专利名称：一种β-葡萄糖苷酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵和酶工程技术领域，尤其涉及一种e -葡萄糖苷酶的制备
方法。
背景技术：
大豆是畜禽的主要蛋白饲料，在饲料成分中占有很大比例，大豆中含有丰富的大 豆异黄酮。最初人们对大豆异黄酮的研究是针对人体的，研究发现在人体大豆异黄酮对防 治癌症、预防心血管疾病、防治女性老年骨质疏松等都具有明显的疗效。近年来大豆异黄酮 的研究开始在动物上开展，大量的动物试验表明，大豆异黄酮具有促进动物生长、增强机体 免疫力、提高动物泌乳性能、增加产蛋量、提高繁殖机能、促进动物体内养分再分配、提高蛋 白质合成效率和改善畜禽胴体及瘦肉率等多种营养生理功能。但大豆异黄酮主要以糖苷形 式存在，占总量的97% _98%，结合型大豆异黄酮不能渗入肠上皮细胞。必须经微生物水解 为苷元，才能被吸收并进入外周循环，这样大部分大豆异黄酮资源并不能很好的被动物体 利用，造成了资源的浪费。 研究发现，|3 _葡萄糖苷酶可将结合型的大豆异黄酮转化为具有生理活性的游离 型苷元，从而有效的提高大豆异黄酮的生物利用率。该酶最初是在苦杏仁中被发现，随后在 酵母、细菌、真菌等微生物中也纯化出了 P-葡萄糖苷酶。但不同来源的P-葡萄糖苷酶具 有明显的种属特异性，不同的菌株不同的培养条件会影响P-葡萄糖苷酶的发酵水平，同 时目前的对P-葡萄糖苷酶的生产多采用深层发酵法，固态发酵由于产P-葡萄糖苷酶产 量低其应用一直受到限制，但固态发酵比深层发酵具有经济优势，它可以利用丰富、廉价的 农副产品作为发酵底物，发酵粗产物可直接作为酶源。本发明从菌种的筛选出发到固体培 养基和培养条件的优化，以使在固体培养条件下也能实现P-葡萄糖苷酶的高产，为P-葡 萄糖苷酶的产业化发展提供理论依据。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种13 -葡萄糖苷酶的制备方法， 该方法成本低、产酶量高、可大规模推广利用。 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种P-葡萄糖苷酶的制备方法， 包括以下步骤 (1)制备培养基包括 (A)制备斜面种子培养基将皮马铃薯、蔗糖和琼脂加入水中，经12rC灭菌 20min，得到斜面种子培养基，其中，皮马铃薯含量为200g/l，蔗糖含量为20g/l，琼脂含量 为20g/l ; (B)制备固体种子培养基按照重量l : 1比例将麸皮加入水中，搅拌均匀，经 12rC灭菌30min，得到固体种子培养基； (c)制备固体生产培养基按重量百分比90 100% : o 10% : i 3%的比例将麸皮、米糠和氯化氨混合，经12rC灭菌30min，得到固体生产培养基； (2)制备斜面种子将黑曲霉菌株划线接种在斜面种子培养基上，于2『C恒温培
养5d后，得斜面种子； (3)制备种子将步骤(2)得到的斜面种子种在固体种子培养基中，于28t:下恒温 培养72h，得到种子； (4)发酵生产将步骤(3)所获得的种子以106 108cfu/g固体培养基的接种量， 接种到固体生产培养基上，在固体培养基中添加质量百分比为其0. 5X的MgS(^ 7H20和质 量百分比为其1. 5%的KH2P04，调节培养基的起始含水量65 75%，PH5. 5 6. 5，于25 30。C培养48 80h，得P-葡萄糖苷酶。 本发明的有益效果是本发明筛选出P-葡萄糖苷酶的高产菌种，利用丰富、廉价 的农副产品作为发酵底物，产品成本低，质量好，优化后得到的酶活性很高，作为饲料添加 剂应用于豆粕型日粮中，可显著的提高其吸收利用率，从而提高动物饲养的经济效益。
具体实施例方式
本发明的P-葡萄糖苷酶的制备方法，包括以下步骤
—、制备培养基包括， 1、制备斜面种子培养基将皮马铃薯、蔗糖和琼脂加入水中，经12rC灭菌20min， 得到斜面种子培养基，其中，皮马铃薯含量为200g/l，蔗糖含量为20g/l，琼脂含量为20g/ 1 ; 2、制备固体种子培养基按照重量1 : 1比例将麸皮加入水中，搅拌均匀，经 12rC灭菌30min，得到固体种子培养基； 3、制备固体生产培养基按重量百分比90 100% : 0 10% : l 3%的比例 将麸皮、米糠和氯化氨混合，经12rC灭菌30min，得到固体生产培养基。
二、制备斜面种子将黑曲霉菌株划线接种在步骤1的斜面种子培养基上，于28t: 恒温培养5d后，得斜面种子，放置4t:冰箱内保存，备用； 三、制备种子将步骤2制备的斜面种子种在步骤1的固体种子培养基中，于28°C 下恒温培养72h，得到种子； 四、发酵生产将步骤3所获得的种子以106 108cfu/g固体培养基的接种 量，接种到步骤l的固体生产培养基上，在固体培养基中添加质量百分比为其0.5%的 MgS04 7H20和质量百分比为其1. 5 %的KH2P04，调节培养基的起始含水量65 75 % ， 5 6. 5，于25 30。C培养48 80h，得P -葡萄糖苷酶，检测活力达到300 430U/g。 其中，酶单位U定义在lmin内催化生产1 y mol/L对硝基本分的酶量为1个酶单 位。 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，本发明的目的和效果将变得更加明 显。 实施例1 (1)培养基的制备包括， ①斜面种子培养基去皮马铃薯200g/l，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，经121 。C灭菌20min ; ②固体种子培养基250ml的三角瓶中加入麸皮10g，按与麸皮重量1 : 1比例加 入自来水，搅拌均匀，经12rC灭菌30min ; ③固体生产培养基250ml三角烧瓶中装入麸皮、米糠和氯化氨按重量百分比 90%: 9%: 1%的比例配制而成的固体培养基10g，经12rC灭菌30min ;
(2)斜面种子制备将黑曲霉菌株划线接种在步骤(1)①斜面种子培养基上，于 28 °C恒温培养5d后，放置4°C冰箱内保存，备用； (3)种子制备将步骤(2)斜面种子在步骤(1)②固体种子培养基中，于2『C下恒 温培养72h ; (4)发酵生产将步骤(3)所获得的种子以106cfU/g固体培养基的接种量，接种
到步骤(1)③固体生产培养基上，在固体培养基中添加0. 5% MgS04 *71120和1. 5% KH2P04，
调节培养基的起始含水量65%，PH5. 5，于25t:培养56h，得P -葡萄糖苷酶，检测活力达到
300 430U/g。 实施例2 (1)培养基的制备包括， ①斜面种子培养基去皮马铃薯200g/l，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，经121 。C灭菌 20min ; ②固体种子培养基250ml的三角瓶中加入麸皮10g，按与麸皮重量1 : 1比例加 入自来水，搅拌均匀，经12rC灭菌30min ; ③固体生产培养基250ml三角烧瓶中装入麸皮、米糠和氯化氨，按重量百分比 95% : 4% : 1%的比例配制而成的固体培养基10g，经121。C灭菌30min ;
(2)斜面种子制备将黑曲霉菌株划线接种在步骤(1)①斜面种子培养基上，于 28 °C恒温培养5d后，放置4°C冰箱内保存，备用； (3)种子制备将步骤(2)斜面种子在步骤(1)②固体种子培养基中，于2『C下恒 温培养72h ; (4)发酵生产将步骤(3)所获得的种子以1(fcfu/g固体培养基的接种量，接种到
步骤(1)③固体生产培养基上，在固体培养基中添加0. 5% MgS04 7H20和1. 5% 1(112 04，调
节培养基的起始含水量70%， PH56.0，于28t:培养72h，得P _葡萄糖苷酶，检测活力达到
300 430U/g。 实施例3 (1)培养基的制备包括， ①斜面种子培养基去皮马铃薯200g/l，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，经121 。C灭菌 20min ; ②固体种子培养基250ml的三角瓶中加入麸皮10g，按与麸皮重量1 : 1比例加 入自来水，搅拌均匀，经12rC灭菌30min ; ③固体生产培养基250ml三角烧瓶中装入麸皮和氯化氨按，重量百分比 98% : 2%的比例配制而成的固体培养基10g，经12rC灭菌30min ; (2)斜面种子制备将黑曲霉菌株划线接种在步骤(1)①斜面种子培养基上，于 28 °C恒温培养5d后，放置4°C冰箱内保存，备用；
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(3)种子制备将步骤(2)斜面种子在步骤(1)②固体种子培养基中，于2『C下恒 温培养72h ; (4)发酵生产将步骤(3)所获得的种子以108cfu/g固体培养基的接种量，接种 到步骤(1)③固体生产培养基上，在固体培养基中添加0. 5% MgS04 *71120和1. 5% KH2P04， 调节培养基的起始含水量75%，PH6. 5，于3(TC培养80h，得P -葡萄糖苷酶，检测活力达到 300 430U/g。 上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和 权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
权利要求
一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)制备培养基包括(A)制备斜面种子培养基将皮马铃薯、蔗糖和琼脂加入水中，经121℃灭菌20min，得到斜面种子培养基，其中，皮马铃薯含量为200g/l，蔗糖含量为20g/l，琼脂含量为20g/l。(B)制备固体种子培养基按照重量1∶1比例将麸皮加入水中，搅拌均匀，经121℃灭菌30min，得到固体种子培养基。(C)制备固体生产培养基按重量百分比90～100％∶0～10％∶1～3％的比例将麸皮、米糠和氯化氨混合，经121℃灭菌30min，得到固体生产培养基。(2)制备斜面种子将黑曲霉菌株划线接种在斜面种子培养基上，于28℃恒温培养5d后，得斜面种子。(3)制备种子将步骤(2)得到的斜面种子种在固体种子培养基中，于28℃下恒温培养72h，得到种子。(4)发酵生产将步骤(3)所获得的种子以106～108cfu/g固体培养基的接种量，接种到固体生产培养基上，在固体培养基中添加质量百分比为其0.5％的MgSO4·7H2O和质量百分比为其1.5％的KH2PO4，调节培养基的起始含水量65～75％，PH5.5～6.5，于25～30℃培养48～80h，得β-葡萄糖苷酶。
全文摘要
本发明公开了一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，本发明通过筛选，选择黑曲霉为出发菌株，以106～108cfu/g的接种量接种于麸皮、米糠和氯化氨，按重量百分比90～100％∶0～10％∶1～3％的比例配制而成的固体培养基中，培养基的起始含水量为65～75％，pH5.5～6.5，于25～30℃培养48～80h，检测β-葡萄糖苷酶的活性可达到300～430U/g；本发明采用固态发酵，利用廉价和丰富的农副产品为发酵底物，同时对培养基和培养条件进行优化，使β-葡萄糖苷酶在固体发酵条件下也达到很高的产量，为其产业化发展提供科学依据。
文档编号C12N9/42GK101705213SQ20091015380
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月16日 优先权日2009年11月16日
发明者孙建义, 钱利纯 申请人:浙江大学