专利名称：一种不动杆菌及其复合菌剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物菌剂技术领域，尤其涉及一种不动杆菌及其复合菌剂的应用。
背景技术：
近年来，由于城市和工业的迅速发展，以及农业上广泛施用化肥，大量污水排入水 体中，使很多水体富营养化。目前，治理水体富营养化的措施主要包括传统的营养盐控制 措施；对外源性污染采取截污、污水改道和污水除磷等；对内源性污染采取清淤挖泥、营养 盐钝化、底层曝气和稀释冲刷等一系列措施；化学药品杀藻、机械捞藻等直接除藻措施；以 浮游动物、鱼类和水生高等植物控制水体营养盐及浮游植物的生物调控措施。一些研究者 对活性炭吸附、光降解与光催化氧化、臭氧氧化、化学药剂氧化、膜过滤等技术进行了研究， 但到目前为止尚无有效应用技术。随着水产养殖业的快速发展及集约化养殖水平的提高，水产养殖病害日趋严重。 水产养殖业仍沿袭以往的静水池塘养殖为主，且大部分为高密度单一品种养殖，切断了自 然生态体系的食物链循环，养殖对象的残剩饲料、排泄物等大量有机物失去了被其它生物 利用的机会，其中的蛋白质及核酸会慢慢分解，产生大量氨等含氮有害物质，过多的氨氮积 累引起鱼、虾病害、死亡和水体的富营养化，为养殖业带来巨大的损失。在水产养殖过程中， 池塘水体富营养化现象出现频繁，严重的出现水华。例如在虾苗期，投喂的饵料绝大部分不 能被虾苗摄食而流失于水体或沉积到池底，在合适的外界环境下，有害藻类就会过量繁殖， 最终可能导致水体老化，水生生态结构破坏，病害暴发。水体中存在着大量的微生物，既存在有益微生物也存在有害微生物，有益微生物 占据优势则会净化水体，促进水产动物的健康生长。近年来，人们开始尝试在养殖生产中使 用有益微生物菌制剂，以改善水体生态环境。目前世界许多国家和地区如巴西、日本、韩国 等，对有效微生物群技术在农业、畜牧业和水产养殖上的应用进行了研究。有效微生物群是 从自然界筛选出各种有益微生物，用特定的方法混合培养所形成的微生物复合体系，有效 降解去除水体中一些有害化因子，维护水体中正常浮游生物的种群数量和结构，使水体自 然生态将得到平衡。有效微生物群技术在环保方面的研究工作起步较晚，近几年来逐步开 始应用在净化城市生活污水对河流和湖泊的污染及固体废弃物除臭方面。在养殖水体中 应用的如中科院淡水渔业研究中心将光合细菌用于鳗池水质净化和对虾养殖，大连水产学 院利用光合细菌净化虾池水质，黑龙江水产所利用光合细菌降解氨氮；仇丽等利用枯草芽 孢杆菌改善中华绒螯蟹人工育苗水质。光合细菌施放于池塘中，能消除水体中的氨氮、硫化氢、有机酸等有害物质，改善 水体质量，平衡酸碱度，但对于进入水体中的大量大分子有机物质，如养殖动物的排泄物、 残存饲料、浮游生物残体等却无法分解利用；而枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等这类菌株， 它们能分泌多种胞外酶，把大分子有机物质分解成小分子有机物，再进一步矿化生成无机 盐类，加快了有机物的分解速度，目前绝大部分养殖业者采用泼洒光合细菌等方法应对，但 总的来说产品还有局限性，不够完善。
水华产生的主要原因是水质富营养化，我们从富营养化虾塘底泥中分离纯化出一 株不动杆菌菌株，与光合菌、芽孢菌复合制备一种包含多种高效活菌的复合微生物菌剂，可 有效降解或去除水体中一些有害化因子，维护水体中正常浮游生物的种群数量和结构，使 水体自然生态得到平衡，是治理湖泊、养殖水体的一种比较有效的方法，同时微生物制剂具 有投加量小，操作简便，无毒副作用及经济合理等特点，可以较低的成本有效地抑制藻类的 生长，使水体透明度提高，防止水华的发生。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种不动杆菌及其复合菌剂的应用。不动杆菌(AcinetcAacter sp. ) ZJTK-006是从富营养化养殖塘底泥中分离纯化得 到的纯菌株，保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏日为2009年11月16日，保藏编号为=CGMCCNo. 3452。所述的不动杆菌ZJTK-006的16SrDNA具有SEQIDNo. 1的序列。不动杆菌 (Acinetobacter sp.) ZJTK-006用于制备微生物复合菌剂。所述的微生物复合菌剂的制备 方法为将不动杆菌(Acinetobacter sp. )ZJTK-006与枯草芽孢杆菌(Bacilluscereus)As 1. 1414、沼泽红假单胞菌(lihodopseudomonas palustris)As 1. 2181，经分别培养后，按其 培养物以113的体积比例配比均勻混合制成的微生物复合菌剂。微生物复合菌剂用 于富营养化养殖水体中的氨氮、叶绿素a处理。枯草芽孢杆菌(Bacillus cereus)As 1. 1414及沼泽红假单胞菌 (Rhodopseudomonas palustris)As 1. 2181来源于中国普通微生物菌种保藏中心。本发明与现有技术相比具有的有益效果本发明的不动杆菌(Acinetobactersp. )ZJTK_006CGMCCNo. 3452、枯草芽孢杆菌、 沼泽红假单胞菌分别按各自的培养条件进行培养，然后按1 1 3的体积比例配比均勻 混合制成的微生物复合菌剂，能够适应高密度养殖富营养化水体的氨氮处理。这些菌株单 独使用时，虽然具有一定的去除氨氮能力，但是效果不是很明显，本发明由于菌株之间具有 协同互补作用，产生了与其单独作用意想不到的效果，同时比枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞 菌混合使用时的去除氨氮、叶绿素a效果更好。微生物复合菌剂可使水体中的菌相与藻相 达到平衡，维持稳定良好水质条件，使富营养化氨氮养殖水体得到净化处理，还有一定的去 除叶绿素a的作用，对富营养化水体叶绿素a含量的降低和水体透明度的提高有明显的效^ ο
图1为不动杆菌ZJTK-006革兰氏染色照片；图2为不动杆菌ZJTK-006CGMCCNo. 3452的电镜照片；图3为实施例5水体氨氮变化趋势；图4为实施例5水体叶绿素a变化趋势。
具体实施例方式不动杆菌(AcinetcAacter sp. ) ZJTK-006是从富营养化养殖塘底泥中分离纯化得到的纯菌株，保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏日为2009年11月16日，保藏编号为=CGMCCNo. 3452。所述的不动杆菌ZJTK-006的16SrDNA具有SEQIDNo. 1的序列。不动杆菌 (Acinetobacter sp.) ZJTK-006用于制备微生物复合菌剂。所述的微生物复合菌剂的制备 方法为将不动杆菌(Acinetobacter sp. )ZJTK-006与枯草芽孢杆菌(Bacilluscereus)As 1. 1414、沼泽红假单胞菌(lihodopseudomonas palustris)As 1. 2181，经分别培养后，按其 培养物以113的体积比例配比均勻混合制成的微生物复合菌剂。微生物复合菌剂用 于富营养化养殖水体中的氨氮、叶绿素a处理。枯草芽孢杆菌(Bacillus cereus)As 1. 1414及沼泽红假单胞菌 (Rhodopseudomonas palustris)As 1. 2181来源于中国普通微生物菌种保藏中心。实施例1分别采集富营养化养殖塘水体及底泥，接种到液体基础培养基中，于32-35°C，摇 床转速150r/min下培养2天，以水体中的氨氮值为指标，将氨氮降低明显的液体培养混合 微生物稀释涂布于固体基础培养基上，以上操作重复二次，挑取长势良好的单菌落，作为初 筛菌。将初筛菌株接种在液体分离培养基中，于32-35°C，摇床转速150r/min下进行培养 3-4天，测定MC-LR的含量，确定菌株降解MC-LR的能力强弱，挑选氨氮降低明显同时又对 MC-LR具有一定降解作用的菌落划单菌落纯化两次，即得到所筛选菌株ZJTK-006。基础培养基:Na2HP042. 4g, ΚΗ2Ρ042· 6g, NaClO. 328g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, CaCl2 · 2H20 0. 013g，NH4Cll. Og，葡萄糖2g，加水溶解，补充蒸馏水至1000ml, PH7. 2-7. 5(固体需加2% 琼脂)。分离培养基:Na2HP042.4g, ΚΗ2Ρ042· 6g, NaClO. 328g, MgSO4 · 7H200. 5g, CaCl2 · 2H200. 013g, MC-LRO. 005g，加水溶解，补充蒸馏水至 1000ml，PH7. 2-7. 5。培养温度32-37 °C，适宜温度32-35 °C，震荡培养。实施例2本发明分离出一株不动杆菌(AcinetcAacter sp. ) ZJTK-006，根据其形态特征及 基于16SrDNA序列的系统进化分析对其进行鉴定。其特征在于它是从富营养水塘底泥中分 离纯化得到的纯菌株，其16SrDNA具有SEQIDNo. 1的序列，保存在中国专利局指定的保藏单 位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为CGMCCNo. 3452。(1)不动杆菌(Acinetobacter sp. ) ZJTK-006的形态及理化特征形态特征近球形短杆菌，0. 5-1. OymXO. 6-1. 6 μ m,不产芽孢，革兰氏染色阴性，偶尔脱色 困难，(见图)；菌落呈乳白色，圆形，边缘整齐。理化特征该菌株专性好氧，接触酶阳性，氧化酶阴性，不能进行葡萄糖发酵，不能利用乙醇 发酵，V. P.试验阳性，不具运动性，明胶水解阴性，柠檬酸盐利用阳性，葡萄糖产酸阴性， 丙二酸盐阳性，L-苯丙氨酸阳性，化能异养。依据《伯杰细菌分类手册》提供的鉴定方法和上述试验结果表明，可初步判定为不 动杆菌属的菌株。
(2) 16S rDNA序列的系统进化分析测定不动杆菌16S rDNA部分序列。下表在本发明所述的依据不动杆菌序列从GeneBank中调出的部分相关菌株的 16SrDNA序列的登录号。
权利要求
1.一种不动杆菌(AcinetcAacter sp.) ZJTK-006，其特征在于它是从富营养化养殖塘 底泥中分离纯化得到的纯菌株，保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保存编号为CGMCCNo. 3452。
2.根据权利要求1所述的一种不动杆菌(AcinetcAactersp.) ZJTK-006，其特征在于 所述的不动杆菌ZJTK-006的16SrDNA具有SEQIDNo. 1的序列。
3.一种不动杆菌(AcinetcAacter sp.) ZJTK-006的应用，其特征在于用于制备微生物 复合菌剂。
4.根据权利要求3所述的一种不动杆菌(AcinetcAactersp.) ZJTK-006的应用，其特 征在于所述的微生物复合菌剂的制备方法为将不动杆菌(AcinetcAactersp.)ZJTK-006 与枯草芽孢杆菌(Bacillus cereus)As 1· 1414、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)As 1. 2181，经分别培养后，按其培养物以1 1 3的体积比例配比均勻混合 制成的微生物复合菌剂。
5.一种微生物复合菌剂的应用，其特征在于用于富营养化养殖水体中的氨氮、叶绿素 a处理。
全文摘要
本发明公开了一种不动杆菌及其复合菌剂的应用。该菌剂涉及不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006、枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌共3种菌株，这些菌株经培养后，按其培养物以1∶1∶3的体积比例配比组成微生物复合菌剂，其中不动杆菌ZJTK-006保存编号为CGMCCNo.3452。本发明制备的菌剂适用于富营养化及高密度养殖水体中的氨氮和叶绿素a的去除处理，能形成良好的微生态体系，促进整体水体生态系统的修复。
文档编号C12R1/01GK102146347SQ20091015571
公开日2011年8月10日 申请日期2009年12月18日 优先权日2009年12月18日
发明者叶俊英, 邱晓力, 郭红樱, 陈欢 申请人:浙江天科高新技术发展有限公司