一种糖尿病治疗药物的高内涵筛选方法

专利名称：一种糖尿病治疗药物的高内涵筛选方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种一种糖尿病药物的高内涵药物筛
选方法
背景技术：
生命科学、信息科学与制造科学相结合，是二十一世纪科技发展的重要趋势。基于 先进制造理论和组织工程理论的细胞三维受控组装，为组织工程、药物筛选等研究领域拓 展了新的理论和技术空间。在药物研发领域，90年代以来全球药物研发机构广泛应用的高 通量筛选(High-Throughput Screening, HTS)等药物筛选评价技术，面临低成功率的困境 (Bleicher KH， et al. Nat Rev Drug Discov. 2003 ;2 (5) :369-78)。其原因是由于现有的 体外药物筛选体系和真实的体内环境存在巨大差异，这种差异导致筛选的低成功率。因此 构建和体内环境一致的体外评价筛选系统，是目前药物研发领域必须解决的关键技术。而 用细胞组装技术可以构建仿真体内环境的3D多细胞系统用于药物筛选，这样的技术为组 织工程和药物研究领域搭起了桥梁，对于细胞组装技术和药物筛选技术都具有重要的科学 意义和应用价值。 建立在计算机3D建模和先进制造离散堆积理论基础上的细胞三维组装技术， 是在组织器官的解剖学数字模型直接驱动下，定位装配活细胞/材料单元，制造组织 或器官的多细胞前体的技术。如哈佛大学Lee W等人开发的3D bio-printer技术， 可喷射细胞和材料，逐层打印纤维原细胞和角质细胞形成多层皮肤结构(Lee W， et al. Biomaterials. 2009 ;30 :1587—95)。南卡罗来纳大学Mironovf F禾口Clemson大学Boland R等人开发的3D-cell printer技术，通过改装打印机喷头喷射细胞和特殊的基质材料，打 印出有活性的三维细胞系统(Zhang C， et al. Biomaterials, 2008 ;29 (28) :3781-91)。业 利桑那大学Smith CM开发的3D bioassembly，基于直写技术组装细胞，并系统研究了各种 环境因素对组装细胞的活性影响(Smith CM，et al. TissueEng. 2007 ;13 (2) :373-83) 。 MIT 的Vacanti JP和德雷珀实验室Borenstein J等，也以细胞为装配材料，结合芯片制造工 艺，制造出微血管系统(Fidkowski C，et al. TissueEng. 2005 ;11 (1-2) :302-9)。国内清华 大学颜永年等开发了基于快速成型(RP)原理的细胞三维受控组装技术，组装了能保持3个 月活性的人工肝、人工脂肪等组织(Yan YN，et al. Biomaterials. 2005 ;26 (29) :5864-71)。
然而，由于器官结构的精细和复杂性，细胞组装技术面对制造肝、肾、心脏等复杂 器官还有很多问题亟待解决。与此同时，细胞组装技术由于可以构建复杂的3D细胞培养 模型，在生命科学其它领域显示了重要的理论和应用价值。研究者近年来利用组织工程技 术制造的三维多细胞体开展研究，取得显著成果。比如普林斯顿大学的Basu S等人，利用 人造三维多细胞体，研究了发育生物学的模式建成问题(Basu S， et al. Nature. 2005， 28 ; 434(7037) :1130-4)。 Hotary KB等利用三维多细胞体，发现MT1-匪P通过改变细胞空间几 何形状，影响肿瘤细胞在3D基质中的增殖(Hotary KB，et al. Cell. 2003 ;114(1) :33-45)。 Basu S指出，构造和研究三维多细胞体，可以提高对生物发育和功能的了解，并可应用于生 物材料，生物感测研究中。这些研究利用简单的技术构建三维多系统，在生物学和药物筛选等领域取得了有效的成果，证明细胞组装技术在药物筛选领域有重要的研究和应用价值。
在药物研发领域，90年代以来，基于分子和细胞水平信息检测的高通量筛选技术 (High-Throughput Screening, HTS)，成为新药开发的主要手段。但由于整体是由多种细 胞在三维空间有序排列，不同细胞间进行信号传导、调控的复杂体系；与HTS技术的基础 体外研究单个药物靶标、细胞二维培养、细胞结构和功能不完整是完全不同的。这种差异 对细胞结构和功能造成显著影响，如Kang X发现相比二维培养，脂肪细胞在三维培养环 境中，其形态、增殖、分化，基因表达，代谢等生理功能存在明显差异(KangX， et al. Tissue Eng. 2005 ;11(3-4) :458-68)。正是这种差异，造成了目前困扰全球药物研发机构的问 题——HTS快速筛选出药物先导物，但其中绝大多数在整体实验中没有药理活性。HTS迫切 需要发展为高成功率的高内涵筛选(High Content Screening, HCS)已成为药物研究领域 的共识(Bleicher KH， et al. Nat Rev Drug Discov. 2003 ;2 (5) :369-78)。在国内，由于资 金有限，药物研发高成本和高风险带来的影响更为严重。同时，04年来罗氏、诺华、默克等大 型跨国公司相继进入中国的药物研发领域，抢夺中国宝贵的中药资源，中国迫切需要开发 低成本高效率的药物研发技术。 HCS的前提是保持细胞结构、功能的完整性，这要求为细胞提供与体内相似的生长 环境，为此研究者开始构建三维细胞系统进行药物研究。哈佛的Fischbach C等，利用三 维支架培养细胞建立肿瘤模型，显示恶化、药敏等特征接近真实肿瘤，是良好的肿瘤药物筛 选工具(Fischbach C， et al. Nat Methods. 2007 ;4 (10) :855-60)。 Liana Adam用细胞囊 这样的三维多细胞体，进行肿瘤药物研究[18]。由于肝细胞可用于研究药物代谢和毒性， Griffith LG(Sivaraman A， et al. Curr Drug Metab. 2005 ;6(6) :569-91)，构建了肝细胞 三维多细胞系统；S皿W用Multi-nozzle d印ositio技术组装细胞，构建了三维微肝组织， 用于药物代谢研究(Chang R， et al. Tissue Engineering. 2008 ;14(2) :157-66)。 Yamada KM指出三维细胞模型可以填补二维细胞培养和动物实验间的缺口 ，对药物筛选有重要意义 (Yamada KM， et al. Cell. 2007 ; 130 (4) :601-10).如果构建具有复杂的功能性组织结构和 体内更相似的三维系统，将进一步推动药物筛选技术的发展。 通过以上分析可见，组织工程学的先进技术可应用于其它研究领域取得成果。在 药物研发领域，由于高通量筛选技术具有低成功率的缺陷、高通量筛选迫切需要发展为高 内涵筛选，而目前高内涵筛选在保持细胞结构和功能完整性上没有较大进展。这些领域的 现状和问题，引导我们提出利用细胞组装的理论和技术构建体外病理模型，应用于高内涵 药物筛选，该技术有重要的理论价值和广泛的应用前景。

发明内容
本发明的目的是提供一种糖尿病治疗药物的高内涵药物筛选方法
生理系统是由多个行使不同功能的器官或组织配合在一起组成。在人的各个生理 系统中，既有如循环，泌尿系统这样由多个组织器官组成，对空间结构要求精确，结构复杂 的系统，也有空间结构上相对简单的系统，能量代谢系统就是这样的系统。能量代谢系统主 要由几群不同功能的细胞脂肪细胞，胰岛细胞，神经细胞等构成，在一定的空间结构内，通 过内分泌等细胞通讯手段，组成调控机体能量代谢的复杂网络系统。近年来大量研究证实 P细胞和脂肪细胞构成脂肪细胞_胰岛素轴调节能量代谢，内皮细胞则是构成选择性透过内分泌因子的分泌调节生物屏障。胰岛素分泌紊乱、胰岛素抵抗，脂肪细胞和内皮细胞功能 损伤之间复杂的相互影响和作用，是联系代谢综合症的各种病理生理异常的主要机制。
动物能量代谢系统的基本结构和参数(以人体为例) (1)正常人体脂肪含量约占人体体重的10 %，脂肪细胞总数约为
26. 9X 109± 1. 8X 109，而正常人胰腺中胰岛总数约有100万个。由此得到，正常人脂肪细
胞_胰岛素轴中，脂肪细胞和胰岛的比约为3X 104脂肪细胞(个)/胰岛(个)。 (2)人体脂肪细胞组织分布广泛，在正常情况下，绝大部分皮下层、网膜系膜、肾脏
周围及骨髓等处有大量的脂肪沉积，构成能量代谢系统的结构基础。
(3)胰岛集中散布在胰腺中的细胞群，构成能量代谢调节的点。
(4)在脂肪细胞和胰岛之间，各自分泌的调节因子需要通过血管屏障，然后通过血
液输送扩散到作用位置，因此内皮细胞构成选择性透过能量调节内分泌因子的生物屏障。 而以细胞组装技术组装和诱导多种细胞并控制它们的精确位置，构建多种细胞的
结构体在理论和技术上都是可行的。通过对脂肪细胞、胰岛P细胞和内皮细胞在体内的空
间关系和数量比例的研究，我们设计了一种糖尿病病理模型，并利用该模型用于糖尿病治
疗药物的高内涵药物筛选，该药物筛选方法包括如下步骤 (1)将脂肪干细胞和基质材料组装形成具有一定孔隙率的含有细胞的三维结构 体； (2)通过控制诱导分化条件，使三维结构体内通道表面的脂肪干细胞分化为内 皮细胞，并在通道表面自组装成内皮样结构，基质材料内部的脂肪干细胞则分化为脂肪细 胞； (3)将从动物体内分离的胰岛细胞直接组装在三维结构体的空隙中； (4)对上述的三维结构体给予高浓度的葡萄糖、脂肪酸、胰岛素、TNF或脂肪细胞
分泌因子等剌激物，诱导脂肪细胞、胰岛细胞和内皮细胞产生糖尿病病理症状； (5)在上述的培养系统中加入待测药物，检测模型在正常和病理条件下的相关标
记物水平，分析待测药物的药理活性进行药物筛选。 上述步骤中，脂肪干细胞的数量为1(f-108个/lml基质材料，优选l-5Xl(f个 /lml基质材料。胰岛细胞数量为5-50个，优选为10-20个。脂肪干细胞和胰岛细胞来源于 动物，例如大鼠、小鼠、兔子、猪、牛或人等，优选来源于大鼠和人。 细胞外基质构成细胞生存的外环境，它们是发育过程中从细胞内分泌到细胞外的 各种大分子，然后在细胞周围构成高度水合的凝胶或纤维性网络，起支持、保护、营养细胞 的作用，对细胞的分化、运动、通讯有重要影响。应用于细胞组装的人工基质材料应有助于 三维组装结构的形成和稳定，有助于细胞在适宜的三维开放环境内形成细胞群，并传输化 学和力学信号至细胞。 细胞外基质的成分复杂，包括胶原蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖、层连蛋白、纤连蛋白 和弹性蛋白等，这些成分的具有不同的分子构成，分子长度，和结构特性。本发明从仿生学 角度考虑，组装过程的细胞外基质材料，应该是由多种材料构成的，而单一材料也是很难满 足机械成形、构建多级结构及可控降解性等的需求的。综合考虑以上对材料的要求，选择 了具有良好生物相容性、可控降解性和细胞亲和性的明胶(Gelatine)、海藻酸钠(Sodium alginate)和纤维蛋白原混合作为基质材料。
基质材料是包含明胶、海藻酸钠、纤维蛋白原三种材料的组合物，明胶、海藻酸钠
和纤维蛋白原的配比为i : o.2-i : o.2-i。可以将明胶和海藻酸钠分别溶于PBS缓冲液
中，将纤维蛋白原溶解于DMEM培养液中，临用时将三种材料以1 : 0.2-1 : 0.2-1均匀共
混，优选以i : i : i共混。由于基质材料是共混物，因此，其凝胶化方式比单一材料的凝胶 化方式多，既可以通过控制温度(明胶)实现凝胶化，也可以通过引入交联剂和酶凝胶化。 更具有优势的是，可以用酶和诱导因子控制结构的降解。 将共混材料和培养的脂肪干细胞混合，得到浓度约为10e-108个脂肪干细胞/mL的 脂肪干细胞_复合材料共混材料，优选为优选1-5 X 107个脂肪干细胞/lml共混材料。
上述步骤中，可通过细胞组装技术将溶于基质材料内的脂肪干细胞组装成型。用 于细胞三维受控组装的专用实验系统主要包括专用数据处理软件，例如Solidworks， Cark 分层软件等，基于四轴运动控制卡和步进电机驱动的三维成形平台，材料输运子系统，及独 立温控的成形室及分体式设计的成形底板。通过整个系统的协调控制，实现了对组装过 程的精确控制，成形完成后得到具有一定孔隙率的含有细胞的三维结构体，孔隙率优选为 65% -85%。 将明胶基共混材料/细胞组装结构体培养3-5天，冷冻干燥后的电子显微镜照片 显示，明胶/海藻酸钠/纤维蛋白原共混材料，结构孔隙率高，由于纤维蛋白原凝固聚合后 的分子链比海藻酸钠长，更容易形成大量具有10 30um直径孔隙的结构。细胞在三维空间 自由伸展，形成网状结构和大量空隙可供培养液深入结构内部。上述实验结果充分证实了 采用海藻酸钠、纤维蛋白原和明胶基共混材料，可以构建出适合细胞生长的微单元结构。
上述步骤中，纤维蛋白原/明胶/海藻酸钠/细胞通过低温堆积成形，再经Ca2+ 离子和凝血酶双交联，结构稳定，既具有一定的硬度，也具有一定的抗拉特性，结构可稳定 维持1个月以上，设计的通道始终保持清晰可辩。其原因在于，海藻酸钠的分子链相对较短 和纤维蛋白聚合体的分子链较长，所以形成两种力学特性不同的结构，当两种材料配合在 一起使用时，两种分子结构共同作用，提高了组装结构的整体强度和稳定性。
上述步骤中，诱导分化条件可选择先用内皮生长因子(EGF)诱导，优选内皮 生长因子-1 (EGF-1)，使三维结构体内通道表面的脂肪干细胞先分化为内皮细胞，这些 终末分化的细胞将失去分化为脂肪细胞的能力；接着用地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤 (isobutyl-methylxanthine， IBMX)，诱导培养，使基质材料内部的脂肪干细胞能分化为成 熟的脂肪细胞。这一方法能精确控制结构体中不同位置脂肪干细胞的分化，细胞的分化取 决于诱导的步骤和脂肪干细胞在结构中所处的位置。 待分化诱导完成后，将从动物体内分离出的胰岛细胞定位组装在三维结构体内。 例如可用注射器吸取培养的结构完整的胰岛细胞注入到三维结构体的空隙中，胰岛细胞数 量为5-50个，优选为10-20个。 多细胞系统的三维结构体组装好以后给予高浓度的葡萄糖、脂肪酸、胰岛素、TNF 或脂肪细胞分泌因子等剌激物长时间剌激，诱导脂肪细胞、胰岛细胞和内皮细胞产生糖尿 病病理症状。 作为一种优选的技术方案，可采用10-25mM，优选15mM葡萄糖培养液培养5_10天 后，诱导产生糖尿病病理模型。 另一优选的技术方案，可采用6-20 ii M，优选10 ii M insulin培养液培养5-10天后，诱导产生糖尿病病理模型。 另一优选的技术方案，可采用30-80ng/mL，优选40ng/mL TNF-a培养液培养5-10 天后，诱导产生糖尿病病理模型。 上述的糖尿病病理模型可以在一定程度上反映糖尿病，包括I型糖尿病和II型糖 尿病的生理病理情况。糖尿病是一种常见的代谢内分泌疾病，是由于人体内胰岛素绝对或 相对缺乏所至，以高血糖为主要特征；糖尿病的发病，不仅有外周组织对胰岛素的抵抗性， 还有P细胞分泌功能不正常，即分泌胰岛素能力减低，释放缓慢，分泌峰的延迟，胰腺P细 胞分泌功能及胰岛素作用之间不能维持正常的动态平衡。目前治疗糖尿病的西药品种主要 有胰岛素及其类似物降糖药、a-葡萄糖苷酶抑制剂降糖药(竞争性抑制位于小肠的各种 a-葡萄糖苷酶，延缓肠道碳水化合物吸收)、磺硫脲类降糖药(直接剌激胰岛P细胞释放 胰岛素，，增强靶组织细胞对胰岛素的敏感性)、双胍类降糖药(促进肌肉等外周组织摄取 葡萄糖，加速无氧糖代谢)、噻唑烷二酮类降糖药(增强机体组织对胰岛素的敏感性，改善 胰岛P细胞功能)以及促胰岛素分泌剂降糖药(模拟生理性胰岛素分泌)等。
前已提及，我们构建的糖尿病病理模型能够在体外模拟糖尿病的发病机理。糖尿 病是能量代谢系统发生紊乱，和糖脂代谢密切相关，因而葡萄糖和脂肪代谢可作为糖脂代 谢的检测标志。另外脂肪-胰岛内分泌轴的主要调控因子包括胰岛细胞分泌的胰岛素，C 肽，胰高血糖素、生长抑素等等，其中最重要的能量调控因子是胰岛P细胞分泌的胰岛素； 脂肪细胞分泌的瘦素、抵抗素、脂联素、血管紧张素、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、性激素、前列 腺素E2等激素，其中比较重要的是瘦素、抵抗素和脂联素，这些均可作为糖尿病检测标记 物。由于糖尿病病理模型能够在体外模拟糖尿病的发病机理，在培养系统中加入待测药物， 检测模型在正常和病理条件下的相关标记物水平，分析待测药物的药理活性，即可高效筛 选出具有潜在治疗糖尿病疾病的目标化合物。
(1)葡萄糖 糖既是人体重要的供能物质，又是人体重要的组成成分之一。糖尿病中的糖代谢 障碍，首先导致机体能量供给障碍，由此可以产生一系列代谢变化，最终造成多方位的代谢 紊乱。培养液中葡萄糖相当于机体内的血糖，通过观察模型中的脂肪细胞对葡萄糖的转化 消耗，可以在一定程度上反映脂肪细胞的合成脂肪活力和对胰岛素的敏感性。因此培养液 中葡萄糖的消耗，可以作为糖代谢的检测标志。
(2)脂肪 脂肪动员是能量代谢的重要过程，在病理或饥饿条件下，储存在脂肪细胞中的脂 肪，被脂肪酶逐步水解为游离脂肪酸(FFA)及甘油并释放入血以供其他组织氧化利用。脂 肪动员受激素的调节，FFA既是提供能量的重要物质，血液中过高的游离脂肪酸又会对组织 造成伤害，包括诱发胰岛素抵抗、动脉粥样硬化和损伤胰岛细胞。所以，通过观察脂肪酸动 员，可以在一定程度上反映能量代谢系统的生理病理情况。脂肪的合成和FFA的释放可以 作为脂肪代谢的检测标志。
(3)脂肪合成 脂肪细胞作为能量的重要储存细胞，当血液葡萄糖浓度高时，将葡萄糖转化为脂 肪酸储存起来是脂肪细胞的重要功能。正常生理情况下的脂肪合成，可以存储脂肪，降低血 糖，而病理情况下的脂肪合成功能紊乱，则导致肥胖，有害的脂肪激素分泌，高血糖等病理反应。所以，脂肪干细胞的脂肪合成，可以在一定程度上反映脂肪干细胞分化为脂肪细胞和 合成脂肪的能力。采用Oil red O溶液染色脂肪细胞内脂肪，isopropanol萃取脂肪细胞 内的Oil red 0染料，酶标仪检测510nm处的吸光度的方法来检测脂肪合成。结果显示模 型中的脂肪干细胞，由于培养环境接近于真实体内情况，分化敏感，具有很强的合成脂肪的 活力。 对于高浓度葡萄糖长时间培养诱发的脂肪合成，罗格列酮该模型上显示出明显的 长时间促进作用。 (4)代谢调控物检测——胰岛素分泌 胰岛素是胰岛细胞分泌的最重要的调控因子，胰岛素由胰岛13细胞分泌是体内 调节糖、蛋白质、脂肪三大物质代谢和贮存的主要激素，并影响许多其它的重要生理功能。 代谢综合症的重要疾病之一 II型糖尿病的发病，不仅有外周组织对胰岛素的抵抗性，还有 P细胞分泌功能不正常，即分泌胰岛素能力减低，释放缓慢，分泌峰的延迟。
通过检测药物对胰岛素分泌的动力学参数的影响，可以筛选药物。为了检测能量 代谢系统模型中的胰岛细胞的分泌，建立灌注系统进行时间依赖的葡萄糖剌激胰岛素释放 实验。显示在15M葡萄糖剌激下，组装的胰岛细胞胰岛素分泌具有很高的活性。在长时间 的15mM的葡萄糖诱导培养后，模型中胰岛细胞对15mM葡萄糖剌激下的胰岛素分泌剧烈下 降，罗格列酮(属噻唑烷二酮类降糖药)可以增加胰岛细胞受高糖抑制的胰岛素分泌。胰 岛细胞对葡萄糖诱导的胰岛素分泌峰相比于正常情况下延迟2min，那格列奈(属促胰岛素 分泌剂降糖药)可以修正这一诱导的胰岛素分泌峰延迟。我们的模型不但再现了病理条件 下胰岛素分泌的紊乱，还检测出了那格列奈对胰岛素分泌紊乱的药理作用，证明了该模型 对筛选该类药物的有效性。同时模型也检测出罗格列酮的对胰岛素分泌的紊乱药理作用， 进一步证明了该模型对筛选噻唑烷二酮类和促胰岛素分泌类药物的有效
(5)脂肪细胞分泌的调控因子
a.瘦素 瘦素是由肥胖基因(ob基因)编码，由脂肪细胞分泌的肽类激素。瘦素具有广泛 的生物学效应，瘦素既可以作用于下丘脑的摄食中枢，降低食欲，增加能量消耗。又可作为 脂肪一胰岛内分泌轴的一部分，参与胰岛素内分泌的调节。还可通过各种机制影响血压的 调节等。胰岛素能剌激瘦素分泌，增加瘦素mRNA表达，同时瘦素又能直接抑制胰岛素分泌。 瘦素作为脂肪组织提供的一个抑制性控制信号，能防止肠促胰岛素和葡萄糖诱导的P细 胞胰岛素原基因的过度表达，抑止胰岛素的过度产生和高胰岛素血症的形成。瘦素促进脂 肪分解，抑制脂肪合成。瘦素还可使胰岛素受体底物-l(IRS-l)酪氨酸磷酸化减弱，而直接 影响胰岛素信号转导。在骨骼肌，瘦素能剌激肌肉对葡萄糖的摄取，在胰岛素和胰高血糖素 浓度正常的情况下增加肌肉对葡萄糖的摄取及胰岛素的敏感性。 除了对胰岛素效应的影响外，瘦素还可通过多种机制削弱胰岛13细胞分泌胰岛 素的功能，从而将肥胖与P细胞功能缺陷联系起来。病理情况下，瘦素受体敏感性减弱，瘦 素引起胰岛P细胞超极化，抑制胰岛素释放的能力减弱，导致高胰岛素血症。此外通过激 活磷酸二酯酶3B(PDE3B)而抑制肠道激素类高糖素肽-l(GLP-l)的分泌，从而使其剌激胰 岛素分泌的效能减弱。 总之，瘦素具有重要的生理作用，其代谢效应与胰岛素的作用相拮。脂肪组织和13细胞之间通过瘦素和胰岛素形成双向反馈调节，瘦素和胰岛素抵抗密切相关，在能量代谢
中起重要的作用。 b.抵抗素 抵抗素是由脂肪细胞分泌的一种多肽类激素，其基因特异表达于白色脂肪组织。 在前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞过程中，抵抗素mRNA的水平显著增加，同时营养和激 素都可以调控抵抗素的表达，喂高碳水化合物后，其表达水平可以显著增加25倍。抵抗素 被认为是联系肥胖与胰岛素抵抗及糖尿病重要的联结点。抵抗素可使糖耐量及胰岛素的作 用受损。抵抗素可使胰岛素诱导的3T3 — Ll脂肪细胞对葡萄糖的摄取减少，用抵抗素抗体 封闭后葡萄糖的摄取又增加。在遗传性肥胖和饮食诱导的肥胖小鼠，血清抵抗素水平显著 增加。抵抗素抗体可使饮食诱导的肥胖小鼠血糖下降，胰岛素的敏感性恢复。这些研究都 显示脂肪细胞所分泌的抵抗素可对抗胰岛素的作用，导致全身多器官的胰岛素抵抗。抗糖 尿病药物罗格列酮可显著下调抵抗素mRNA的表达，而下调抵抗素的表达是TZD类药物发挥 抗糖尿病效应的重要机制。抵抗素还可降低葡萄搪转运体的内在活性，而升高血浆葡萄糖 浓度。总之，抵抗素的研究刚刚展开，许多机制没有完全清楚，但目前的研究结论能确定抵 抗素参与了 II型糖尿病胰岛素抵抗状态的形成。
c.脂联素 脂联素(adiponectin)是脂肪细胞分泌的一种激素蛋白。脂联素能特异性与血管 内膜的I、 III和V型胶原结合，当血管内皮功能受损时，循环中的脂联素会沉积于血管壁 上。TZD类药物可以促进脂肪细胞脂联素基因的表达和蛋白的分泌。研究发现在II型糖尿 病的发病过程中，低脂联素血症与胰岛素抵抗及高胰岛素血症有显著的相关性。血浆脂联 素浓度低的肥胖猴，胰岛素剌激下的外周葡萄糖的摄取明显减弱。脂联素基因敲除小鼠证 明，因脂联素的缺乏，肌肉中脂肪酸转运蛋白mRNA水平降低，从而导致严重的胰岛素抵抗。 脂联素可促进脂肪酸氧化酶、解偶联蛋白的表达，从而改善胰岛素抵抗。Yamauchi等的研究 表明生理剂量的脂联素能促进肝及肌细胞脂肪酸的燃烧与能耗，从而降低细胞内TG水平， 改善肥胖鼠及II型糖尿病病人的高脂血症及胰岛素抵抗。 脂联素具有抗动脉粥样硬化和抗炎的作用，它可以抑制血管内皮细胞粘附因子的 表达和减少巨噬细胞分泌的细胞因子数量。脂联素可通过抑制内皮细胞粘附分子VCAM-1， ICAM-1的表达来抑制炎性因子激活。脂联素可与内皮细胞结合，抑制TNF-a介导的单核细 胞粘附分子的表达。此外，在代谢综合症患者中，脂联素的血浆水平明显低下，表明脂联素 的分泌失调与这些疾病的发生都有密切的关系，显示脂联素在脂和糖的代谢方面有其重要 的功能。 总之，脂联素具有调节脂代谢，提高胰岛素敏感性，作用血管内皮细胞从而抗动脉 粥样硬化和抗炎的作用。 本发明以细胞组装技术和干细胞技术建立药物筛选模型，具有以下主要优点
基于物理交联，化学交联和生物学交联的的分步交联工艺，相比物理和化学交联 技术，生物交联技术稳定可靠，既可以控制其固化又可以控制降解。根据这一技术完成适合 体外生理系统模型构建的细胞_成形材料的选择和配比、材料后处理工艺、系统组装流程 设计。 建立了以脂肪细胞，内皮细胞和胰岛为主的体外能量代谢系统建模框架。设计了用以指导构建能量代谢系统模型的三维分级结构模型。应用细胞组装技术，完成了设计结 构的组装。研究表明模型比平面培养的脂肪细胞、胰岛细胞、内皮细胞能更好的仿真体内的 生理病理情况。 基于脂肪干细胞起源和分化的基本理论，实验设计了定向分化脂肪干细胞的方 法。研究表明，通过采用分步控制和精确诱导的方法，可以将组装体中结构材料内部的细 胞分化为脂肪细胞，结构通道表面的细胞分化为内皮细胞，而分化出的内皮细胞在通道表 面自组装成内皮层样的结构。 从糖脂代谢的生理意义和在能量代谢过程中的重要性出发，选择了葡萄糖消耗， 脂肪酸动员和脂肪合成作为糖脂代谢标志物，并建立相应的检测方法。组装的能量代谢系 统模型比2D培养系统和缺乏胰岛的3D系统糖脂代谢更接近体内真实情况，长时间高浓度 葡萄糖诱导下更容易产生糖尿病的病理状态，罗格列酮的药理作用更为显著。
依据脂肪-胰岛内分泌轴理论，选择了胰岛分泌的胰岛素生理生化标志。脂肪-胰 岛内分泌轴的主要调控因子分泌变化非常接近体内的真实情况。长时间高浓度葡萄糖诱 导下产生的糖尿病病理状态也更为接近体内真实情况，模型结构中的脂肪细胞能够影响P 细胞的胰岛素分泌动力学。药物罗格列酮和那格列奈的药理作用更为显著和符合体内用药 情况。 本模型和建立模型的技术，在药物研究领域有广泛的应用前景，将使体外药物实 验更系统、准确接近体内实验，可弥补高通量筛选技术低成功率的缺陷，降低药物开发成本 和风险，推动21世纪威胁人类健康的主要疾病之一糖尿病的发病机制和药物治疗研究。


图1不同条件下的葡萄糖摄取实验。其中2D:2D培养系统；3D:3D培系统；
3D+I3 -cell :组装了胰岛的3D培养系统。Normal :正常培养；HG :高浓度葡萄糖(15mM)培
养7d ;HG+R0S :第11天加罗格列酮(3 ii g/mL) 。 Data are mean士s. d. ， n = 6. 图2不同条件下的游离脂肪酸释放实验。其中2D :2D培养系统；3D :3D培系统；
3D+P-ce11 :组装了胰岛的3D培养系统。Normal :正常培养；HG :高浓度葡萄糖(15mM)培
养7d ;HG+R0S :第11天加罗格列酮(3 ii g/mL) 。 Data are mean士s. d. ， n = 6. 图3自由胰岛的胰岛素分泌动力学。其中Normal ;正常培养组；HG :高浓度葡萄糖
(15mM)培养5d ;HG+R0S :高糖培养第11天加罗格列酮(3 y g/mL) ;HG+NATE :高糖培养第11
天力口那格列奈(5ug/ml) 。 Data are mean士s. d. ， n = 3. 图4组装胰岛的胰岛素分泌动力学。其中Normal ;正常培养组；HG :高浓度葡萄糖 (15mM)培养5d ;HG+R0S :高糖培养第11天加罗格列酮(3 y g/mL) ;HG+NATE :高糖培养第11 天力口那格列奈(5ug/ml) 。 Data are mean士s. d. ， n = 3. 图5为糖尿病病理模型下脂肪细胞瘦素分泌。其中2D :2D培养系统；3D :3D培系 统；3D+P -cell :组装了胰岛的3D培养系统。Normal :正常培养；HG :高浓度葡萄糖(15mM) 培养5d ;HG+R0S :第12天加罗格列酮(3 ii g/mL) 。 Data are mean士s. d. ， n = 6.
图6为糖尿病病理模型下脂肪细胞抵抗素分泌。其中2D :2D培养系统；3D :3D培系 统；3D+P -cell :组装了胰岛的3D培养系统。Normal :正常培养；HG :高浓度葡萄糖(15mM) 培养5d ;HG+R0S :第12天加罗格列酮(3 ii g/mL) 。 Data are mean士s. d. ， n = 6.
图7为糖尿病病理模型下脂肪细胞脂联素分泌。其中2D :2D培养系统；3D :3D培系 统；3D+P -cell :组装了胰岛的3D培养系统。Normal :正常培养；HG :高浓度葡萄糖(15mM) 培养5d ;HG+R0S :第12天加罗格列酮(3 ii g/mL) 。 Data are mean士s. d. ， n = 6.
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明，本发明的保护范围并不局限于实 施例，凡是根据本发明公开的内容或原理实施的任何本领域的等同替换，均属于本发明的 保护范围。 实施例l种子细胞培养 选择来源于大鼠的脂肪干细胞作为构成系统基础的种子细胞，脂肪干细胞为多能 干细胞，能向脂肪细胞、成骨细胞、肌肉细胞等定向分化。 (1)大鼠(100-150g)腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，用70X乙醇浸泡10min，无菌取 腹部皮下脂肪组织，迅速放入无菌的烧杯内，转移入超净台； (2)上述操作完成后，在超净台内，用止血钳剔除脂肪组织上的结缔组织和血块， 用D-Hank， s溶液((Ca2+， Mg2+-free Hank， s， pH7. 4) :8. 175g NaCl，O. 403g KCl，O. 114g 化2鹏4，溶于950mL重蒸水，力口 HEPES (4_(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfoni c acid，4-羟乙基哌嗪乙磺酸)调pH值，定容至1L)清洗三遍，转入新的烧杯中，将脂肪组 织剪成直径2X2mm的小快，加入D-Hank' s溶液，转移到离心管中，1500rpm离心10分钟；
(3)轻轻吸取上层漂浮的脂肪组织到烧杯中，然后加入2mL的0. 1%胶原酶(II 型)溶液，37t:消化45min，用250_mm的尼龙滤网过滤消化液，过滤后的液体转移到离心管 中，1000rpm离心10分钟； (4)吸去上层成熟的脂肪细胞，沉积的细胞用D-Hank' s溶液再次配成细胞悬液， 用25-mm的尼龙滤网再次过滤，滤液1000rpm离心10分钟； (5)去除上清，加入含15% FCS(胎牛血清)的DMEM(Sigma)培养基，吹打散开所有 细胞团，记数，调整细胞浓度到1.5 3Xl()Scells/mL，接种于25ci^培养瓶中(预先用O. 2% 明胶浸泡处理过)；培养于37t:二氧化碳恒温培养箱中； (6)培养箱内孵育12小时后，轻轻晃动培养瓶，使未粘附的物质(组织和细胞碎 片)悬浮起来，倾倒掉培养液，PBS轻轻洗涤一次，加入新的含15% FCS的DMEM培养基继续 培养。 (7) —般三天左右，细胞达到单层汇合，细胞汇后，进行常规传代培养； (8)传代吸去培养液，加入0. 2%的胰酶溶液lmL，迅速洗涤瓶壁后吸去，再加入
0. 2%的胰酶溶液lmL，37t:孵育约5min，显微镜观测，待80%的细胞变圆后，轻轻吸去胰酶
溶液，迅速加入含15% FCS的DMEM培养基终止消化；吹打培养瓶壁，再次配成细胞悬液；调
整细胞浓度到1. 5 3X105cells/mL，接种于新培养瓶中。 (9)细胞可以正常传代培养，每三天传代一次。 实施例2大鼠胰岛的分离和培养 (l)SD大鼠，戊巴比妥纳(30mg/kg)肌肉注射麻醉。消毒，剖腹，显露胰腺及胆总
管，在近十二指肠的胆总管远端、胆总管近肝门处经后面各穿一缝线，暂不结扎。 (2)于胆总管中段向远侧顺行插人4. 5号针头(已连接装有预温消化分离液的注射器)，结扎胆总管近肝门处缝线，向胆总管内推注少量消化分离液，使胆总管内的胆汁排 人十二指肠腔，之后结扎胆总管远端缝线，将预温的5%胶原酶溶液10-15ml缓慢逆行注人 胰管内，使胰腺充分膨胀。 (3)迅速完整摘取胰腺，移人50ml锥形瓶中(其内装有预温的上述消化分离液 6-10ml)，并置于38。C水浴中轻轻摇动(25-30)min，20目不锈钢网过筛，加入冰冷的Hanks 液(含10%新生牛血清，NCS)，终止消化。 (4) 4°C ， 1000r/min离心3min，弃上清，同法洗2次。未消化胰腺组织继续上述步 骤，直至组织完全消化。沉淀物用Ficoll 400密度梯度离心法分离，依次加人Hank液配制 的浓度分别为25%，23%，20%和11% Ficoll液。 (5)4°C， 1000r/min离心20min，在(23-20) %和(20% -11% )界面收集胰岛，经 Hanks液洗3次，加入新的含10% FCS的DMEM培养基培养备用。
实施例3多细胞系统模型构建过程 (1)明胶，海藻酸钠，纤维蛋白原和细胞共混材料制备将明胶溶于PBS缓冲液中， 形成20%的溶液，将海藻酸钠溶解于PBS缓冲液中，形成5%溶液，分别用NaOH中和残余醋 酸，调节pH值到7. 1，7(TC烘箱中间歇式灭菌。无菌条件下将纤维蛋白原溶解于DMEM培养 液中，形成5%的溶液。临用时将三种材料以l : 1 : l均匀共混。将材料和培养的脂肪干 细胞混合，得到浓度约为1 X 107mL脂肪干细胞-复合材料共混材料。 (2)能量代谢系统的组装由系统基础组装和胰岛组装两步构成。将脂肪干细胞/
复合材料共混材料注入lmL的一次性注射器，置于4。C冰箱预冷30分钟以上； (3)选用殷华公司的Cell Assembly II设备，在在成形室内固定已灭菌的成形底
板，打开成形室温控开关使成形室降温，实时监测温度，待温度降低到6°C时，安装注射器及
固定喷头； (4)由Solidworks设计的3D模型及选定的成形参数直接驱动组装成形，系统三级 结构的CAD模型设计为10mmX 10mmX 3mm立方体结构，次级结构特征尺寸为300mm，传输特 征尺寸为350mm，行列数n = 15。根据次级结构特征尺寸及材料对应不同尺寸喷头膨胀率， 选用型号6#的喷头。扫描速度30mm/s，挤出流量1. 2mmVs。 (5)成形完成后得到具有82%孔隙率的含有细胞的三维结构体。将结构体储存于 无菌4t:的环境内，1小时内进行成形后处理。 (6)将组装好的结构体浸入到5%灭菌氯化钙溶液交联1分钟，用DMEM洗涤三次， 然后用100U/mL纤维蛋白酶交联10min ; (7)从成形底板切割结构体，转移到培养皿中，加含有10 % FCS，liimol/L insulin, 50ng/mL EGF-land 50U/mL即rotinin的DMEM培养液，37°C ， 5% C02环境下培养 3d。 (8)培养3天后，培养液转换为含有10 % FCS，liiM insulin, lyM dexamethasone， 0. 5mmol/L， isobutyl_methylxanthine (IBMX ;Sigma) ， 50u/mL aprotinin的 DMEM培养液，37°C ， 5% C02环境下培养3d。 (9)在第6天，用注射器(4#针头)吸取培养的结构完整的10个胰岛细胞，定位组 装在结构体内。隔日换液，收集培养上清液O. 5mL放入试管封存，_201:冰箱冻存待测。
对照实验组装完毕后，培养皿中的多细胞系统，先加含有10% FCS，liiMinsulin, IliM dex咖ethasone， 0. 5mmol/L， isobutyl—methylxanthine (IBMX ;Sigma)，50u,
mL即rotinin的DMEM培养液，37°C ， 5% C02环境下培养3d。培养3天后，培养液转换为含 有10% FCS DMEM， 10% FCS， 1 ii mol/L insulin, EGF and 50U/mL即rotinin的DMEM培养 液，371:，5% C02环境下培养3d。在第6天，用注射器(4#针头)吸取培养的结构完整的 IO个胰岛细胞，定位组装在结构体内，隔日换液。 在荧光显微镜下观察经不同处理步骤培养的细胞组装体，CD31染色和油红0双 染。对于先用EGF培养诱导过的细胞组装体，材料内部的脂肪干细胞分化为脂肪细胞(红 色)，而通道表面只有少数细胞分化为脂肪干细胞。对于未先用EGF诱导培养的细胞组装 体，可见通道表面的细胞也大量分化为脂肪细胞。这一结果显示，在我们设计的分化条件诱 导控制下，先用EGF诱导能导致通道表面的脂肪干细胞先分化为内皮细胞，这些终末分化 的细胞将失去分化为脂肪细胞的能力，导致接着用地塞米松、IBMX诱导培养，只有材料内部 的脂肪干细胞能分化为成熟的脂肪细胞。相反的，如果先用地塞米松、IBMX诱导，将会导致 通道表面的脂肪干细胞先分化为成熟的脂肪细胞，失去分化为内皮细胞的能力。这一结果 证明，可以通过控制诱导分化条件的方法，精确控制结构体中不同位置脂肪干细胞的分化， 通道表面的脂肪干细胞分化为内皮细胞，并在通道表面自组装成内皮样结构，构成选择性 透过内分泌因子的生物屏障，基质材料内部的脂肪干细胞则分化为脂肪细胞，形成类似于 体内脂肪细胞位置结构的生理系统仿真模型。
实施例4糖尿病病理模型下的葡萄糖消耗检测 (1)组装完成后的多细胞系统，用含10%FCS，normal glucose (5mM)的DMEM培养 液，37°〇，5% (A环境下培养7d，隔日换液； (2)同时采用高浓度葡萄糖(15mM)培养，诱导产生糖尿病的病理状态； (3)在第12天换液，371:，5% C02环境下培养24小时后，收集培养上清液0. 5mL
放入试管封存，_201:冰箱冻存待测； (4)在第13天，收集之前的培养液后，将培养液换成含10% FCS，25mM葡萄糖的 DMEM培养液，37°C ， 5% C02环境下培养24小时； (5)在第14天，收集培养上清液0. 5mL放入试管封存，-20°〇冰箱冻存待测； (6)无胰岛多细胞系统和平面培养对照组(脂肪干细胞5乂104接种于24孔板中，
采用相同的方式诱导分化，作为2D培养系统对照)，进行相同的处理； (7)收集的上清液体中的葡萄糖浓度用葡萄糖检测试剂盒监测； (8)葡萄糖消耗，用未与细胞共培养过的DMEM中葡萄糖浓度(M)，减去培养上清液
中葡萄糖的浓度(N)表示； (9)葡萄糖消耗率。=[M(13d)-N(13d)]/[M(12d)-N(12d)] (10)未组装胰岛的多细胞系统和2D培养系统，采用相同的方法检测葡萄糖消耗；
(11)阳性对照药物罗格列酮(3iig/mL)在培养的第ll天加入到high glucose (15mM)的DMEM培养液中。 由实验结果(图1)可见，在15mM的葡萄糖剌激下，相比于平面培养体系，3D组装 结构中脂肪细胞的葡萄糖消耗明显增加，这一结果显示3D组装结构中的脂肪细胞，由于培 养环境更接近于真实体内情况，更具有活力。在同是3D培养环境下，组装胰岛的3D系统的 葡萄糖消耗是没有组装胰岛的系统的3倍。这是由于组装的胰岛可以对高糖剌激应答，分泌大量胰岛素，而胰岛素可以剌激脂肪细胞摄取葡萄糖合成脂肪。 在用15mM葡萄糖培养液诱导培养7天后，三个培养系统的脂肪细胞葡萄糖消耗都 有下降，但组装胰岛的3D系统葡萄糖消耗下降最为显著。这是由于长时间的高浓度葡萄糖 培养能同时诱导，脂肪细胞产生胰岛素抵抗、胰岛P细胞对葡萄糖应答敏感性下降，两种 效应的叠加，导致高浓度葡萄糖剌激的葡萄糖消耗明显下降，这一点是符合体内真实情况 的。因此证明组装胰岛的3D系统更容易诱导产生显著的病理变化，适合病理建模。对于高 浓度葡萄糖长时间培养诱发的葡萄糖消耗下降的病理情况下，罗格列酮(噻唑烷二酮类降 糖药)对于诱发的病理改变的治疗作用，组装的能量代谢系统比2D培养系统和缺乏胰岛的 3D组装系统更为显著。这一结果充分证明了，组装的能量代谢系统在筛选治疗糖尿病药物 的潜力。同时这些实验也提示这一病理模型可以用于糖尿病治疗的其他未知药物的活性筛 选。在培养系统中加入待测药物，检测病理模型在正常和病理条件下的葡萄糖消耗水平，即 可分析待测药物对诱发的病理改变的治疗作用，从而可以筛选出具有治疗糖尿病疾病潜在 药物。 实施例5糖尿病病理模型下的脂肪动员检测 (1)组装完成后的多细胞系统，用含10% FCS，normal glucose(5mM)的DMEM培养 液，37°〇，5% (A环境下培养7d，隔日换液； (2)同时采用高浓度葡萄糖(15mM)培养，诱导产生糖尿病的病理状态； (3)在第15天，先将培养液换成含10% FCS，2% fatty acid free BSA的DMEM
培养液，37°C ， 5% C02环境下培养4小时 (4)收集培养上清液0. 5mL放入试管封存，_201:冰箱冻存待测 (5)然后将培养液换成含10 % FCS，2 % fatty acid free BSA和
lOiiMisoproterenol DMEM培养液，37°C ， 5% C02环境下培养4小时 (6)收集培养上清液0. 5mL放入试管封存，_201:冰箱冻存待测 (7)无胰岛多细胞系统和平面培养对照组，进行相同的处理； (8)上清液体中的FFA浓度用脂肪酸检测试剂盒检测； (9) FFA释放率，用加isoproterenol剌激情况下的FFA与不加isoproterenol剌 激的FFA浓度比来表示。 (10)未组装胰岛的多细胞系统和2D培养系统，采用相同的方法检测FFA释放消 耗； (11)阳性对照药物罗格列酮(3ii g/mL)在培养的第11天加入DMEM培养液中。
由实验结果(图2)可见，在去甲肾上腺素剌激下，相比于平面培养系统，3D培养系 统中脂肪细胞的FFA释放明显增加，这一结果显示3D培养体系中的脂肪细胞对去甲肾上腺 素剌激的脂肪动员更敏感，更具有活力。而在同是3D培养环境下，组装胰岛的3D培养系统 的FFA释放显著升高。这是由于胰岛素可以抑制脂肪细胞FFA释放，组装的胰岛可对去甲 肾上腺素剌激应答，抑制胰岛素分泌，导致对脂肪细胞FFA释放的抑制效应削弱，这一效应 与去甲肾上腺素直接剌激脂肪细胞FFA释放的效应叠加，从而导致FFA分泌增加。
在用15mM葡萄糖培养液，诱导培养7天后，三个培养系统的脂肪细胞FFA释放都 有增加，3D系统脂肪细胞的FFA释放要高于2D系统，而组装胰岛的3D系统的FFA释放增加 最显著。这是由于长时间的高浓度葡萄糖培养，能同时诱导脂肪干细胞大量分化为脂肪细胞，而脂肪细胞会合成大量脂肪储存，导致去甲肾上腺素剌激情况下游离FFA释放增加。而3D系统的脂肪干细胞分化和脂肪合成要比2D系统更强烈，存储更多的脂肪，所以游离FFA释放也高。这一结果证明3D系统的脂肪细胞更容易诱导产生显著的病理变化，适合病理建模。对于高浓度葡萄糖长时间培养诱发的游离FFA释放增加，罗格列酮只在组装胰岛的3D系统上，显示出明显的药理作用。该模型可以检测出罗格列酮的抑制FFA释放的药理作用，这和在人体观测到的结果是一致的，证明了该模型对筛选该类药物的有效性。
实施例6糖尿病病理模型下的胰岛素分泌动力学检测 (1)组装完成后的多细胞系统，用含10% FCS，normal glucose(5mM)的DMEM培养液，371:，5% C02环境下培养5天，隔日换液； (2)同时采用高浓度葡萄糖(15mM)培养，诱导产生糖尿病的病理状态； (3)接种在平面培养基上的胰岛(将胰岛(10个/组)接种于明胶基培养皿种，脂
肪干细胞5X1(^接种于24孔板中，采用相同的方式诱导分化，作为2D培养系统对照)用
相同的步骤处理； (4)5天后，将多细胞系统转移到lmL的流动小室中，用蠕动泵以O. 2mL/min的流量灌注含2mM葡萄糖的DMEM培养液； (5)在37°〇，5% C02环境下培养灌注一小时，收集流出的灌注液，放入试管封
存，_201:冰箱冻存待测，作为胰岛素分泌的基础水平； (6)灌注一小时后，将灌注液换为含15mM葡萄糖的DMEM培养液； (7)前20min每隔2min取样一次，放入试管封存，_201:冰箱冻存待测； (8) 20min后，将灌注液换为含2mM葡萄糖的DMEM培养液； (9) 15min内每隔5min取样一次，放入试管封存，_201:冰箱冻存待测； (10)收集的灌流液中胰岛素浓度用免疫荧光胰岛素检测试剂盒监测； (11)未组装的胰岛采用相同的方法检测胰岛素分泌； (12)阳性对照药物罗格列酮(3 ii g/mL)和那格列奈(nateglinide) (5ug/ml)在培养的第11天加入到高糖(15mM)的DMEM培养液中。 胰岛素分泌的动力学过程对能量代谢调控具有重要意义，胰岛素分泌的不足，胰岛素分泌峰的延迟等等动力学变化是糖尿病的重要病理机制。为了测试组装在能量代谢系统模型中的胰岛细胞是否能够模仿在体内的分泌功能，我们用灌注系统做了时间依赖的葡萄糖剌激胰岛素释放实验(图3，图4)，显示了自由或组装的胰岛在葡萄糖剌激下胰岛素的分泌模式。在15M葡萄糖剌激下，组装的胰岛细胞胰岛素分泌比平面培养的胰岛细胞明显增加。证明组装的胰岛细胞比平面培养的胰岛细胞保持有更高的活性。
为了测试是否长时间暴露在高浓度葡萄糖中会引起胰岛细胞病理改变，进而影响胰岛素分泌，我们将平面培养和组装的胰岛细胞培养在15mM的葡萄糖中。5天后，研究结果显示两种培养方式的胰岛细胞在15mM葡萄糖剌激下的胰岛素分泌都剧烈的下降，但组装的胰岛细胞胰岛素分泌下降率要比平面培养的高。那格列奈能够增加两种培养方式胰岛细胞的受高糖抑制胰岛素分泌下降，但罗格列酮只增加了组装的胰岛细胞受高糖抑制的胰岛素分泌。 值得注意的是，在用15mM高糖长时间培养后，组装的胰岛细胞葡萄糖诱导的胰岛素分泌峰相比于正常情况下延迟2min，那格列奈(促胰岛素分泌类降糖药)可以修正这一诱导的胰岛素分泌峰延迟，这和在人体的实验是一致的。然而，这一现象在平面培养的胰岛细胞上没有观测到。胰岛素分泌动力学的紊乱是糖尿病主要的特征。这些结果提示，3D结构中的脂肪细胞有助于胰岛细胞获取更多的糖尿病病理特征。随后进一步的对脂肪激素分泌的研究将显示这一现象的机制。那格列奈的作用机理为与胰岛素P细胞上磺酰脲受体结合，抑制ATP敏感钾通道开放，导致细胞膜去极化，促使电压依赖性钙通道开放，引起胞浆内钙浓度升高，从而促进胰岛素释放。那格列奈可迅速而短暂地剌激糖尿病患者的胰岛素释放，提高胰岛P细胞反应性，促进胰岛素分泌峰的提前。我们的模型不但再现了病理条件下胰岛素分泌的紊乱，还检测出了那格列奈对胰岛素分泌紊乱的药理作用，证明了该模型对筛选该类药物的有效性。同时模型也检测出罗格列酮的对胰岛素分泌的紊乱药理作用，进一步证明了该模型对筛选噻唑烷二酮类和促胰岛素分泌类药物的有效性。
实施例7糖尿病病理模型下的脂肪细胞激素检测 (1)组装完成后的多细胞系统，用含10% FCS，5mM葡萄糖的DMEM培养液，37t:，5% C02环境下培养，隔日换液； (2)同时采用高浓度葡萄糖(15mM)培养，诱导产生糖尿病的病理状态；
(3)接种在平面培养基上的脂肪细胞用相同的步骤处理； (4)在第18天换液，37t:，5XC02环境下培养3天后，收集培养上清液lmL放入试管封存，_201:冰箱冻存待测； (5)样本中L印tin， resistin禾口 adiponectin的浓度分别用l印tin ELISA检领lji式剂盒(RB，USA)，rat resistin ELISA检测试剂盒(TPI，USA)and ratadiponectin ELISA检测试剂盒检测，按照检测试剂盒的说明书操作； (6)在第21天，收集完培养上清液后，收集留下的组装结构体和无细胞的组装结构体，分散并用0. 14mg木瓜蛋白酶6(TC消化20小时； (7)Hoechst 33258 (Sigma)染料染色后，荧光检测，用小牛胸腺1型DNA作为检测标准品； (8)不含细胞的结构体测得的值从样本检测得到的值中减去； (9)脂肪激素分泌的值用ELLSA检测得到激素浓度与测得的DNA含量的比值来表
示； (10)未组装胰岛的多细胞系统和2D培养系统，采用相同的方法检测L印tin，resistin禾口 adiponectin的分泌； (11)阳性对照药物罗格列酮(3iig/mL)在培养的第12天加入DMEM培养液中。
实验结果显示(图5)，相比于平面培养体系，3D培养体系中脂肪细胞的瘦素分泌明显增加，证明3D培养体系中的脂肪细胞由于培养环境更接近于真实体内情况，分泌瘦素的活力更高。在同样的3D培养环境下，组装了胰岛的3D培养系统的瘦素分泌比没有组装胰岛的系统低。在用15mM葡萄糖培养液，诱导培养12天后，三个培养系统的瘦素表达都显著增加。这是由于长时间的高浓度葡萄糖培养，能同时诱导大量脂肪干细胞分化为脂肪细胞，脂肪细胞集聚大量的脂肪，从而导致瘦素的分泌增加。对于高浓度葡萄糖长时间培养诱发的瘦素分泌增加，罗格列酮在组装胰岛和未组装胰岛的3D系统上，都显示出比较显著的药理作用，其中对组装胰岛的3D系统的药理作用最大，这和真实人体的情况是一致的。这一实验结果，证明该模型可检测出罗格列酮的药理作用，证明该模型可从改善瘦素分泌的
1角度筛选该类药物。 抵抗素被认为是联系肥胖与胰岛素抵抗及糖尿病重要的联结点。脂肪干细胞分化为成熟的脂肪细胞及脂肪细胞肥大的过程中，抵抗素mRNA的水平显著增加，营养和激素都可以调控抵抗素的表达。抵抗素可使糖耐量及胰岛素的作用受损，抗糖尿病药物罗格列酮可显著下调抵抗素mRNA的表达，而下调抵抗素的表达是TZD类药物发挥抗糖尿病效应的重要机制。实验结果显示(图6)，相比于平面培养体系，3D培养体系中脂肪细胞的瘦素分泌略有增加，显示3D培养体系中的脂肪细胞。在同样的3D培养环境下，组装了胰岛的3D培养系统的抵抗素分泌与没有组装胰岛的系统无显著的差异。 在用15mM葡萄糖培养液，诱导培养12天后，三个培养系统的抵抗素表达都显著增加。这是因为长时间的高浓度葡萄糖培养，诱导大量脂肪干细胞分化为脂肪细胞，脂肪细胞集聚大量的脂肪而肥大，从而导致抵抗素的分泌增加。在三个培养系统中，在高糖的诱导下，组装了胰岛的3D培养系统的抵抗素分泌增加最小，胰岛的存在使系统呈现一种更加稳定的状态，这更接近于体内观测到的情况。对于高浓度葡萄糖长时间培养诱发的抵抗素分泌增加，罗格列酮在平面培养系统、组装胰岛和未组装胰岛的3D系统上，都显示出比较显著的药理作用，其中对组装胰岛的3D系统的药理作用最明显。这一实验结果，证明该模型可从抑制病理情况下抵抗素分泌的角度筛选该类药物。 脂联素具有调节脂代谢，提高胰岛素敏感性，改善代谢综合症患者高脂血症及胰岛素抵抗，抑制血管内皮细胞粘附因子的表达和减少巨噬细胞分泌的细胞因子数量，保护内皮功能，抗动脉粥样硬化和抗炎的作用。实验结果显示(图7)，相比于平面培养体系，3D培养体系中脂肪细胞的脂联素分泌水平显著增加，显示3D培养体系中的脂肪细胞，培养环境更接近于真实体内情况，更具分泌脂联素的活力。在同样的3D培养环境下，组装了胰岛的3D培养系统的脂联素分泌与没有组装胰岛的系统无显著的差异。 在用15mM葡萄糖培养液，诱导培养12天后，三个培养系统的脂联素表达都显著减低。在三个培养系统中，在高糖的诱导下，组装了胰岛的3D培养系统的抵抗素分泌减少量最小，胰岛的存在使系统的脂联素分泌水平呈现一种更加稳定的状态，这是接近于体内观测到的情况的。对于高浓度葡萄糖长时间培养诱发的脂联素分泌降低，罗格列酮在平面培养系统和未组装胰岛的3D系统上，都没有显示出明显的药理作用，但对组装胰岛的3D系统的药理作用显著，脂联素的分泌水平恢复到和正常情况下分泌水平无显著差异，这一结果和真实糖尿病患者使用罗格列酮所观测得到的情况是一致的，证明该模型可从脂联素分泌的角度筛选该类药物。
权利要求
一种糖尿病治疗药物的筛选方法，包括以下步骤(1)将脂肪干细胞和基质材料组装形成具有一定孔隙率的含有细胞的三维结构体；(2)通过控制诱导分化条件，使三维结构体内通道表面的脂肪干细胞分化为内皮细胞，并在通道表面自组装成内皮样结构，基质材料内部的脂肪干细胞则分化为脂肪细胞；(3)将从动物体内分离的胰岛直接组装在三维结构体的空隙中；(4)对上述的三维结构体给予高浓度的葡萄糖、脂肪酸、胰岛素、TNF或脂肪细胞分泌因子等刺激物，诱导脂肪细胞、胰岛细胞和内皮细胞产生糖尿病病理症状；(5)在上述培养系统中加入待测药物，检测模型在正常和病理条件下的相关标记物水平，分析待测药物的药理活性进行药物筛选。
2. 根据权利要求1所述的药物筛选方法，其特征在于所述方法中脂肪干细胞的数量 为106-108个/lml基质材料，胰岛细胞数量为5-50个。
3. 根据权利要求l所述的药物筛选方法，其特征在于所述方法的步骤(1)中，用于基 质细胞三维受控组装的专用实验系统主要包括专用数据处理软件，基于四轴运动控制卡和 步进电机驱动的三维成形平台，材料输运子系统，独立温控的成形室和分体式设计的成形 底板。
4. 根据权利要求l所述的药物筛选方法，其特征在于所述方法的步骤(1)中，所述的 基质材料为明胶、海藻酸钠和纤维蛋白原的组合物，其中明胶、海藻酸钠和纤维蛋白原的配比为i : o. 2-i : o. 2-i。
5. 根据权利要求l所述的药物筛选方法，其特征在于所述方法的步骤(2)中，所述的 控制诱导分化条件为先用内皮生长因子诱导，使三维结构体通道表面的脂肪干细胞先分化为内皮细胞，这些终末分化的细胞将失去分化为脂肪细胞的能力；接着用地塞米松、异丁基 甲基黄嘌呤诱导培养，使基质材料内部的脂肪干细胞分化为成熟的脂肪细胞。
6. 根据权利要求l所述的药物筛选方法，其特征在于所述的三维结构体具有10-30um 直径孔隙的微孔结构。
7. 根据权利要求1所述的药物筛选方法，其特征在于所述方法为采用10-25mM葡萄 糖培养液培养5-10天后，诱导产生糖尿病病理模型。
8. 根据权利要求l所述的药物方法，其特征在于所述方法为采用30-80ng/mL TNF-a 培养液培养5-10天后，诱导产生糖尿病病理模型。
9. 根据权利要求1所述的药物方法，其特征在于所述方法为采用6-20 ii Minsulin培 养液培养5-10天后，诱导产生糖尿病病理模型。
10. 根据权利要求1所述的药物方法，其特征在于所述的检测标记物为葡萄糖、游离 脂肪酸、胰岛素、瘦素、抵抗素、脂联素等。
全文摘要
本发明涉及一种基于细胞组装技术的糖尿病病理模型及其在高内涵药物筛选中的应用。通过将脂肪干细胞和仿细胞外基质材料组装形成具有一定孔隙率的含有细胞的三维结构体；通过控制诱导分化条件，使三维结构体内通道表面的脂肪干细胞分化为内皮细胞，基质材料内部的脂肪干细胞则分化为脂肪细胞；将从动物体内分离的胰岛直接组装在三维结构体的空隙中。对上述的系统模型给予高浓度的葡萄糖、脂肪酸胰岛素、TNF或脂肪细胞分泌因子等长时间刺激，诱导产糖尿病病理症状。在培养系统中加入待测药物，检测模型在正常和病理条件下的相关标记物水平，可以分析待测药物的药理活性，从而进行药物的高内涵筛选。
文档编号C12Q1/02GK101775431SQ20091015575
公开日2010年7月14日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年12月25日
发明者徐铭恩, 葛亚坤 申请人:杭州电子科技大学