专利名称：一种农杆菌介导的转化甜瓜蔓枯病菌的方法
技术领域：
本发明属于微生物转基因领域，特别的，属于根癌农杆菌介导的甜瓜蔓枯病菌转 化技术。
背景技术：
甜瓜是我国重要的经济作物，而瓜类蔓枯病是当前危害瓜类生产的最主要病害， 严重影响瓜果的产量和品质。蔓枯病菌病原学研究还非常落后。瓜类蔓枯病是由亚隔孢壳 属(Didymella spp.)(近年来的公认名称)引起，是一种严重的全球性真菌病害，侵染黄 瓜、西瓜、甜瓜、南瓜和西葫芦等，对寄主植物造成不同程度的影响。国内外已经开展了一些 甜瓜蔓枯病菌的研究，主要集中在培养、产孢以及应用分子标记技术简单分类等，关于该菌 的功能基因的研究未见任何报道。而建立一种简单、快速、高效的甜瓜蔓枯病菌转化体系是 研究该菌功能基因以及甜瓜蔓枯病菌互作的必需的工具。根癌农杆菌转化真菌转化效率比较高，在报道中，有的106个孢子能产生300-500 个转化子，有的105个孢子能产生53个转化子、而有的则为104个孢子能产生156个转 化子。。T-DNA单拷贝插入的几率比较高，而且T-DNA插入位置的旁侧序列很容易通过 TAIL-PCR扩增得到，根癌农杆菌转化产生的真菌转化子很容易发生表型以及致病性的突 变，而且表型与T-DNA共分离的几率比较高，已经在多种真菌上使用，被证明是一种非常有 用的研究真菌基因功能以及病菌与寄主互作的工具。而现有技术中没有建立起甜瓜蔓枯病 菌转化体系，这就需要特别针对甜瓜蔓枯病菌进行转化体系的建立。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供一种根癌农杆菌介导的转化甜瓜蔓枯病菌的方 法，包括(1)将甜瓜蔓枯病菌接种在PDA培养基上，并在40W紫外灯(12h紫外灯/12h黑 暗)下处理4-6天诱导产孢，用灭菌水洗下孢子，采用血球计数板测定，配成5X 106个/mL 孢子悬浮液；(2)用活化的根癌农杆菌的菌液100 PL与等体积的蔓枯病菌分生孢子悬浮液 (5X106f/mL)混勻，23°C、150rpm 培养 12h ；(3)然后涂布于共培养培养基上孔径为0. 45i!m的5mm2的纤维素膜上，23°C培养 48h ；其中，共培养培养基包括200 u g/mL氨苄青霉素、200 u g/mL头孢噻肟钠和200 u g/mL 四环素；(4)最后挑取单个转化子转移至含潮霉素100 u g/mL的液体CMC培养基内促进产 孢。在一个优选的方式中，在步骤3后进行选择培养的时，选择培养基包括100 u g/mL的潮 霉素、200 u g/mL的头孢噻肟钠和200 u g/mL的氨苄青霉素有益效果本发明首次发明了甜瓜蔓枯病菌分生孢子的转化体系，为了研究该菌功能基因以
3及甜瓜蔓枯病菌互作的提供了基础。
图1为不同潮霉素B浓度对甜瓜蔓枯病菌分生孢子萌发的影响实验结果图。其中， 每个平板上的数字分别代表0、25、50、100、150、200、2501^/11^的潮霉素B的PDA平板。图2为不同潮霉素B浓度对甜瓜蔓枯病菌菌丝生长的影响。其中每个平板上的数 字分别代表0、25、50、100、150、200、250118/11^的潮霉素B的PDA平板。图3为甜瓜蔓枯病菌的转化子以及野生型的潮霉素抗性基因HPT II的PCR扩增 结果图。其中M，是DNA marker, WT是野生型的甜瓜蔓枯病菌，1是3甜瓜蔓枯病菌的转化 子。试验为了进一步说明本发明的效果，我们进行了试验。这些试验仅仅是本发明的有限 实施方式的列举，并不构成对本发明权利要求限制性的解释。试验材料供试菌株。甜瓜蔓枯病菌(Didymella bryoniae，DB11)，于浙江省农业科学 院植物保护与微生物研究所的经济作物病害研究室保存；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaceins)菌株AGL1 (根癌农杆菌AGL1由浙江农科院植物保护与微生物研究所真菌研 究室王艳丽于2008年9月馈赠)；质粒pHG包括pHIG2RHPH2-GFP-GUS —段序列的载体，简 称PHG，(包含pHG质粒的大肠杆菌由浙江大学农业与生物技术学院宋凤鸣教授月于2005 年8月馈赠)，按照常规方法把质粒pHG转化到根癌农杆菌AGL1中，并在YEB培养基(含新 霉素Neo浓度25 u g/mL)上生长48小时备用。培养基YEB培养基Beef extract (牛肉浸膏)5g/L, Yeast extract (酵母膏)lg/L, P印tone (蛋白 胨)5g/L，Sucrose (蔗糖)5g/L，MgS04. 7H20 4g/L，Agar (琼脂)，15g/L pH 7. 4。马铃薯葡萄糖培养基(PDA)马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加水1000mL。AB MM 培养基每升含50mL AB 缓冲液(20XAB Buffer :K2HP04 60g/L, NaH2P04 20g/L)，50mL AB 盐(20XAB 盐NH4C1 20g/L,MgS04 7H20 6g/L, KC1 3g/L, CaCl2 0. 2g/L，FeS04 7H2050mg/ L，pH = 0. 7)和0. 5%的葡萄糖。诱导培养基(IM)1XAB 缓冲液，2mmol/L NaP04, 50mmol/L MES (pH 5. 6)，0. 5%葡萄糖。共培养培养基(MM)与IM相同，但是葡萄糖的含量为0.25%。试验1甜瓜蔓枯病菌的产抱蔓枯病菌孢子悬浮液的准备将甜瓜蔓枯病菌(浙江省农业科学院植物与微生物 研究所经济作物病害研究室分离保存)接种在PDA培养基(马铃薯200克煮沸10分钟，过 滤汤汁，弃固体薯块，取滤液，然后加蔗糖20克，琼脂17克，纯水定容至1升，灭菌后备用)上，并在40W紫外灯(12h紫外灯/12h黑暗)下处理4d诱导产孢。用灭菌水洗下孢子，采 用血球计数板测定，配成5 X 106个/mL孢子悬浮液备用。试验2平板法测定不同潮霉素B浓度对甜瓜蔓枯病菌孢子萌发的抑制效果配制含潮霉素(0、25、50、100、150、200和250ii g/mL)的PDA培养基，倒平板， 5 X 106个/mL孢子悬浮液稀释1000倍，吸10 y L蔓枯病菌孢子悬浮液的稀释液均勻涂布到 平板上，每培养皿平均50个分生孢子，28°C培养4d观察菌落生长情况。每处理重复三次。试验结果表明(图1)，PDA平板含0-25 u g/mL潮霉素B时对甜瓜蔓枯病菌的分生 孢子萌发基本没有抑制作用，含50 y g/mL潮霉素B时对孢子的萌发抑制作用较强，但是孢 子还是能萌发，而含100 u g/mL潮霉素B时甜瓜蔓枯病菌的分生孢子就不能萌发了。 _4] i式I 3 ￥臓■綱朝籠B W應甘應古碰麟果配制含潮霉素8(0、25、50、100、150、200和250 u g/mL)的PDA培养基，倒平板，打 孔器取同等菌龄和直径的菌碟放置到平板中心，28°C培养7d观察菌落生长情况。每处理重 复三次。试验结果表明(图2)，PDA平板含25 u g/mL潮霉素B就对甜瓜蔓枯病菌的菌丝生 长产生强烈的抑制作用。结合分生孢子萌发的抑制效果，所以我们的转化选择100 y g/mL 潮霉素B来筛选阳性转化子i式I 4柳劍亏#1、氡賴聽禾口卜細敵__吿丨丨 作用配制含200 u g/mL氨苄青霉素+200 u g/mL头孢噻肟钠+200 u g/mL四环素的共培 养培养基(MM)，AGL1 :pHG菌液10 y L均勻涂布到固体平板上，待培养基吸收菌液后，28°C 倒置培养4d观察菌落生长情况，没有任何抗生素的共培养培养基(MM)的平板培养根癌农 杆菌做对照。每处理重复三次。实验结果表明，AGLl::pHG在不含任何抗生素以及含200i!g/mL氨苄青霉素 +200 u g/mL头孢噻肟钠+200 u g/mL四环素的共培养培养基(MM)上都不能生长，为了抑制 其他杂细菌生长，特选择200 u g/mL氨苄青霉素+200 u g/mL头孢噻肟钠+200 u g/mL四环 素的共培养培养基(MM)共培养蔓枯病菌孢子和AGLl::pHG根癌农杆菌。
_0] i式验5根癌农射舌仆,禾口转仆,用If液准备YEB培养基上培养的C58C1: :pHG菌株上转移至基本培养基(AB匪Neo 25 u g/ mL)上培养48h。然后把50mL菌液在4000rpm下离心lOmin收集菌体，最后用5mL(l/10体 积)的诱导培养基洗涤两次，收集菌体。5mL(l/10体积)的IM+AS(乙酰丁香酮)100mmol/ L+Neo (25 u g/mL)悬浮根癌农杆菌菌体，调整0D66(1 = 0. 18。试验6共培养和筛选转化用根癌农杆菌的菌液100 PL与等体积的蔓枯病菌分生孢子悬浮液(5X106 个/mL)混勻，23°C、150rpm培养12h，然后涂布于共培养培养基(MM)上孔径为0. 45 y m的 5mm2的纤维素膜的一面上，纤维素膜的另一面直接与共培养培养基接触，23°C培养48h，其 中共培养培养基包括200 u g/mL氨苄青霉素+200 u g/mL头孢噻肟钠+200 u g/mL四环素。然后用2mL基本培养基洗上述的纤维素膜，收集真菌和细菌培养物，然后取 200 u L的基本培养基洗涤溶液涂在含100 u g/mL的潮霉素、200 u g/mL的头孢噻肟钠和 200 u g/mL的氨苄青霉素的选择培养基上，进行选择培养，同时抑制根癌农杆菌的生长。
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试验7转化子的提取和促讲产孢挑取单个转化子转移至含100 μ g/mL的潮霉素的液体CMC培养基内促进产孢。培 养后，紫外灯照射4天(12小时光照，12小时黑暗)产孢。试验8转化子的筛诜鉴定蔓枯病菌基因组DNA提取。真菌基因组DNA提取试剂盒(宝生物工程(大连)有 限公司)提取蔓枯病菌基因组DNA，0. 8%的琼脂糖电泳检测DNA的质量。潮霉素B抗性基因 的分子检测。使用潮霉素B抗性基因HPT II的引物PCR扩增该基因，PCR产物469bp，引物 序列Up primer :5，-TCCATACAAGCCAACCAC-3，；Down primer :5，-TGACCTATTGCATCTCCC_3，。 PCR 程序如下:95V 5min ；95°C 30s, 50°C 30s, 72°C 45s，30cycles ；72°C 5min。潮霉素抗性 基因HPT II的PCR扩增结果表明T-DNA已经插入到甜瓜蔓枯病菌的染色体上(见图3)本发明已经成功得到甜瓜蔓枯病菌的T-DNA插入转化子，IO6个分生孢子的转化可 以得到125个左右的转化子。本文中用来描述方法的术语和表达方式并不是唯一不变的，并且我们没有任何意 图使用这些术语和表达方式来排除描述本方法或者特征的任何相同意义的表达方式，我们 认同在本发明声明的范围内的各种不同的表达方式。因此，我们认为尽管在本文中本发明 已经用各种具体方案和任意的特征描述清楚地展示出来，但是改变本文中揭示的设计的 表达方式还要求助于那些有经验的专业技术人士，并且这些改变要与本发明附带的声明一 致。文章、专利、专利应用和所有其它文档的内容以及本文中提到的和引证的有用的 电子化信息是结合在一起的，必须作为一个完整的内容来参考，发表其中任何一个部分都 要特别指明这一点。申请者具有将任何和全部的这些文章、专利、专利应用或其它文档的信 息和材料合并入该申请书作为本专利说明书揭示的一部分的权利。
权利要求
一种根癌农杆菌介导的转化甜瓜蔓枯病菌的方法包括(1)将甜瓜蔓枯病菌接种在PDA培养基上，并在40W紫外灯(12h紫外灯/12h黑暗)下处理4d诱导产孢，用灭菌水洗下孢子，采用血球计数板测定，配成5×106个/mL孢子悬浮液；(2)用活化的根癌农杆菌的菌液100μL与等体积的蔓枯病菌分生孢子悬浮液(5×106个/mL)混匀，23℃、150rpm培养12h；(3)然后涂布于共培养培养基上孔径为0.45μm的5mm2的纤维素膜上，23℃培养48h；其中，共培养培养基包括200μg/mL氨苄青霉素、200μg/mL头孢噻肟钠和200μg/mL四环素；(4)最后挑取单个转化子转移至含潮霉素100μg/mL的液体CMC培养基内促进产孢。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3后进行选择培养，选择培养基包括 100 μ g/mL的潮霉素、200 μ g/mL的头孢噻肟钠和200 μ g/mL的氨苄青霉素。
全文摘要
本发明提供一种根癌农杆菌介导的转化甜瓜蔓枯病菌的方法包括(1)将甜瓜蔓枯病菌接种在PDA培养基上，并在40W紫外灯(12h紫外灯/12h黑暗)下处理4d诱导产孢，用灭菌水洗下孢子，配成5×106个/mL孢子悬浮液；(2)用活化的根癌农杆菌的菌液100μL与等体积的蔓枯病菌分生孢子悬浮液混匀，23℃、150rpm培养12h；(3)然后涂布于共培养培养基上孔径为0.45μm的5mm2的纤维素膜上，23℃培养48h；其中，共培养基包括200μg/mL氨苄青霉素、200μg/mL头孢噻肟钠和200μg/mL四环素；(4)最后挑取单个转化子转移至含潮霉素100μg/mL的液体CMC培养基内促进产孢。
文档编号C12N15/80GK101824431SQ200910154750
公开日2010年9月8日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者任海英, 方丽, 王汉荣, 茹水江 申请人:浙江省农业科学院