用。然而，该变异性 不是均匀的分布于整个抗体的可变区。它集中于轻链和重链可变区中三个称为"互补决定区，，(CDR)或超变区的节段中。可变区中保守性较高的区域称 为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各包括4个FR区，主要采取(3-片 层构象，由形成环状连接的三个CDR相连接，而在某些情况下可形成部分 P片层结构。每条链的CDR通过FR区紧密的靠近在一起，并且与其它链的 CDR—起形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，NIH Publ. No.91-3242,第 I巻，第647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是表 现出各种效应功能，例如参与抗体的抗体依赖性细胞毒性作用。
术语"超变区"在本文中是指抗体上负责结合抗原的氨基酸残基。所述 超变区通常包括"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(即轻链可变区的 残基24-34(Ll)、 50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区的残基31-35(H1)、 50-65(H2)和95-102(H3); Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))和/或那些"超变环"的氨基酸残基(即轻链可变区的残基 26-32(Ll)、 50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区的残基26-32(Hl)、 53-55(H2) 和96-101(H3); Chothia和Lesk， J. Mol. Biol. 196: 901-917(1987))。"框架区"
"人源化"型非人(例如鼠)抗体是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链 或其片段(如Fv、 Fab、 Fab，、 F(ab)，2或抗体的其它抗原结合亚序列)，它们包 含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗体是人免疫 球蛋白(受者抗体)，其中受者互补决定区(CDR)残基被具有所需特异性、亲 和力和性能的小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类等非人源物种抗体(供体抗体)
的CDR残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv FR残基由相应的 非人类残基所取代。而且，人源化抗体可包括在受者抗体或供体CDR或框 架序列中均不存在的残基。这些々务饰旨在进一步改善和最大化抗体的性能。 通常，人源化抗体基本上包括至少一个(通常包括两个)可变区的全部，其中 CDR区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而FR序列 的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗体还任选包括免疫球蛋 白恒定区(Fc),通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详见Jones等， Nature ， 321: 522-525 (1986); Riechmann等，Nature 332: 323-329 (1988); 和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)。任选地，人源化抗体也 包括PRIMATIZED 抗体，所述抗体的抗原结合区可从用目标抗原免疫接种猕猴制得的抗体中衍生获得。
本文中所用术语"免疫粘附素"定义为抗体样分子，其将异源蛋白(一 种"粘附素，，)的结合特异性与免疫球蛋白恒定区的效应器功能组合。结构 上，免疫粘附素包括具有所需结合特异性之氨基酸序列与免疫球蛋白恒定区 序列的融合，所述氨基酸序列不同于抗体的抗原识别和结合位点(即为"异 源性，，)。免疫粘附分子的粘附素部分通常是至少包括一个受体或一个配体 的结合位点的邻接氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序列，可
以得自任何免疫球蛋白，如IgG-l 、 IgG-2、 IgG-3或IgG-4亚型、IgA (包括 IgA-l和IgA-2)、 IgE、 IgD或IgM。
本文中"活性"是指保留完整或天然PRO10282的生物学和/或免疫学活 性的PRO10282形式，其中"生物学"活性指完整或天然PRO10282引起的生 物学功能(抑制或兴奋)，并且不包括诱导产生针对完整或天然PRO10282所 拥有的表位的抗体的能力；而"免疫学"活性则是指诱导产生针对完整或天然 PRO10282所携表位的抗体的能力。优选的生物活性包括例如下述任何一种 或多种活性应答视黄酸而在生长、发育或分化中的作用。基于与Stra6(— 种应答视黄酸而诱导的小鼠蛋白)的密切相似性，本文公开的PRO10282多 肽，可能在例如早期的背腹侧四肢结构模式和后期的软骨内成骨中起着重要 的作用。另 一生物学活性涉及在肿瘤发展和生长中的作用。
本文所用"免疫学活性"，优选是"免疫交叉-反应性，"是指候选多肽能 够与用已知活性PRO10282 (Stra6)多肽制备(raised)的多克隆抗血清竟争性抑 制具有此活性的PRO10282 (Stra6)多肽的定性生物学活性。以常规方式制备 此类抗血清，例如给山羊或兔子皮下注射在完全Freund's佐剂中的已知活性 类似物，接着经腹膜内或皮下注射在不完全Freund's佐剂中的已知活性类似 物以加强。免疫交叉反应性优选是"特异的"，这意味着所鉴定的免疫交叉-反应分子(例如抗体)与相应Stra6多肽的结合亲和力显著高于(优选高至少 约2-倍，更优选至少约4-倍，更加优选至少约8倍，最优选高至少约10-倍)其与任何其它已知天然多肽的结合亲和力。
本文中术语"拮抗剂"，使用其广义含义，包括部分或完全阻断、抑制或 中和本文所述天然PRO10282多肽生物活性的任何分子。类似地，术语"激 动剂"也使用其广义含义，包括模拟本文所述天然PRO10282多肽生物活性 的任何分子。适宜的激动剂或拮抗剂分子特别包括激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段、天然PR010282多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、小的有机分 子等。鉴定PRO10282多肽的激动剂或拮抗剂的方法可以是，使PR010282 多肽与待测激动剂或拮抗剂分子接触，并测定正常情况下与PRO10282多肽 有关的一个或多个生物活性的可测得变化。
本文中"肺瘤"是指所有赘生细胞生长和增殖(无论是恶性还是良性肿 瘤)，和所有癌前和癌性细胞及组织。
术语"癌"和"癌性的"指或描述哺乳动物中通常以无控细胞生长为特征的 生理状况。癌的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。 此类癌的更具体的实例包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、鳞状细胞癌、小 细胞肺癌、非-小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、成力交质细胞瘤、宫颈癌、卵 巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、 肾癌、肝癌、外阴癌、曱状腺癌、肝脏癌和各种类型头颈部癌。
"治疗"，既指治疗性治疗也指预防性措施，其目的是阻止或延缓(减轻) 所针对的病理性病症。那些需要治疗的个体包括，已经患有病症或有患病倾 向或者为了预防患上病症的个体。在肿瘤(例如癌)治疗中，治疗剂可直接减 少肿瘤细胞的病状，或使得肿瘤细胞对其它治疗剂的治疗(例如，放疗和/和 化疗)更为敏感。
癌的"病理学"包括危害患者健康的所有现象。包括但不限于异常或失 去控制的细胞生长、转移、干扰毗邻细胞的正常功能、异常水平释放细胞因 子或其它分泌产物、抑制或加重炎症或免疫应答等。
"慢性"给药，指与快速给药模式相反，将试剂以连续给药模式施用，以 便在长时间内保持初始治疗效果(活性)。"间断"给药是指治疗不是没有间歇 地连续进行，而是以周期性为特征。
意欲治疗的"哺乳动物"是指归为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和 农场动物，以及动物园里的动物、参与运动项目的动物或宠物如狗、猫、牛、 绵羊、猪、山羊、兔、马等。优选所述哺乳动物为人类。
与一种或多种其它治疗剂"联合"给药，包括同时(并行)和以任何顺序 联贯给药。
本文所用"载体"包括在所用剂量和浓度下对细胞或哺乳动物无毒性的 可药用载体、赋形剂、稳定剂。可药用载体常常是含水的pH緩冲的溶液。 可药用载体的实例包括緩沖剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于IO个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶 或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、 天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、 甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA;糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐离子如钠； 和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
本文中所用"标记"一词，是指直接或间4姿地与抗体偶联从而产生"标记" 抗体的可一全测的化合物或组分。标记可以是其本身可被测得(例如放射性同 位素标记或焚光标记)，或者如果是酶标记时，可催化底物化合物或组分发 生化学变化，这种变化是可检测的。
"固相"是指本发明抗体可粘附的非水性基质。本文中固相的实例包括 部分或全部由玻璃(如控制孔径的玻璃)、多糖(如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚 苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷制成的那些固相。在某些实例中，根据上下文的 内容，固相可包括测试板的孔；在其它的例子中，它可以是纯化柱(如亲和 层析柱)。该术语也包括美国专利4275149中公开的分散颗粒的不连续固相。 "脂质体"是由能向哺乳动物有效运送药物(如本文公开的PRO10282 多肽和/或其抗体)的各类脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小分子嚢泡。脂 质体的组分通常排列为双层形式，与生物膜的脂质排列相似。
本文中"小分子"定义为分子量低于约500道尔顿的分子。
短语"基因扩增"和"基因复制"可交替使用，它们是指使多拷贝基因或基 因片段在具体细胞或细胞系内形成的过程。重复的区域(扩增DNA的延伸) 一般常指"扩增子"。通常，信使RNA(mRNA)的产生量，即基因表达水平， 也与表达的具体基因所产生的拷贝数量成比例增加。
本文所用术语"细胞毒性剂"，是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞 破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如I131、 I125、 Y卯和Re186), 化疗剂，毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段。
"化疗剂"是治疗癌有效的化合物。化疗剂的实例包括阿霉素，阿霉 素(doxorubicin),表阿霉素(印irubicin), 5-氟尿嘧。定,胞嘧咬阿拉伯糖苦 (arabinoside)("Ara-C")，环磷酰胺，，塞替派，白消安，纟田月包毒素(cytoxin)，紫 杉烷例如紫杉醇(Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)和泰 索帝(doxetaxel)(泰索帝(Taxotere), Rhne Poulenc Rorer, Antony, Rnace)， toxotere，曱氨蝶呤，顺铂，苯丙氨酸氮芥，长春花碱，博莱霉素，依托泊苦，异环磷酰胺，丝裂霉素C，米托蒽醌，长春新碱，长春瑞宾，卡鉑，替尼泊
苷，道诺霉素，洋红霉素，氨基蝶呤，放线菌素D ,丝裂霉素，esperamicins (见美国专利4， 675， 187)， 5-FU， 6-硫代鸟嘌呤，6-巯基噤呤，放线菌素D, VP-16,苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥及其它有关的氮芥子。对肿瘤起调节或 抑制激素作用的激素制剂如他莫昔芬和奥那司酮也包括在此定义中。
本文所用"生长抑制剂"，是指抑制细胞生长的化合物或组合物，特别是 抑制过度表达本文鉴定的任一种基因的癌细胞，无论是在体内还是在体外。 因此，生长抑制剂是显著降低过度表达此基因的S期细胞百分比的化合物或 组合物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进程的试剂(在S期之外的环 节)，譬如，诱导G1期和M-期停滞的试剂。传统的M-期阻断剂包括长春花 碱(长春新碱和长春碱)、紫杉酚和拓朴酶II抑制剂如阿霉素、表阿霉素、柔 红霉素、依托泊苷和博莱霉素。那些使G1期停滞的试剂也使S-期停滞，例 如，DNA烷化剂如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴。秦、氮芥、顺铂、氨基蝶呤、 5-氟尿嘧啶和阿糖胞嘧啶-C。进一步的信息可在下列文献中找到The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn和Israel, eds.， Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogens, 和antineoplastic drugs" by Murakami等(WB Saunders: Philadelphia, 1995)，特别是第13页。
"阿霉素"是蒽环霉素类抗生素。阿霉素的化学全名为(88-顺式)-10-[(3-氨基-2, 3， 6-三去氧-a-L-来苏-p比喃糖苷)]-7， 8， 9, 10-四氬-6, 8, 11-三 羟-8-(羟乙酰)-曱氧基-5， 12-naphthacenedion。
术语"细胞因子"是一般性术语，指由一个细胞群释放的作用于另一个细 胞群起细胞间调节子作用的蛋白。这些细胞因子的实例是淋巴因子、单核因 子和传统的多肽类激素。细胞因子包括生长激素，如人生长激素，N-曱二磺 酰人生长激素和牛生长激素；曱状旁腺素；曱状腺素；胰岛素；前胰岛素； 松驰素；前松驰素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH),曱状腺刺激素(TSH)， 促黄体(生成)激素(LH);肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳激素； 胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-cx和(3 ;缪氏抑制物质(mullerian-inhibiting substance);小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮细胞生长因 子；整联蛋白；血小板生成素(TPO);神经生长因子如NGF-(3;血小板生长 因子；转化生长因子(TGF)如TGF-oc和TGF-l3;胰乌素样生长因子-I和-II; 促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子(osteoinductive factors);干扰素如干扰素-a, -|3, -y;集落刺激因子(csf)如巨噬细胞-csf(m-csf);粒细胞-巨噬 细胞-CSF(GM-CSF);粒细胞-CSF(G-CSF);白细胞介素(IL)如IL-1, IL-1 a ， IL-2, IL-3， IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9， IL-11, IL-12;肿瘤坏死 因子如TNF-a或TNF-(3 ;和其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。本文 中术语细胞因子包括天然蛋白或来自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列 细胞因子的生物活性等效物。
本申请所用术语"前体药物"，是指药物活性物质的前体或衍生物形式， 其相对于亲本药物对肿瘤细胞的细胞毒作用较小且可酶促活化或被转换成 更具活性的亲本形式。例见Wilman， "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14 : 375-382， 615th Meeting, Belfast (1986)， 和Stella等,"Prodrugs : A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery Borchardt等，(ed.)， pp. 147-267, Humana press( 1985)。 本发明的前体药物包括但不限于含有磷酸盐的前体药物，含有硫代磷酸盐 的前体药物，含有硫酸盐的前体药物，含有肽的前体药物，D-氨基酸修饰的 前体药物，糖基化的前体药物，含有P-内酰胺的前体药物，任选含有取代 的苯氧乙酰胺的前体药物或任选含有取代的苯基乙酰胺的前体药物，5-氟胞 嘧啶和可转化为更具细胞毒活性的游离药物的其它5-氟尿嘧咬前体药物。可 衍生为本发明所用前体药物形式的细胞毒药物，包括但不限于上述化疗药 物。
本文公开的多肽、其激动剂和/或拮抗剂对于抑制赘生细胞生长、肿瘤 生长或癌细胞生长的"有效量"，是指能够将靶细胞生长抑制到一定程度的 量。该术语包括可引发对靶细胞的生长抑制、细胞静息和/或细胞毒性作用和 /或编程性细胞死亡的量。
而PRO10282(包括PR019578)多肽或其拮抗剂，用于抑制赘生细月包生 长、肿瘤细胞或癌细胞生长目的时的"有效量"，可以完全根据经验和以常规 方式予以确定。
有关治疗肿瘤的"治疗有效量"，是指能够达到下列 一种或多种效果的 量(l)将肿瘤生长抑制到一定程度，包括减緩生长和完全阻止生长；(2)减 少肿瘤细胞数量；(3)缩小肿瘤尺寸；(4)抑制(即减少、减緩或完全阻止) 肿瘤细胞浸润周边器官；(5)抑制(即减少、减緩或完全阻止)转移；(6)提高 抗-肿瘤免疫应答，这可能但并非必须导致肿瘤消退或者排斥(rejection);和/或(7)与病症有关的一种或多种症状緩解到一定程度。用于治疗肿瘤为目的
的PRO10282多肽拮抗剂的"治疗有效量"，可根据经验和按常规方式予以确定。
PROl0282拮抗剂的"生长抑制量"，是能够抑制细胞尤其是肿瘤细胞(例 如癌细胞)在体内或体外生长的量。用于抑制赘生细胞生长目的的PRO10282 拮抗剂的"细胞毒性量"，可根据经验并以常规方式予以确定。
PRO10282拮抗剂的"细胞毒性量"，是能够引起体内或体外细胞尤其是 肿瘤细胞(例如癌细胞)破坏的量。用于抑制赘生细胞生长的PRO10282拮抗 剂的"细胞毒性量"，可根据经验和以常规方式予以确定。
"反义寡脱氧核苷酸"或"反义寡核苷酸"(术语之间可互用)，定义为可以 按照序列-特异性方式抑制靶基因进行转录和/或翻译的核酸分子。术语"反义 "是指核酸与靶基因的编码("正义")遗传序列互补的事实。反义寡核苷酸与新 生的mRNA通过Watson-Crick碱基配对而反向平行杂交。通过与靶mRNA 模板结合，反义寡核苦酸阻断mRNA模板所编码蛋白质的成功转录。术语 特别包括称为"核酶(ribozomes)"的反义因子，已经证明所述核酶通过加入具 有天然自-剪切活性的序列而诱导靶RNA催化裂解(Warzocha和Wotowiec， "Antisense strategy" biological utility and prospects in the treatment of hematological malignancies."Leuk. Lymphom 24 : 267-281 [1997])。
II.本发明组合物和方法
A.全长天然序列人PROl0282和PROl9578 (Stra6)多肽 本发明提供编码本申请分别称为天然序列人PRO10282 (或者也称为 UNQ3126)和PR019578多肽的新鉴定和分离的核苷酸序列。更具体而言， 如下面的实施例进一步详细公开的那样，已经鉴定和分离出编码天然人 PRO10282和PR019578多肽的cDNA。应注意到在不同表达循环中产生的 蛋白可能具有不同的PRO数，但是，任何特定DNA和其编码的蛋白的UNQ 数是独一无二的，而且将不会变化。然而，为了简明起见，在本说明书中将 DNA148380-2827编码的蛋白以及前述定义的PRO10282的所有其它天然同 系物和变体均称为"PR010282 ",而不i仑其来源或制备才莫式如何。而 "PRO10282"的天然变体-由DNA148389-2827-l编码的多肽，则特别称之为 "PR019578"。
如下面的实施例所开的那样，本文的DNA1483 80-2827和DNA148389-2827-1 cDNA克隆已经在ATCC保藏。该克隆的实际核苷酸序 列，可由本领域熟练技术人员使用本领域常规方法通过对保藏克隆进行序列 分析而很容易地测得。使用本领域常规技术可以预测该核苷酸序列编码的氨 基酸序列。关于本文所述天然人PRO10282和PR109578多肽以及本文所述 其编码核酸，申请人已经确定此时在阅读框上什么是与现有序列信息最一致 的。
使用上述ALIGN-2序列对比计算机程序，业已发现全长天然 PRO10282序歹'j(见图2和SEQ ID NO: 2)与Stra6(应答视黄酸中诱导的小鼠蛋 白(AF062476))具有一定的氨基酸序列同一性。因此，目前据信本申请公开 的PRO10282多肽是Stra6蛋白家族的新鉴定的成员，而且可能具有该蛋白 家族通常具有的一种或多种生物学和/或免疫学活性或者特性。目前，据信 PR019578是天然全长人PRO10282的其它剪切变体，它在天然人 PRO10282氨基酸序列的89-97位缺失9个氨基酸(SPVDFLAGD),并且在 518位处由lie (I))替代了 Met (M),所述518位与PRO10282的527位相对 应。这表明Stra6可以是多形态的。
B. PRO10282 (Stra6)变体
本文公开了两种具体天然序列人Stra6多肽(天然序列人PRO10282和 PR019578)。如上所述，据信PR019578是天然序列人PRO 10282的其它 剪切型天然变体，因而是一种"PR010282变体"。除了本文描述的全长天然 序列PRO10282和PRO19578多肽外，也考虑了制备PRO10282和PR019578 变体。通过在PRO10282或PRO19578 DNA中引入适当的核香酸改变，和/ 或通过合成所需PRO10282变体多肽，可以制备PR010282和PR019578变 体。本领域技术人员懂得，氨基酸变化将会改变PRO10282或PRO19578的 翻译后加工，例如改变糖基化位点的数量和位置或者改变膜锚着特性。
使用例如在美国专利5364934号中阐述的保守和非-保守突变的任一技 术和指导路线，可以在天然全长序列PRO10282、 PR019578或者在本文所 述PRO10282或PR019578的各种结构域中制造变化。变化可以是编码 PRO10282或PR019578的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，其导致 相对于天然序列PRO10282或PR019578的PRO10282或PR019578氨基酸 序列变化。任选地，变化是PRO10282或PR019578的一个或多个结构域中 的至少一个氨基酸被任何其它氨基酸取代。将PRO10282或PR019578序列与已知同源蛋白分子进行比较，并使高度同源区氨基酉1^列数量变化最小， 可以建立决定哪个氨基酸残基可以被插入、取代或缺失而对所需活性无负面 影响的指导原则。氨基酸取代可以是一个氨基酸被另一个具有类似结构和/ 或类似化学特性的氨基酸代替的结果，如丝氨酸置换亮氨酸，即保守氨基酸 置换。插入或缺失可任选地在约1-5个氨基酸的范围内。通过系统地在序 列中进行氨基酸插入、缺失或取代并检测所得变体显示全长或成熟天然序列 的活性的情况，可以确定能允许的变化。
本文提供PR010282多肽片段。该类片段可以是，例如，与全长天然蛋 白相比，在N-末端或C-末端截短的或者是缺乏内部残基的片段。某些片段 缺乏那些对于PRO10282或PR019578多肽的预期生物活性非必要的氨基酸残基。
PRO10282或PR019578片段可以按照大量常规技术中的任何一个来制 备。可以化学合成所需肽片段。另一方法涉及通过酶消化产生PRO10282或 PRO 19578片段，例如，用已知在特定氨基酸残基所限定的位点裂解蛋白的 酶处理蛋白，或用适宜的限制性内切酶消化DNA并分离所需片段。另一适 宜的技术包括分离并用聚合酶链反应(PCR)扩增编码所需多肽片段的DNA 片段。将限定DNA片段所需末端的寡核苷酸用作PCR的5'和3'端引物。优 选地，PRO10282或PR019578多肽片段具有图2 (SEQ ID NO: 2)所示天然 PRO10282或PR019578多肽的至少一种生物学和/或免疫学活性。
在特定实施方案中，目标保守取代冠以优选取代的名称示于下表1中。 如果这类取代导致生物活性变化，则可引入起更多实质性改变并筛选产物， 所述改变在表l中命名为示范性取代，或者如下文有关氨基酸种类的详述。
表1
原始残基示范性取代优选取代
Ala (A)val; leu; ileval
Arg (R)lys; gin; asnlysAsn (N)gin; his; lys; arggin
Asp (D)gluglu
Cys (C)S6rS6r
Gin (Q)asnasnGlu (E)aspasp
Gly (G)pro; alaala
His (H)asn; gin; lys; argarg
He (I)leu; val; met; ala; phe;
norleucineleu
Leu (L)norleucine; ile; val;
met; ala; pheile
Lys (K)arg; gin; asnarg
Met (M)leu; phe; ileleu
Phe (F)leu; val; ile; ala; tyrle
Pro (P)alaala
Ser(S)thrthr
Thr (T)serssr
Trp(W)tyr; phetyr
Tyr (Y)trp; phe; thr; serphe
Val (V)ile; leu; met; phe;
ala; norleucineleu
对PRO10282多肽的功能和免疫学特性的实质性修改可通过选择性取 代来完成，所述取代的效应在维持(a)取代区多肽骨架的结构，例如片层结构 或螺旋构象，(b)该分子耙位点的电荷或疏水性，(c)侧链的大小这几方面有显 著差异。天然残基根据共有的侧链特性可分为
(1) 疏水性正亮氨酸，met, ala, val, leu, ile;
(2) 中性亲水性cys， ser, thr;
(3) 酸性:asp, glu;
(4) 减性asn, gin, his, lys, arg;
(5) 影响链取向的残基gly， pro;和
(6) 芳香族trp， tyr， phe。
非保守取代将限定上述某一类的成员被另一类取代。也可将这种取代的 残基S1入到保守取代位点，或者更优选地引入其余(非-保守)位点。
可以使用本领域已知方法如寡核苷酸-介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和 PCR诱变技术来产生变异。可以对克隆的DNA进行定点诱变[Carter等，Nuc1.AcidsRes.， 13:4331 (1986); Zoller等，Nucl. Acids Res.， 10:6487(1987)]、 盒式诱变[WelIs等，Gene,34: 315 (1985)]、限制选择诱变[Wells等，Philos.Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)]或其它已知4支术以产生PRO10282变 体DNA。
扫描氨基酸分析也可沿邻接序列确定一个或多个氨基酸。优选的扫描氨 基酸是相对小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸，甘氨酸、丝氨酸和半 胱氨酸。通常，丙氨酸是此组中优选的扫描氨基酸，因为它的P-碳上无侧 链并且不太可能改变变体的主链构象[Cunningham和Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]。优选丙氨酸的另一原因是因为它是最常用氨基酸。而且， 它常常既出现在掩蔽位置也出现在暴露位置[Creighton， The Proteins, (W. H. Freeman & Co., R Y); Chothia, J. Mol, Biol., 150:1 (1976)]。如果丙氨酸 取代不能产生足够量的变体，则可使用同配氨基酸。
C. 天然PRO10282 (Stra6)和变体PRO10282 (Stra6)的修饰
本发明包括PRO1028和PRO10282变体(包括PR019578)的共价修饰。 一种共价修饰包括使PR010282多肽的靶氨基酸残基和能够与PRO10282的 选定侧链或N-或C-末端残基发生反应的有机衍生化剂进行反应。具有双官 能剂的衍生化是非常有用的，例如，PRO 10282与纯化抗-PRO 10282抗体方 法中所用的非水溶性载体基质或表面交联，反之亦然。通常使用的交联剂包 括例如，1， l-双(二偶氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊二醛，N-羟琥珀酰亚胺酯如与 4-叠氮基水杨酸的酯，高双官能亚胺基酯，包括二琥珀酰亚胺酯如3, 3'-连 二石克酸双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、双官能马来酰亚胺酯如双-N-马来酰亚胺 -1 ， 8-辛酯和化学试剂如曱基-3-[(对-叠氮苯基)二硫]丙炔亚胺酯。
其它》f饰包括谷氨酰胺和天冬酰残基分别成为相应的谷氨酰和门冬氨 酰残基的脱酰胺，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基磷 酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的a -氨基曱基化[T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)],胺的N-末端乙酰化，和^f壬何C-末端羧基的酰胺化。
本发明还包括PR010282多肽的另一类共价修饰，所述共i^介修饰包括改 变多肽的天然糖基化模式。天然序列PRO10282和PR019578多肽含有位于 其氨基酸序列8-12位的N-连接的糖基化位点。"改变天然糖基化模式"，在 这里的目的是为了删除天然序列PRO10282或PR019578中一个或多个碳水化合物部分(通过除去发生糖基化的位点或者通过化学和/或酶手段而删除糖
基化)，和/或在天然序列PRO10282或PR019578中加入一个或多个本不存 在的糖基化位点。此外，该短语包括天然蛋白糖基化的性质变化，包括不同 碳水化合物部分在性质和比例上的变化。
通过改变氨基酸序列可以实现在天然或变体PRO10282多肽中加入糖 基化位点。此变更可以例如，通过向天然序列PRO10282中加入、或者取代 一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(针对O-连接的糖基化位点)而完成。任选 地，可以通过DNA水平的变化，特别是通过使编码PRO10282多肽的DNA 中预先选定的碱基发生突变从而产生将会翻译成期望氨基酸的密码子，来改 变PRO 10282氨基酸序列。
在PRO10282多肽上增加碳水化合物部分数量的另一方法是，将糖苷与 多肽化学性或酶性地偶联。现有技术有此类方法的描述，例如1987年9月 11日公布的WO 87/05330，以及Aplin和Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. 第259-306页(1981)。
用化学或酶方法，或者通过突变性取代编码作为糖基化靶点的氨基酸残 基的密码子，来实现去除PR010282多肽中的碳水化合物部分。化学性去糖 基化技术为本领域所公知，并描述在例如下述文献中Hakimuddin等，Arch. Biochem. Biophys.， 259: 52 (1987)和Edge等，Anal. Biochem.， 118:131 (1981)。 使用Thotakura等在Meth. Enzvmol., 138: 350 (1987)中描述的各种内-和夕卜 糖普酶，可以完成多肽中碳水化合物部分的酶裂解。
PRO10282的另一类共价修饰，包括以美国专利4640835、 4496689、 4301144、 4670417、 4791192或4179337中所述方式,将PRO10282多肽与 各种非蛋白类聚合物之一连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙烯二醇或聚氧化 亚烷基。
本发明PRO10282多肽也可被修饰成嵌合分子，包括将PRO10282与另 一异源多肽或氨基酸序列融合。
在一实施方案中，嵌合分子含有PRO10282与标记多肽的融合体，其中 的标记多肽具有抗-标记抗体可选择性结合的表位。表位标记一般位于 PRO 10282的氨基-或羧基-末端。使用抗标记多肽的抗体，可以检测到此类 表位-标记型PRO10282的存在。另外，表位标记的^是供， -使得利用抗-标记 抗体或另一类与表位标记结合的亲和基质来亲和纯化PRO10282变得非常容易。各种标记多肽及其各自抗体是本领域众所周知的。实例包括聚-组氨酸
(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标记；flu HA标记多肽及其抗体 12CA5 [Field等，Mol. Cell. Biol.， 8: 2159-2165 (1988)]; c-myc标记和它的 8F9、 3C7、 6E10、 G4、 B7及9E10抗体[Evan等，Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)];和单纯疱渗病毒糖蛋白D (gD)标记及其抗体[Paborsky 等，Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]。其它标记多肽包括Flag-肽 [Hopp等，BioTechnology， 6: 1204-1210 (1988)]; KT3表位肽[Martin等， Science, 255: 192-194 (1992)]; cc-微管蛋白表位肽[Skinner等，J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)];和T7基因10蛋白肽标记[Lutz-Freyermuth等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397(1990)]。
在另一实施方案中，嵌合分子可包括PR010282与免疫球蛋白或免疫球 蛋白特定区域的融合。对于二价形式的嵌合分子(也指"免疫粘附素")，融合 可以是与IgG分子Fc区的融合。Ig融合优选包括PRO 10282多肽的可溶形 式(跨膜结构域缺失或失活)取代Ig分子内至少一个可变区。在一特别优选的 实施方案中，免疫球蛋白融合包括IgGl分子的铰链区、CH2和CH3区，或 铰链区、CH1、 CH2和CH3区。免疫球蛋白融合体的制备也参见1995年6 月27日发布的美国专利542,8130。
D.天然或变体PRO10282(Stra6)多肽的制备
下面的描述主要涉及通过培养转化或转染了含PRO10282核酸的载体 的细胞来制备天然序列PRO10282(Stra6)多肽和变体PRO10282(Stra6)多肽 (特别包括PR019578)。因此，当然考虑到本领域熟知的供选才奪方法可用于 制备PR010282。例如，通过利用固相合成技术的直接合成肽的方法来生产 PRO 10282序列或其一部分[参见例如，Stewart等，Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co.， San Francisco, CA(1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,, 85:2149-2154(1963)]。使用手工或自动4喿作技术，进行蛋白体 外合成。例如，按照制造商的指示，使用实用生物系统肽合成仪(FosterCity， CA)，可以完成自动合成。可以分别化学合成PRO10282的各部分，然后利 用化学或酶学方法制得全长PRO 10282。
1.编码PRO 10282 (Stra6) DNA的分离
可以从cDNA文库获得编码PRO10282的DNA，所述cDNA文库是从 据信具有PRO10282 mRNA并且以可测得水平表达PRO10282的组织制备的。相应地，如实施例中所描述的那样，从人组织制备的cDNA文库中可以 很方便地得到人的PRO10282DNA。也可以/人基因组文库或者通过已知合成 方法(例如自动核酸合成)获得PRO10282-编码基因。
使用为识别目标基因或其编码的蛋白而设计的:^笨针(如PRO10282抗体 或至少约20-80个碱基的寡核苷酸)，可以筛选文库。使用标准操作，如 Sambrook等在Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989出版)中所描述的方法，用选择的探针进行 cDNA或基因组文库的筛选。分离PRO10282编码基因的另一个可选用方法 是使用PCR方法[Sambrook等，出处同上；Dieffenbach等，PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, 1995年出版)]。
下述实施例描述cDNA文库筛选技术。选作探针的寡核苦酸序列应当具 有足够的长度并且足够清晰，以便使假阳性出现机率最小。寡核芬酸优选是 标记的，这样通过与正在筛选的文库中的DNA杂交而可被才企测到。标记方 法为本领域所公知，包括使用放射性标记物如3*-标记的ATP、生物素或酶 标记。包括中等严格和高度严格的杂交条件，见Sambrook等，出处同上。
可将在筛选文库方法中鉴定的序列与其它已知的保藏序列或公共数据 库如GenBank或其它私有序列数据库中的序列进行比较。使用本领域已知的 和本文描述的方法，可以测定分子中限定区域或全长序列的序列同 一性(无 论在氨基酸水平还是在核苷酸水平)。
使用本文首次公开的推定氨基酸序列，和如果必要，使用Sambrook等 (出处同上)描述的常规引物延伸程序，以4企测没有4皮逆转录为cDNA的 mRNA的前体和加工中间体，可以从选定的cDNA或基因组文库获得具有蛋 白编码序列的核酸。
2.宿主细胞的选4奪和转化
用生产本文所述PR010282的表达或克隆载体转染或转化宿主细胞，并 在常规营养培养基中培养宿主细胞，对所述培养基进行改良使之适宜于诱导 启动子、选择性转化体或扩增编码所需序列的基因。无需繁瑣的试验，本领 域熟练技术人员就可以选择培养条件如培养基、温度、pH等。通常，使细 胞培养物产量最大化的原则、方案和实用4支术见于Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler编著(IRL出片反，1991)和 Sambrook等，出处同上。转染真核细胞和转化原核细胞的方法为本领域熟练技术人员所已知，例
如，CaCl2、 CaP04、脂质体-介导的方法和电穿孔法。才艮据所用的宿主细胞， 使用适合于该宿主细胞的标准技术进行转化。如Sambrook等出处同上所述 的使用氯化钙的钙处理，或电穿孔法一般用于原核生物。如Shaw等在Gene， 23: 315(1983)和1989年6月29日公布的WO 89/05859中描述的那样，根癌 农杆菌的感染用于转化某些植物细胞。对于没有细胞壁的哺乳动物来说，可 以使用Graham和van der Eb在Virology, 52: 456-457(1978)中所述的磷酸钙 沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转化的总的情况在美国专利4399216中已有 描述。根据VanSolingen等，J. Bact,, 130: 946(1977)和Hsiao等，Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)， 76: 3829(1979)所述方法，通常可以完成向酵母的转化。然 而，也可使用将DNA引入细胞的其它方法，例如通过核的显微注射、电穿 孔、细菌原生质体与完整细胞的融合，或者聚阳离子如聚凝胺(polybrene)、 聚鸟氨酸。转化哺乳动物细胞的各种方法见Keown等，Methods in Enzymology， 185: 527-537(1990)和Mansour等，Nature, 336:348-352(1988)。 克隆或表达本文所述载体中DNA的适宜的宿主细胞，包括原核生物、 酵母或高等真核细胞。适宜的原核生物包括但不限于革兰氏阴性或革兰氏阳 性细菌等真细菌，譬如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如大肠杆菌。各种大肠杆 菌抹均是公众可以得到的，如大肠杆菌K12抹MM294(ATCC 31446);大肠 杆菌X1776(ATCC 31537);大肠杆菌抹W3110(ATCC 27325)和K5 772(ATCC 53635)。其它适宜的原核宿主细胞包括肠杆菌科如埃希氏杆菌属，例如，大 肠杆菌，肠杆菌属，欧文菌属，克雷白菌属，变形菌杆属，沙门菌属(如鼠 伤寒沙门菌)，沙雷菌属(如粘质沙雷菌)和志贺菌属等，以及芽孢杆菌属如枯 草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如1989年4月12日出版的DD 266710中所 述地衣芽孢杆菌41P)等，假单胞菌属的铜绿菌假单胞菌，及链霉菌。这些实 例是用于说明而并非限制于此。W3110抹是一个特别优选的宿主或母宿主， 因为它是重组DNA产物发酵的常用宿主抹。优选地，宿主细胞分泌少量蛋 白水解酶。例如，修饰W3110抹以使编码宿主内源性蛋白的基因发生遗传 突变，此类宿主的实例包括大肠杆菌W3110抹1 A2，该抹具有完整基因型 大肠杆菌W3110抹9E4,该抹具有完整基因型p&j;大肠杆菌 W3110抹27C7(ATCC 55244)，该抹具有完整基因型to"^ p r5 p/zo4 Ag尸owprAw/;大肠杆菌W3110才朱37D6,该林具有完整基因型to"^ p打3; /zo4 ￡75(^gF-/ac"69 t/eg尸om/ 7V&7 z vG 大肠杆菌 W3110抹40B4，它是37D6发生非-卡那霉素耐药degP缺失突变的抹；和具 有1990年8月7日发布的美国专利4946783中披露的突变型周质蛋白酶的 大肠杆菌抹。或者，克隆的体外方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应， 是适宜的。
除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适于使编码 PRO10282的载体克隆或表达的宿主。酿酒酵母是常用的低等真核宿主微生 物。其它真核微生物包括粟酒裂殖酵母OSc/n'zwacc/^raw少c&s / ow6e)(Beach 和Nurse， Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日公布的EP 139383);克 鲁维酵母属(^/wyverawyce"宿主(美国专利4943529 ; Fleer等， Bio/Technologv， 9: 968-975(1991)),例如乳酸克鲁维酵母(《./acto)(MW98-8C, CBS683， CBS4574; Louvencourt等，J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983])、 脆壁克鲁维酵母(K/ragz7z》(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母 (K6M/gaWcw5)(ATCC 16045)、威克曼氏克鲁维酵母(尺vWcferam//)(ATCC 24178)、 K.waltii(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(dmyo; Man/w)(ATCC 36906; VandenBerg等，Bio/Technology, 8:135(1990))、耐热克鲁维酵母(i:. Aewwto/erara)和克鲁维氏酵母属(K mw;a'a"w力等；yarrowia(EP 402226);巴 斯德毕赤酵母(pZc/7/afposton'"(EP 183070; Sreekrishna等，J. Basic Microbiol., 28: 265-278[1988]);念珠菌属；7Hc/zocferma ew'afEP 244234);粗糙链孢霉 (Case等,Proc. Natl. Acad. Sci, USA， 76: 5259-5263 [1979]);许旺氏酵母属 (sc/rM^3"m'omyces)^口西方i午旺氏酵母(scMva"m'cw^ces occ/(ie"to/^)(1990年10 月31日公布的EP 394538)等；和丝状真菌，例如链孢霉属、青霉属、 Tolypocladium(1991年1月10日公布的WO 91/00357)以及曲霉属宿主如构 巢曲霉(Ballance等，Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilb画等,Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])和黑曲霉等(Kelly和Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])。在本文中嗜曱基(Methylotropic)酵母是适宜的，包括但不限于选自 下述属的能够在曱醇中生长的酵母汉逊氏酵母属(Hansenula)，念珠菌属 (Candida),克勒克酵母属(Kloeckera),毕赤酵母属(Pichia),酵母属，球拟酵 母属和红酵母属。此类酵母的例证性特定酵母属的清单见C. Anthony, The Biochemistrv of Methylotrophs, 269(1982)。用于表达糖基化PRO10282的适合宿主细胞来自多细胞生物。无脊推动 物细胞的实例包括昆虫细胞(例如果蝇属S2和草地夜蛾Sf9)和植物细胞。有 用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和COS细胞。更具体 的实例包括SV40(COS-7， ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1细胞系；人胚 肾细胞系(293细胞或亚克隆培养成在悬浮培养液中生长的293细胞，Graham 等，J. Gen Virol. 36: 59(1977));中国仓鼠卵巢细胞Z-DHFR(CHO, Urlaub和 Chasin， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980));鼠赛尔托利细胞(TM4， Mather, Biol. Reprod., 23:243-251(1980》;人肺细胞(W138, ATCC COL 75); 人肝脏细胞(Hep G2, HB 8065);和鼠乳腺癌细胞(MMT 06O562， ATCC CCL51)。选择合适宿主细胞是本领域常识。
3.复制型载体的选择和应用
可将编码PRO10282的核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入复制型载体 中以进行克隆(DNA扩增)或表达。各种载体是公众可以获得的。载体可以是 例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。使用各种方法可将合适的核酸 序列插入载体。通常，利用本领域已知技术将DNA插入到合适的限制性核 酸内切酶位点。载体组成部分一般包括但不限于 一个或多个信号序列、复 制起点、 一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。使用 本领域熟练技术人员熟知的标准连接技术，构建包括这些组成部分中一个或 多个元件的适宜载体。
PRO10282不仅可直接重组制备，而且还可制备成与异源多肽的融合多 肽，所述异源多肽为信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特异性裂 解位点的其它多肽。通常，信号序列是载体的一个组分或者是被插入载体的
PRO10282-编码DNA的一部分。信号序列可以是选自例如碱性磷酸酶、青 霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导区的原核信号序列。对于酵母分泌，可 以是例如酵母转化酶前导区、a因子前导区(包括糖酵母属和克鲁维酵母属 的a因子前导区，后者在美国专利5010182中有述)，或酸性磷酸酶前导区、 白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前导区(1990年4月4日公布的EP 362179),或者 1990年11月15日公布的WO90/13646中所述信号序列。在哺乳动物细胞表 达时，可使用哺乳动物信号序列以直接分泌蛋白，如得自相同物种或相关物 种分泌型多肽的信号序列以及病毒分泌前导区。
表达载体和克隆载体均含有使载体在一个或多个选定宿主细胞中复制的核酸序列。在多种细菌、酵母和病毒中，这样的序列众所周知。来自质粒
pBR322的复制起点适宜于大多数革兰氏阴性细菌，2jn质粒复制起始点适于 酵母，各种病毒复制起始点(SV40,多瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)适宜 于哺乳动物细胞中的克隆载体。
表达载体和克隆载体通常包含筛选基因，也称为可筛选标记。典型的筛 选基因编码蛋白，该蛋白(a)提供对抗生素或其它毒素，如氨卡青霉素、新霉 素、氨基蝶呤或四环素等的抗性，(b)弥补营养缺陷，或(c)提供从复合培养基 中不能得到的关键营养物质，例如编码芽孢杆菌属D-丙氨酸消旋酶的基因。
适于哺乳动物细胞的筛选标记实例，是那些使能接纳编码PRO10282核 酸的细胞得到鉴定的标记，例如DHFR或胸苷激酶。当使用野生型DHFR 时，适当的宿主细胞是按照tfrlaub等在Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980)中描述的方法制备和扩增的DHFR活性缺陷型中国仓鼠卵巢
基因[Stinchcomb等，Nature, 282: 39(1979); Kingsman等,Gene, 7:141(1979); Tschemper等，Gene, 10:157(1980)]。 trpl基因为不能在色氨酸中生长的酵 母突变抹(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了筛选标记[Jones, Genetics, 85: 12(1977)]。
表达和克隆载体通常含有可#:作地连接于PRO10282-编码核酸序列的 启动子，以指导mRNA合成。被各种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周 知的。适用于原核宿主的启动子，包括l3-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang 等，Nature, 275:615(1978); Goeddel等，Nature, 281:544(1979)],碱性磷 酸酶，色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel, Nucleic acids Res., 8:4057(1980); EP 36776]，和杂合启动子如tac启动子[deBoer等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 80: 21-25(1983)]。适用于细菌系统的启动子，也含有可4喿作地连接于编码 PRO 10282的DNA的Shine-Dalgarno(S. D.)序列。
适用于酵母宿主的启动序列的实例，包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman 等，J. Biol. Chem., 255: 2073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess等，J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149(1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900(1978)]的启动子，所 述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧 酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油变位酶，丙酮酸激酶， 磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。其它的酵母启动子，即那些具有由生长条件控制转录的优点的诱导型启 动子，是下述基因的启动子区，即乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸
酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽 糖和半乳糖利用的酶。在EP 73657中进一步描述了用于酵母表达系统的适 当载体和启动子。
在哺乳动物宿主细胞中，由载体转录PROi0282可受下述启动子调控， 所述启动子来自病毒基因组如多瘤病毒、鸡痘病毒(1989年7月5日公布的 UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病 毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的启动子，或者来自异源 哺乳动物的启动子，如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子等，和来自热休 克启动子，前提是这些启动子与宿主细胞系统相容。
在载体中插入增强子序列，可以增加编码PR010282的DNA在高等真 核生物中的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，作用于启动子以增加所 述DNA的转录， 一般约10 300bp。目前已知很多哺乳动物基因(珠蛋白， 弹性蛋白酶、白蛋白、cx胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。然而，人们通常 使用真核细胞病毒的增强子。实例包括在其复制起始点晚期侧(late side)的 SV40增强子(bp 100-270),巨细胞病毒早期启动子增强子，在其复制起始点 晚期侧的多形瘤增强子，和腺病毒增强子。所述增强子可以剪接入PR010282 编码序列的5，或3'端，但优选位于启动子的5'端。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多 细胞生物的有核细胞)的表达载体，还包括对转录终止和mRNA结构稳定所 必须的序列。这些序列通常来自真核或病毒DNA或cDNA的5，(偶尔为3，) 非翻译区。这些区域包含转录为编码PRO10282的mRNA的非翻译区中聚 腺苦酸化片段的核普酸区段。
在重组脊推动物细胞培养中适应PRO10282合成的其它适宜方法、载体 和宿主细胞，见Gething等，Nature, 293:620-625(1981); Mantei等，Nature, 281:40-46(1979); EP 117060;和EP 117058中的描述。
4.检测基因扩增/表达
使用基于本文提供的序列的合适标记的探针，利用常规技术如Southern 印迹、测定mRNA 4争录量的Northern印迹[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 77:5201-5205(1980)]、点印迹(DNA分析)或原位杂交，可以直接在样品中测定基因扩增和/或表达。或者，使用能够识别特异双链体的抗体，所述
双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或者DNA-蛋白双链体。然后标记该抗体，进行试验，试验中，双链体结合于表面，使 得通过在该表面双链体的形成，来检测与该双链体结合的抗体的存在。
或者，为直接定量测定表达的基因产物，用免疫学方法测定基因表达， 所述方法如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液分析。适用 于免疫组化染色和/或样品液分析的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体， 并且可以在任何哺乳动物中制备。可以方便地制备抗天然序列PRO10282多 肽的抗体，或抗基于本文提供的DNA序列的合成肽的抗体，或者抗与 PRO10282 DNA融合并编码特异抗体表位的外源序列的抗体。
5.多肽的纯化
可从培养基或宿主细胞裂解物中回收PR010282。如果PR010282与膜 结合，那么使用适宜去垢剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶裂解使之自细胞 膜释放。使用各种物理或化学手段，如反复冻融、超声、机械破碎或细胞溶 解剂，使表达PRO10282所用的细胞破裂。
可以期望从重组细胞蛋白或多肽中纯化PRO 10282。下述程序是适宜纯 化步骤的实例在离子-交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC;在硅或 阳离子-交换树脂如DEAE上层析；聚焦层析；SDS-PAGE;硫酸铵沉淀；使 用例如交联葡聚糖(Sephadex)G-75进行凝胶过滤；过蛋白A琼脂糖柱以除去 污染物如IgG;和结合表位-标记形式PR010282的金属螯合剂柱。可以使用 蛋白纯化的各种方法，这些方法是本领域熟知的，并在例如Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990); Scopes, Protein Purification: Principes and Practice, Springer-Verlag, New York(1982)中作了描述。纯化步骤的选择， 取决于例如，所使用的生产方法和所产生的特定PR010282的性质。
E.编码PRO10282 (Stra6〗多肽的基因在肿瘤组织和细胞系中的扩增 一方面，本发明建立在对在某些癌细胞中扩增的基因的鉴定和描述上。 原核和真核生物的基因组表面上看来存在两个相矛盾的需求。 一方面是 作为遗传信息的DNA以其原始形式保存和扩增，以确保经过多代的稳定遗 传。另一方面，细胞或生物体必须能够适应持久的环境变化。适应机制可以 包括遗传物质在性质或数量上的修饰。性质上的修饰包括DNA突变，其中编码序列被改变从而产生结构和/或功能不同的蛋白质。基因扩增是数量上的 修饰，由此全编码序列即基因的实际数量增加，导致可利用的转录模板的数 量增加，可翻译的转录物的数量增加，并最终导致由扩增基因编码的蛋白质 的大量增加。
基因扩增的现象及其发生机制，已在数种原核和真核培养系统做过体外 研究。基因扩增最具特征的实例，涉及在含有不同浓度细胞毒药物曱氨蝶呤
(MTX)的介质中培养真核细胞。MTX是一种叶酸类似物，它通过阻断二氢 叶酸还原酶(DHFR)而干扰DNA合成。在最初暴露于低浓度MTX时，大多 数细胞(> 99. 9 %)会死亡。少量细胞存活，并且通过产生大量DHFR-RNA 和蛋白质而能够在MTX浓度升高的介质中生长。过度产生的基础是单一 DHFR基因的扩增。发现该基因增加的拷贝呈小的、超数染色体(双微体)形 式的非染色体拷贝或者呈集成染色体拷贝。
在发生对细胞毒性剂(细菌的抗体和真核细胞的化疗剂)抗性和致瘤性 转化时最常遇到基因扩增。作为自发事件或由于病毒或化学/环境攻击而致的 真核细胞的转化，通常与所述细胞中遗传物质发生变化有关。在人恶性肿瘤 中观察到的最常见变化之一是p53蛋白突变。p53控制细胞从停滞期(G1)向 复制期(S)转变并且在有DNA损害时阻止这种转变。换言之，p53突变体 丧失功能的主要后果之一是DNA损害即遗传变化的积聚和扩增。除点突变 外，肿瘤细胞中遗传变化的通常类型是扩增和严重的结构改变，如易位。
正如在DHFR实验系统所阐明的那样，DNA序列扩增可能表明特别的 功能需要。因此，恶性肿瘤中一定致癌基因的扩增表明这些基因在恶性变和 维持转变表型的过程中的成因性作用。该假说已经得到最近研究的支持。例 如，发现bcl-2蛋白在某些类型的非何杰金氏淋巴瘤中增多。该蛋白抑制细 胞凋亡并导致肿瘤细胞进行性积聚。
业已发现生长因子受体基因家族的成员在各种型癌中扩增，提示这些受 体的过度表达可能使得赘生细胞对于有限量可利用的生长因子更加不敏感。 实例包括在雄激素剥夺治疗期间复发性前列腺癌中雄激素受体扩增，和乳 腺癌中生长因子受体同系物ERB2扩增。最终，涉及细胞内信号和控制细 胞周期进展的基因在恶性变过程中可以发生扩增。这被bel-l和ras基因在 各种上皮和淋巴肿瘤中的扩增证实。
这些早期研究提示，在肿瘤中鉴定扩增的DNA序列的可行性，因为这种方法可以鉴定对于恶性变而言非常重要的基因。由于改变蛋白可能代表肿
瘤治疗的新而特异的靶，因此，ERB2的情况从治疗的角度也已经证明了这 种可行性。
数种不同的技术可用于证明扩增的基因组序列。对制备自癌细胞的染色
巴逸t 子勿？吓/^ " /&1士金疋尺,曰，2苦义，^口易 位、缺失和倒位。如果有大范围的高拷贝数量或者以染色体外物质存在的话， 则仅有扩增的基因组区域可以看得见。虽然细胞遗传学是证明具体染色体改 变与特定肿瘤具有一致关联性的首选技术，但是对于鉴定和分离可控制的
DNA序列来说是不充分的。最近开发的比较基因组杂交(CGH)技术已经证明 肿瘤中广泛存在的基因组扩增现象。肿瘤DNA和正常DNA在正常细胞分 裂中期同时杂交，通过对肺瘤中以增强的频率出现的DNA序列进行图形分 析，可以筛选整个基因组(WO 93118186; Gray等，Radiation Res.， 137: 275-289 [1994])。作为筛选方法，该类型分析法已经揭示了各种人肿瘤中大 量的复发(recurring)扩增子(一段扩增的DNA)。尽管CGH较经典的细胞遗 传学分析法在鉴定扩增的DNA段(stretches)方面更为敏感，但是使用标准分 子遗传学技术CGH不能够快速鉴定和分离扩增子内的编码序列。
检测基因扩增最敏感的方法是基于聚合酶链反应(PCR)的分析法。这些 分析法精巧灵敏，使用极小量的肿瘤DNA作为起始物料，提供用于后续分 析(如序列分析)所需的DNA,并且该方法适于进行高容量通过量的分析。
上面提到的分析法并不相互排斥，而是经常被联合应用以鉴定肿瘤中的 扩增。尽管细胞遗传学分析和CGH代表检查整个基因组扩增区域的筛选方 法，但是基于PCR的分析法最适于编码序列即扩增区域的基因的最终鉴定。
根据本发明，使用定量PCR方法，通过将来源于各种原发肿瘤或肿瘤 细胞系的RNA与来源于健康供体的库存(pooled) DNA进行比较，已经鉴定 了这些基因(S. Gelmini等，Clin. Chem. 43 : 752 [1997])，所述胂瘤包括乳腺 癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、脑瘤、肝癌、肾癌、胰腺癌、脾脏肿瘤、曱 状腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌等。使用TaqMan仪(ABI)完成定量PCR 操作。根据DNA的编码序列设计基因-特异性引物和荧光探针。
人肺癌细胞系，包括A549 (SRCC768), Calu-l (SRCC769), Calu-6 (SRCC770)， H157 (SRCC771), H441 (SRCC772)， H460 (SRCC773), SKMES-1 (SRCC774), SW900 (SRCC775)， H522 (SRCC832)和H810 (SRCC833),所有这些均可从ATCC获得。原发性人肺肿瘤细胞通常衍生自腺癌，鳞状细胞
癌，大细胞癌，非小细胞癌，小细胞癌和支气管肺泡癌，并且包括例如
SRCC724 (腺癌，简写为"AdenoCa")(LTl), SRCC725 (鳞状细胞癌，简写为 "SqCCa) (LTla), SRCC726 (腺癌)(LT2)， SRCC727 (腺癌)(LT3), SRCC728 (腺 癌)(LT4), SRCC729 (鳞状细胞癌)(LT6)， SRCC730 (腺癌/鳞状细胞癌)(LT7), SRCC731 (腺癌)(LT9)， SRCC732 (鳞状细胞癌)(LTIO)， SRCC733 (鳞状细胞 癌)(LTll)， SRCC734 (腺癌)(LT12), SRCC735 (腺鳞状细胞癌)(LT13)， SRCC736 (鳞状细胞癌)(LT15)， SRCC737 (鳞状细胞癌)(LT16)， SRCC738 (鳞 状细胞癌)(LT17), SRCC739 (鳞状细胞癌)(LT18)， SRCC740 (鳞状细胞癌) (LT19)， SRCC741 (肺细胞癌，简写为"LCCa") (LT21)， SRCC811 (腺癌) (LT22), SRCC825 (腺癌)(LT8)， SRCC886 (腺癌)(LT25)， SRCC887 (鳞状细 胞癌)(LT26)， SRCC888 (adeno-BAC癌)(LT27), SRCC889 (鳞状细胞癌) (LT28), SRCC890 (鳞状细胞癌)(LT29)， SRCC891 (腺癌)(LT30), SRCC892 (鳞状细胞癌)(LT31)， SRCC894 (腺癌)(LT33)。也包括指定为SRCC1125 [HF-000631], SRCC1127 [HF-000641]， SRCC1129 [HF-000643]， SRCC1133 [HF-000840], SRCC1135 [HF-000842], SRCC1227 [HF-001291]， SRCC1229 [HF掘293], SRCC1230 [HF-001294], SRCC1231 [HF001295]， SRCC1232 [HF-001296] , SRCC1233 [HF-001297] , SRCC1235 [HF-001299] , and SRCC1236 [HF-001300]的人肺胂瘤。
结肠癌细胞系，包括例如ATCC细胞系SW480 (腺癌，SRCC776), SW620(结肠腺癌的淋巴结转移，SRCC777)， Colo320 (癌，SRCC778)， HT29 (腺癌，SRCC779)， HM7 (结肠腺癌细胞系ATCC的高粘蛋白产生的变体， SRCC780，得自Dr. Robert Warren, UCSF)， CaWiDr (腺癌，SRCC781)， HCT116 (癌，SRCC782)， SKC01 (腺癌，SRCC783)， SW403 (腺癌，SRCC784), LS174T(癌，SRCC785), Colo205 (癌，SRCC828)， HCT15(癌，SRCC829), HCC2998(癌，SRCC830),和KM12(癌，SRCC831)。原发性结肠肿瘤包括 指定为CT2 (SRCC742), CT3 (SRCC743), CT8 (SRCC744)， CT10 (SRCC745)， CT12 (SRCC746), CT14 (SRCC747)， CT15 (SRCC748), CT16 (SRCC749), CT17 (SRCC750), CT1 (SRCC751)， CT4 (SRCC752), CT5 (SRCC753), CT6 (SRCC754)， CT7 (SRCC755), CT9 (SRCC756)， CT11 (SRCC757)， CT18 (SRCC758)， CT19(腺癌，SRCC906), CT20 (腺癌，SRCC907), CT21(腺癌，SRCC908), CT22(腺癌，SRCC909)， CT23(腺癌，SRCC910)， CT24 (腺癌， SRCC911), CT25(腺癌，SRCC912)， CT26 (腺癌，SRCC913), CT27 (腺癌， SRCC914), CT28(腺癌,SRCC915), CT29(腺癌,SRCC916), CT30(腺癌， SRCC917), CT31(腺癌,SRCC918)， CT32(腺癌，SRCC919), CT33(腺癌, SRCC920), CT35(腺癌，SRCC921)， andCT36(腺癌，SRCC922)的结肠腺 癌。还包括指定为SRCC1051 [HF-000499], SRCC1052 [HF-000539], SRCC1053 [HF-000575], SRCC1054 [HF-000698], SRCC1142 [HF-000762]， SRCC1144 [HF-000789], SRCC1146 [HF-000795]和SRCC1148 [HF-000811] 的人结肠肿瘤。
人乳腺癌细胞系，包括例如HBL100(SRCC759), MB435s (SRCC760)， T47D (SRCC761)， 認468 (SRCC762) ， MB175 (SRCC763) ， MB361 (SRCC764), BT20(SRCC765)， MCF7 (SRCC766)和SKBR3 (SRCC767)，以 及指定为SRCC1057 [HF-000545]的人乳腺肿瘤中心。也包括指定为 SRCC1094, SRCC1095, SRCC1096, SRCC1097, SRCC1098， SRCC1099, SRCCllOO， SRCC1101的人乳腺肿瘤，和指定为SRCC893 [LT32]的人乳腺 -转移-肺-NS肿瘤。
人肾肿瘤中心包括SRCC989 [HF-000611]和SRCC1014 [HF-000613]。
人睾丸肿瘤中心包括SRCC1001 [HF-000733]和睾丸肿瘤边缘(margin) SRCC999 [HF-000716]。
人曱状旁腺胂瘤包括 SRCC1002 [HF-000831]和SRCC1003 [HF-000832]。
F.组织分布
本文基因扩增分析的结果，可通过进一步的研究如通过测定各种人组织 中mRNA表达来加以证实。
如前面指出的那样，使用基于本文提供的序列的合适标记的探针，利用 常规技术如Southern印迹、测定mRNA转录量的Northern印迹[Thomas， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205(1980)]、点印迹(DNA分析)或原位杂交， 可以直接在样品中测定基因扩增和/或表达。或者，使用能够识别特异双链体 的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂化双链 体或者DNA-蛋白双链体。
或者，为直接定量测定表达的基因产物，用免疫学方法测定基因在各种组织的表达，所述免疫方法如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物 或体液分析。适用于免疫组化染色和/或样品液分析的抗体，可以是单克隆抗 体或多克隆抗体，并且可以在任何哺乳动物中制备抗体。可以方便地制备抗
天然序列PRO10282(Stra6)多肽的抗体，或抗基于本文提供的DNA序列和编 码特异抗体表位的合成肽的抗体。下文提供生产抗体所用的一般技术和
Northern印迹与原位杂交所用的特f未方案。 G染色体图谱
如果一指定基因的扩增是功能相关性的，那么该基因应当较对于肿瘤存 活不重要的邻近基因组区域被更多地扩增。为证实这种观点，可通过例如放 射-杂交分析法对特定染色体进行基因作图。然后在所确定的位置和在邻近 基因组区域测定扩增水平。对选择性或优先性扩增的基因组区域的基因图语 表明，基因组区域选择性或优先性扩增与观察到的基因扩增促进肿瘤生长或 存活的可能性是一致的。染色体图谱既包括框架绘图也包括中心绘图。更进 一步的细节请参见例如，Stewart等，Genome Research, 7:422-433 (1997)。 H.抗体结合的研究
基因扩增研究的结果，可通过抗体结合研究而得到进一步证实。在该抗 体结合研究试验中，检测抗-PR010282 (抗-STRA6)抗体抑制肿瘤(癌)细胞上 STRA6多肽表达的能力。例证性抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源 化抗体、双特异性抗体和异源偶联抗体，它们的制备将在下面予以描述。
可使用本领域已知的方法进行抗体结合研究，所述方法如竟争性结合试 验、直接和间接夹心试验，及免疫沉淀试验。Zola,单克隆抗体技术指南， 147-158页(CRC Press, Inc. 1987)。
竟争性结合试验依赖于标记的标准品在同限定量抗体结合中与测试样 品分析物竟争的能力。测试样品中靶蛋白(由肿瘤细胞中扩增的基因编码)的 量与同抗体结合的标准品的量成反比。为便于测定结合形式的标准品的量，
优选抗体在竟争之前或之后是不溶性的，这样可以很方便地把与抗体结合的 标准品和测试样品从保持未结合状态的标准品和测试样品中区分开来。
夹心试验涉及使用被检测蛋白质的两种抗体，每一种抗体能够结合待测 蛋白不同的免疫原性部分或表位。在一夹心试验中，首先使测试样品分析物 与固定在固体载体上的第一抗体结合，然后再使第二抗体与分析物结合，从 而形成不溶性的三组分复合物。参见例如美国专利4376110。第二抗体本身可标记有可检测部分(直接夹心试验)，或者通过使用标记有可检测部分的抗-免疫球蛋白抗体来测定第二抗体(间接夹心试验)。例如， 一种类型的夹心试
验是ELISA分析法，其中可检测部分是酶。
对于免疫组织化学而言，组织样品可以是新鲜的或冷冻的，或者是包埋 在石蜡中并用防腐剂如福尔马林固定。 I. 基于细胞的肿瘤分析
肿瘤(例如癌)的基于细胞的分析和动物模型，可用于证实基因扩增分析 的发现，并进一步了解本文鉴定的基因与肿瘤细胞生长的进展、发病机理之 间的关系。使用已经确定扩增本文所述基因的原发性肿瘤细胞或细胞系，可 以检测本文鉴定的基因产物在肿瘤或癌发病和病理学中的作用。此类细胞包 括例如乳腺、结肠和肺的癌细胞以及上文列举过的细胞系。
在不同的研究中，用本文描述的cDNA转染已知参与特定肿瘤的细胞类 型的细胞，并分析这些cDNA诱导过度生长的能力。适宜的细胞，包括例如 稳定的肿瘤细胞系如B104-1-1细胞系(neu原癌基因转染的稳定的NIH-3T3 细胞系)和ms-转染的NIH-3T3细胞，可用所需的基因转染所述细胞系，并 监测肿瘤发生的发展(tumorogenic growth)。然后，可将此转染的细胞系用于 检测多克隆或单克隆抗体或抗体组合物通过对转化细胞生长发挥细胞抑制 或细胞毒活性，或者通过介导抗体-依赖性细胞毒作用(ADCC)从而抑制肿瘤 发生细胞生长的能力。用本文鉴定的基因编码序列转染的细胞，还可用于确 定治疗肿瘤的候选药物。
此外，尽管优选稳定的细胞系，但是得自转基因动物(见下述)的原代培 养物，可用于本文基于细胞的分析中。从转基因动物获取连续细胞系的技术 为本领域所熟知(参见例如Small等，Mol. Cell. Biol. 5， 642-648 [1985])。
J.动物模型
各种众所周知的动物模型，可用于进一步了解本文鉴定的基因在肿瘤发 展和发病机理中的作用，并可用于检测候选治疗剂的有效性，所述候选治疗 剂包括抗体和天然多肽的其它拮抗剂，后者包括小分子拮抗剂。此类模型的 在体(in vivo)特性，使得它们可以具体预见在人类患者的反应。胂瘤和癌(如 乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等)的动物模型包括非-重组动物和重组(转 基因)动物。非重组动物模型包括例如啮齿动物如小鼠模型，此类模型可通 过利用标准技术将肿瘤细胞引入同系基因鼠体内而制得，譬如，把结肠癌细胞植入结肠组织中，所述标准技术如皮下注射、尾静脉注射、脾埋入法、腹
膜内植入、肾嚢植入法或orthopin植入。(参见例如，1997年9月18日公布 的
发明者威廉·I·伍德, 维多利亚·史密斯, 黛安娜·彭尼卡 申请人:杰南技术公司