专利名称：耐酪氨酸冢村氏菌及其催化制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的制作方法
技术领域：
本发明属于生物催化技术领域，涉及一株新的菌种一耐酪氨酸冢村氏 菌(Tsukamurella tyrosinosolvens)E105，及其在手性生物催化制备(S)-a -乙 基-2-氧-1-吡咯烷乙酸中的应用。
(二)
背景技术：
(S) _ a _乙基_2-氧-1-吡咯烷乙酸的化学结构式为
(S) - a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸是合成左乙拉西坦(levetiracetam， LEV,商 品名K印pra⑧)的重要手性中间体。左乙拉西坦的化学名为(S)-a-乙基-2-氧-l-吡 咯烷乙酰胺，是比利时联合化学公司(UCB)研发的具有吡咯烷酮结构的促智药。它对东莨 菪碱引起的记忆缺损的活性高，同时具有抗惊厥和抗癫痫作用，其s-异构体(左乙拉西坦) 有生物活性，而R-异构体没有活性。该药与中枢神经系统的脑细胞膜呈立体选择性、饱和、 可逆性的结合。与同类药物相比，其治疗指数大，有效量和中毒量相差远，长期用药无耐药 性或停药综合症出现。美国FDA于1999年12月正式批准用于16岁以上成人部分性癫痫 发作的添加治疗。研究发现，LEV作为部分性癫痫发作的儿童患者辅助治疗不仅安全、且能 有效减少癫痫发作频度，不仅证实了 LEV作为辅助治疗可有效控制儿童部分性癫痫发作， 且副作用相轻微，耐受性好，对于临床治疗儿童难治性癫痫有较大的参考价值。2005年6月 又将适应症扩大到4岁以上儿童。由于其独特的抗癫痫机制、较理想的药代动力学、高效安 全的临床效果，是目前报道的唯一具有预防癫痫发生的独特性能的抗癫痫药物，而且可用 于单独治疗，不与其他抗癫痫药物发生相互作用，成为最有前景的新型抗癫痫药之一，在欧 美广泛使用。2006年获准在我国上市，应用于临床。我国是左乙拉西坦原料药主要出口国 之一，市场前景十分广阔。 目前文献报道的左乙拉西坦的制备方法主要有化学拆分法和利用手性氨基酸作 为起始原料的合成方法。传统的化学拆分方法是将外消旋的乙拉西坦中间体(士)-a-乙 基_2-氧代-1-吡咯烷基乙酸与光学纯的拆分试剂(R)-(+)-a -苯基乙胺或者手性膦生 成盐，冷却结晶，再将其分离出相应的2个对映体。刘跃金等(左乙拉西坦及其衍生物的 合成.中国新药杂志，2007， 16(11) :860-864)利用(R) _ (+) _ a -苯基乙胺作为手性拆分试
剂禾口 Surtees J等(2_0xo_l_pyrroliding derivatives, process for preparing them
andtheir uses. WO :0164637A1， 2001-9-7)利用手性膦作为手性试剂进行拆分。传统的对 映体拆分过程的收率较低。
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徐宝财等((S)-a-乙基-2-氧代-l-吡咯烷基乙酰胺的合成工艺进展.精细 与专用化学品.2004，12(24) :15-17)和周先波等(抗癫痫治疗药物左乙拉西坦的合成研 究.精细化工中间体.2005，35(2) :27-28)分别由(S)-(-)- a-[2_(甲巯基)乙基]-2-氧 代-l-吡咯烷乙酰胺或者含甲巯基的氨基酸，采用去甲巯基还原试剂，如NaBH4/NiCl2 *6H20 或雷尼镍(Raney nickel)将甲巯基脱去，得到单一左旋体。但在还原反应中，含硫化合物容 易使催化剂中毒，因此活性雷尼镍的用量很大，通常为被还原化合物重量的7 10倍。由 于活性雷尼镍在干燥状态暴露于空气中易燃，因此，该工艺在工业化应用时存在一定的安 全隐患。该工艺起始原料是一种含硫手性氨基酸，原料成本较高，且容易产生重金属污染。 Ates C等(Oxopyrrolidinecompo皿ds， preparation of said compounds and their use in the ma皿facturingof levetircetam and analogues [P]. WO :03041080A2， 2003-2-20) 利用(S)-2-氨基丁酸为原料，通过酯化得到氨基酯，与4-溴丁酸乙酯分子发生分子间亲核 取代，在2-羟基吡啶存在下闭环合成，该方法同样存在原料试剂价格昂贵，损失大，产率低 的问题。
发明内容
本发明目的是提供一株可用于生物催化不对称水解外消旋体ci-乙 基-2-氧-1-吡咯烷乙酯制备光学纯的(S) _ a _乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的新菌种—— 耐酪氨酸冢村氏菌(Tsukamurella tyrosinosolvens)E105，以及该菌种在微生物法制备 (S) - a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸中的应用。
本发明采用的技术方案是 耐酪氨酸冢村氏菌(Tsukamurella tyrosinosolvens)E105，保藏于中国典型培养 物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏日期2009年12月16日，保藏 编号CCTCC NO :M 209306。 菌禾中来源耐酷氛酸冢村氏菌(Tsukamurella tyrosinosolvens)E105菌株系从 采自浙江省杭州祥符镇附近的土样中分离筛选获得。具体筛选方法如下将采集土样加 入至无菌生理盐水中摇匀，吸取0. 5mL 土壤悬液接种至装有50mL富集培养基的250mL摇 瓶中，3(TC，200rpm，培养4 5d，待培养液变混浊后，取lmL培养液转接至新鲜的富集培 养基中，继续培养4 5d，如此重复富集培养3 4次。富集培养基中以外消旋体a-乙 基-2-氧-1-吡咯烷乙酯为唯一碳源。具体配方如下外消旋体a _乙基-2-氧-1-吡咯 烷乙酯10mmol/L， (NH4) 2S042g/L， K2HP042g/L， KH2P04lg/L， NaCl 0. 5g/L， MgS04 7H20 0. 5g/ L， pH 7. 0。 随后富集培养液经梯度稀释，涂布到分离平板上，经多次分离后获得单菌落。平板 培养基配方为富集培养基中加入15g/L的琼脂。将挑取的单菌落接种种子培养基，培养24 小时，再转接至产酶培养基中培养48小时。采用手性气相色谱法检测目的产物(S)-a-乙 基-2-氧-l-妣咯烷乙酸的对应体过量值(e. e.值)，筛选得到所述的微生物菌株——耐酪 氛酸冢村氏菌(Tsukamurella tyrosinosolvens)E105。
该新菌种的特征如下 菌落形态3(TC培养36h，菌落呈不规则状，边缘呈裂叶状，扁平，白色，略发黄，干 燥，无光泽。菌体呈细杆状。
细胞形态细胞为直或较弯曲的杆菌[(O. 5 0. 8) iimX(1.0 5) iim]，可单个、 成对排列或聚集成丛。 生理生化特征从土壤中筛选到的新菌株，革兰氏染色阳性，具有弱至强的抗酸 性，专性需氧。可以利用P-环糊精、糊精、肝糖、菊粉、杏苷、D-阿糖醇、D-纤维二糖、L-海 藻糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、m-纤维醇、麦芽糖、D-苷露糖、D-松三糖、D-蜜二糖、a -甲 基-D-半乳糖苷、3_甲基-D-葡萄糖、a -甲基-D-葡萄糖苷、13 _甲基-D-葡萄糖苷、a -甲 基-D-甘露糖苷J-阿洛酮糖J-核糖、水杨苷、水苏糖、松二糖、0-木糖、醋酸、13 -羟基丁 酸、a-酮戊二酸、a-酮古洛糖酸、乳酰胺、D-苹果酸、丙酸、丙酮酸、琥珀酰胺酸、琥珀酸、 琥珀酸甲基酯、L-丙胺酸、L-丝氨酸、尿苷-5'-磷酸盐、D-果糖-6-磷酸。不能利用a-环 糊精、吐温_40、吐温-80、 L-阿拉伯糖、D-果糖、D-半乳糖酸、龙胆二糖、a _D_乳糖、乳果 糖、麦芽三糖、D-甘露醇、13 -甲基-D-半乳糖苷、L-鼠李糖、景天庚醛聚糖、蔗糖、塔格糖、 D-木糖醇、D-木糖、y -羟基丁酸、D-乳酸甲基酯、L-乳酸、P-羟苯乙酸、D-丙胺酸、L-丙 氨酰甘氨酸丄-谷氨酸、甘氨酰丙氨酸、腐胺、2， 3- 丁二醇、甘氨酰脯氨酸、2'-脱氧糖、次黄 苷、尿苷、胸苷_5' _磷酸盐、a -D-葡萄糖-1-磷酸盐、D-葡萄糖-6-磷酸盐。
16S rDNA序列鉴定以提取到的细胞总DNA为模板，利用通用引物Pl和P2扩增 菌株的16S rDNA基因，再将PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。经测序确认所述耐酪氨 酸冢村氏菌E105的16S rDNA基因序列如下
CGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGG。 该序列已提交GenBank (GenBank登录号为No. GU318217)，与GenBank中相关数据 进行相似性分析，结果表明E105菌株与冢村氏菌属(Tsukamurella sp.)的部分菌株序列 同源性较高。E105菌株与Tsukamurella tyrosinosolvens菌株IFM10913 (GenBank登录号为No. AB478957，序列同源性100%/1458bp，基于16S rRNA)的系统发育关系最近。
根据生理生化特性结合分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为耐酪氨酸冢村氏菌 (Tsukamurella tyrosinosolvens)。 通过Plackett-Burman考察了培养基各组分对耐酪氨酸冢村氏菌(Tsukamurella tyrosinosolvens) E105菌株产酶的影响；同时采用旋转中心组合实验设计法对酵母 粉浓度和pH这两个影响显著的因素进行优化，得到耐酪氨酸冢村氏菌(Tsukamure 11 a tyrosinosolvens) E105菌株的优化培养基组成为葡萄糖10 15g/L，酵母粉10 15g/L， NH4C1 7. 6 9. 5g/L， KH2P041. 3 2. 0g/L， K2HP040. 7 1. 0g/L， MgS040. 4 0. 6g/L， NaCl 0. 4 0. 6g/L， pH 6. 0 7. 0。 耐酪氨酸冢村氏菌(Tsukamurella tyrosinosolvens)E105的培养条件为初始 pH 7. 0，摇瓶装液量60 110mL/250mL锥形瓶，培养温度30。C、摇床转速200rpm，接种量 2 7%，培养时间36h。 本发明所涉及的微生物是通过以下的程序筛选得到 1)富集培养将采集的土样接入富集培养基中，置3(TC，200rpm的摇床培养4 5d，待培养液变混浊后，取lmL培养液转接至新鲜的富集培养基中，继续培养4 5d，如此 重复富集培养3 4次。富集培养基配方如下外消旋体a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酯 10mmol/L， (NH4) 2S042g/L， K2HP042g/L， KH2P04lg/L， NaCl 0. 5g/L， MgS04 7H20 0. 5g/L， pH 7. 0。 2)平板培养将富集培养液适当稀释后涂布平板培养基，平板培养基组成为富集 培养基中加入15g/L的琼脂。 3)斜面培养斜面培养基配方如下葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L， (NH4)2S042g/L， K2HP042g/L， KH2P04lg/L， NaCl 0. 5g/L， MgS04 7H20 0. 5g/L，琼月旨15g/L， pH 7.0。 30。C培养2 3d，4。C冰箱保存。 4)种子培养从培养成熟的斜面挑一环菌体接入装有75mL种子培养基的250mL 摇瓶中，3(TC，200r/min培养24小时。种子培养基配方如下葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L， 酵母粉2g/L， (NH4)2S042g/L， K2HP042g/L， KH2P04lg/L， NaCl 0. 5g/L， MgS04 7H20 0. 5g/L， pH 7. 0。 5)发酵培养以4X的接种量将种子液转接到装有70mL发酵培养基的250mL摇瓶 中，3(TC，200r/min培养48小时。发酵培养基配方同种子培养基。 6)生物转化反应将离心得到的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲液中，加入一定量的外 消旋体a-乙基-2-氧-l-吡咯烷乙酯，置3(TC摇床中反应一定时间。反应结束后，经离心 分离菌体后得到上清液，采用HPLC法测定目的产物的产率。 7)衍生化方法即将转化所得产物a-乙基-2-氧代-l-吡咯烷乙酸酯化成 a -乙基-2-氧代-l-吡咯烷甲酯。将上述所得上清液经烘干后加入1. 8mL无水甲醇溶解， 搅拌摇匀得瓶A。在0. 4mL无水甲醇中于0°C以下逐渐滴加0. 104mL的S0C12，严格控制温 度，得瓶B。将瓶B逐渐滴入瓶A，18 24s内滴完。控制反应温度在15t:，反应3h。反应 结束后将反应物倒入瓶C，滴加三乙胺的乙醇溶液(醇胺体积比为2:1)，中和pH至8，注 意控制滴加时温度不宜过高，中和完毕后放入冰箱内过夜。次日取出过滤，再用甲醇洗涤滤 液，于4(TC下真空干燥至恒重。经乙酸乙酯溶解后采用气相色谱法测定光学纯度。
6)分析检测 HPLC色谱条件采用Agilent 1200高效液相色谱仪；色谱柱Agilent_C18柱 (5 ii m，4. 6X250nm);检测波长:210nm ;流动相:甲醇/醋酸铵缓冲液(20mmol/L， pH 5. 5)
=20 : 80 ;流速0. 7mL/min ;柱温室温；进样量10 il L。产率计算式为 Y(产率)=N产物/N底物X100% 式中，N产物为转化所得产物a -乙基-2-氧代_1_吡咯烷乙酸的摩尔浓度，N底物为 反应初始时底物a _乙基_2-氧代-1-吡咯烷乙酯的摩尔浓度。 气相色谱条件采用岛津GC-2014气相色谱仪检测，手性色谱柱HPChiral 10% Cyclodextrin(30mX0. 25mmX0. 25iim)。载气为氮气；进样器温度25(TC ;色谱柱温度 120 180°C ;检测器温度250°C ;升温速度2. 5°C /min ;进样量0. 6 y L ;分流比15:1; 氢离子火焰检测器。气相色谱图见图1 3。产物的光学纯度由对映体过量值(e.e.)表 征，计算式为 e. e. = (CS_CK) / (CS+CK) X 100 % 式中，G为(S)-a-乙基-2-氧代-l-吡咯烷甲酯的浓度，Q为(R)-a-乙基-2-氧 代-l-吡咯烷甲酯的浓度。 本发明还涉及所述的耐酪氨酸冢村氏菌E105在手性生物催化制备(S)-a-乙 基-2-氧-1-吡咯烷乙酸中的应用。 具体的，所述的应用为以外消旋体a_乙基-2-氧-l-吡咯烷乙酯为底物，加入 耐酪氨酸冢村氏菌(Tsukamurella tyrosinosolvens)E105湿菌体细胞，25°C 35。C下，于 pH为6. 0 8. 0的缓冲液中进行转化反应12 60小时，反应结束后反应液经分离纯化得 到(S) - a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸。 所述缓冲液中底物外消旋体a _乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酯初始浓度为5. 2 31. 2g/L，耐酪氨酸冢村氏菌E105湿菌体细胞的初始浓度以干重为10 35g/L。
优选的，所述转化反应在pH为7. 0的磷酸盐缓冲液中进行。 所述耐酪氨酸冢村氏菌E105湿菌体细胞由如下方法制备得到将耐酪氨酸冢村 氏菌E105菌种接种至发酵培养基，3(TC、200rpm振荡培养36小时，发酵液离心、洗涤沉淀， 收集得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下葡萄糖10 35g/L，酵母粉5 30g/L，NH4Cl 1. 9 11. 4g/L，K2HP040. 7 3. 3g/L， KH2P040. 3 1. 7g/L，MgS04 *7H20 0. 2 1. Og/L， NaCl 0. 2 lg/L， pH 6. 3 7. 5。
具体的，所述应用方法如下 (1)将耐酪氨酸冢村氏菌E105菌种接种至发酵培养基，3(TC、200rpm振荡培养 36小时，发酵液离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下 葡萄糖15g/L，酵母粉12. lg/L， NH4C1 9. 5g/L， KH2P04lg/L， K2HP042g/L， MgS040 . 6g/L， NaCl 0. 6g/L， pH 7. 0 ; (2)取lOOmM pH为7. 0的磷酸盐缓冲液，加入步骤(1)所得湿菌体细胞，所述湿菌 体细胞浓度以干重计为30g/L，并加入底物外消旋体a -乙基-2-氧-l-吡咯烷乙酯至底物 浓度为15. 2g/L，3(TC摇床振荡反应36小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等 体积的乙酸乙酯萃取两次，得到(S)-a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸。 本发明的有益效果主要体现在目前文献报道的(S) _ a _乙基-2-氧_1_吡咯烷乙酸制备方法主要有化学拆分法和利用手性氨基酸作为起始原料的化学合成方法。本发明 首次采用微生物法制备(S) _ a _乙基_2-氧-1-吡咯烷乙酸，并提供了一株具有高立体选 择性，可制备高光学纯度的(S)-a-乙基-2-氧-l-吡咯烷乙酸的新菌种。本发明通过采 用耐酪氨酸冢村氏菌(Tsukamurella tyrosinosolvens)E105细胞的手性生物催化可使目 的产物(S) _ a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的光学纯度达到99. 4% e. e，产率达到48. 1 % 。 本发明通过筛选得到新菌种，从而在研究微生物法制备左乙拉西坦药物关键手性中间体， 以及在生物转化的工艺优化方面提供了有益的参考。
(四)
图1为外消旋体a _乙基-2_氧-1-吡咯烷乙酸对照品衍生物色谱图；
图2为(S) _ a _乙基_2-氧_1_吡咯烷乙酸对照品衍生物色谱图；
图3为生物转化所得高光学纯度产物的衍生物色谱图； 图1 3中1为(S)-a-乙基-2-氧-l-吡咯烷乙酸衍生物；2为(R) _ a _乙 基-2-氧-1-吡咯烷乙酸衍生物。
(五)
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此 实施例中产率和光学纯度检测方法如下 1) HPLC法测定产率生物转化结束后取反应液经离心得到上清液，采用HPLC法测
定产率。 HPLC色谱条件采用Agilent 1200高效液相色谱仪；色谱柱Agilent_C18柱 (5 ii m，4. 6X250nm);检测波长:210nm ;流动相:甲醇/醋酸铵缓冲液(20mmol/L，pH = 5. 5)
=20 : 80;流速0. 7ml/min;柱温室温；进样量10ilL。产率计算式为 Y(产率)=N产物/N底物X100% 式中，N产物为目的产物a -乙基-2-氧代_1_吡咯烷乙酸的摩尔浓度，N底物为反应 初始时底物a _乙基_2-氧代-1-吡咯烷乙酯的摩尔浓度。 2)GC法测定产物光学纯度生物转化所得产物先经衍生化处理，即先将产物 a _乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸酯化成a _乙基-2-氧代_1_吡咯烷甲酯后采用气相色 谱法测定产物光学纯度。 衍生化方法待生物转化反应结束后，取反应液经离心得到上清液，将上述所得上 清液经烘干后加入1. 8mL无水甲醇溶解，搅拌摇匀得瓶A。在O. 4mL无水甲醇中于0t:以下 逐渐滴加0. 104mL的S0C12，严格控制温度，得瓶B。将瓶B逐渐滴入瓶A， 18 24s内滴完。 控制反应温度在15t:，反应3h。反应结束后将反应物倒入瓶C，滴加三乙胺的乙醇溶液(醇 胺体积比为2 : 1)，中和至pH为8，注意控制滴加时温度不宜过高，中和完毕后放入冰箱内 过夜。次日取出过滤，再用甲醇洗涤滤液，于4(TC下真空干燥至恒重。经乙酸乙酯溶解后采 用气相色谱法测定产物光学纯度。 GC色谱条件采用岛津GC-2014气相色谱仪检测，手性色谱柱HPChiral 10% Cyclodextrin(30mX0. 25mmX0. 25iim)。载气为氮气；进样器温度250°C ;色谱柱温度120 180°C ;检测器温度250°C ;升温速度2. 5°C /min ;进样量0. 6il L ;分流比15 : 1 ; 氢离子火焰检测器。产物的光学纯度由对映体过量值(e.e.)表征，计算式为
e. e. = (CS_CK) / (CS+CK) X 100 % 式中，G为(S)-a-乙基-2-氧代-l-吡咯烷甲酯的浓度，Q为(R)-a-乙基-2-氧
代-l-吡咯烷甲酯的浓度。 实施例1 :菌株的分离 在10mL 0. 85%生理盐水中加入lg 土样，摇匀，使成均匀的悬液；吸取O. 5mL 土壤 悬液接种到装有50mL富集培养基的250mL三角瓶中，30°C ， 200rpm，摇瓶培养4 5天，待 培养液变混浊后，取lmL培养液转接至新鲜的富集培养基中，继续培养4 5天，如此重复 富集培养3 4次。富集液经梯度稀释，涂布到分离平板上，经多次分离后获得单菌落。
富集培养基以外消旋体a-乙基-2-氧-l-吡咯烷乙酯为唯一碳源，其配方如下 外消旋体a _乙基_2-氧-1-吡咯烷乙酯10,1/L， (NH4)2S042g/L， K2HP042g/L， KH2P04lg/ L， NaCl 0. 5g/L， MgS04 7H20 0. 5g/L， pH 7. 0，以蒸馏水配制。 将挑取的单菌落接种种子培养基，培养24小时，再转接至产酶培养基中培养 48小时后，用手性气相色谱法检测产物(S)-a-乙基-2-氧-l-吡咯烷乙酸的对映体 过量值(e.e.值)，筛选得到所述的微生物菌株——耐酪氨酸冢村氏菌(Tsukamurella tyrosinoso1vens) E105。
实施例2 :湿菌体细胞的获得 种子培养基配方葡萄糖15g/L，酵母粉12. lg/L， NH4C1 9. 5g/L， KH2P04lg/L， K2HP042g/L， MgS040. 6g/L， NaCl 0. 6g/L， pH 7. 0 ; 发酵培养基配方葡萄糖15g/L，酵母粉12. lg/L， NH4C1 9. 5g/L， KH2P04lg/L， K2HP042g/L， MgS040. 6g/L， NaCl 0. 6g/L， pH 7. 0 ; 从培养成熟的斜面挑一环菌体接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，30°C ， 200rpm培养24小时得种子液，再以体积比4%的接种量将种子液转接到装有lOOmL发酵培 养基的250mL摇瓶中，3(TC，200rpm培养36小时。培养结束后发酵液离心并用pH8. 0的磷
酸缓冲液洗涤一次，收集湿菌体细胞，备用。
实施例3 : 将实施例2所得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲液(0. lmol/L，pH 6)中；加入10. 4g/ L的外消旋体a _乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酯作为底物，细胞浓度(以干重计)为20g/L， 置于30°C ， 200rpm的摇床中反应24h。反应结束后，反应液离心、取上清液，采用前述检测方 法测定产物(S) _ a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的产率和光学纯度，产率为37. 7% ，光学纯 度64% e. e.。
实施例4: 将实施例2所得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲液(0. lmol/L， pH 6. 8)中；加入 10. 4g/L的外消旋体a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酯作为底物，细胞浓度为20g/L，置于 3(TC，200rpm的摇床中恒温反应24h。反应结束后，反应液离心、取上清液，采用前述检测方 法测定产物(S) _ a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的产率和光学纯度，产率为45. 3% ，光学纯 度98. 3% e. e.。
实施例5 :
10
将实施例2所得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲液(0. lmol/L， pH 8. 0)中；加入 10. 4g/L的外消旋体a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酯作为底物，细胞浓度为20g/L，置于 3(TC，200rpm的摇床中恒温反应24h。反应结束后，反应液离心、取上清液，采用前述检测方 法测定产物(S) _ a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的产率和光学纯度，产率为46. 2% ，光学纯 度90. 3% e. e.。
实施例6 : 将实施例2所得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲液(0. lmol/L， pH 7. 0)中；加入 10.4g/L的外消旋体a-乙基-2-氧-l-吡咯烷乙酯作为底物，细胞浓度为10g/L，置于 3(TC，200rpm的摇床中恒温反应24h。反应结束后，反应液离心、取上清液，采用前述检测方 法测定产物(S) _ a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的产率和光学纯度，产率为43. 2% ，光学纯 度85. 5% e. e.。
实施例7 : 将实施例2所得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲液(0. lmol/L， pH 7. 0)中；加入 10. 4g/L的外消旋体a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酯作为底物，细胞浓度为35g/L，置于 3(TC，200rpm的摇床中恒温反应24h。反应结束后，反应液离心、取上清液，采用前述检测方 法测定产物(S) _ a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的产率和光学纯度，产率为54. 2% ，光学纯 度87. 7% e. e.。
实施例8 : 将实施例2所得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲液(0. lmol/L， pH 7. 0)中；加入 15. 2g/L的外消旋体a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酯作为底物，细胞浓度为30g/L，置于 3(TC，200rpm的摇床中恒温反应36h。反应结束后，反应液离心、取上清液，采用前述检测方 法测定产物(S)-a-乙基-2-氧-l-妣咯烷乙酸的产率和光学纯度，产率为48. 1%，光学纯 度99. 4% e. e.。
实施例9: 将实施例2所得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲液(0. lmol/L， pH 8. 0)中；加入 5. 2g/L的外消旋体a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酯作为底物，细胞浓度为20g/L，置于35°C ， 200rpm的摇床中恒温反应48h。反应结束后，反应液离心、取上清液，采用前述检测方法测 定产物(S)-a-乙基-2-氧-l-吡咯烷乙酸的产率和光学纯度，产率为24.8%，光学纯度 71. 9% e. e.。
实施例10 : 将实施例2所得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲液(0. lmol/L， pH 8. 0)中；加入
31. 2g/L的外消旋体a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酯作为底物，细胞浓度为20g/L，置于
35°C，200rpm的摇床中恒温反应48h。反应结束后，反应液离心、取上清液，采用前述检测方
法测定产物(S) _ a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的产率和光学纯度，产率为49. 8% ，光学纯
度24. 6% e. e.。 SEQUENCELISTING 〈110〉浙江工业大学 〈120〉耐酪氨酸冢村氏菌及其催化制备(S)-a-乙基-2-氧-l-吡咯烷乙酸
〈130〉
〈160>1〈170>PatentIn version3. 4〈210>1〈211>1416〈212>DNA〈213>Tsukamurella tyrosinosolveris〈400>1acgctggcggcgtgctteacacatgc朋gtcg朋cggteaggcccttcggggtecacgag60tggcg雄gggtg3gt朋C3cgtgggtgacctgccctgtacttcgggataagcctgggaa120actgggtcteateccggatetgaccttcctctgcatgggggttggtggaaagcttttgcg180gtec3gg3tgggcccgcggcctetcagcttgttggtggggtaatggcctacc朋ggcgac240gacgggtegccggcctgagagggCg3CCggccacactggg3Ctg3g3C3Cggcccagact300cctacgggaggcagcagtgggg朋tettgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgc360cgcgtg郷gatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagctecgacg朋gcgc朋gt420gEicggtegtegcag朋g朋gcaccggccaactecgtgccagcagccgcgg■ggtgcg3gcgttgtccggatttectgggcgte朋gagctcgteggcggtttgtcacgtcg540tctgtg朋朋cccgaggcttaacctcgggcctgcaggcgatacgggcagacttgagtect600gtegggg卿ctggaattcctggtgtagcggtggaatgcgcagatetcaggagg朋cacc660ggtggcg朋ggcgggtctctgggcagteactgacgctgaggagcga朋gcgtgggtegcg720朋caggattegataccctggtegtccacgccgte朋cggtgggtecteggtgtgggtttc780cttccacgggatccgtgccgtegcteacgcattaagteccccgcctggggagtecggccg840c朋ggcte朋3CtC朋3gg3attgacgggggcccgcacaagcggcgg3gcatgtggatte■attcgatgcaacgcg朋g朋ccttecctgggtttgacatat卿ggEltCgccggagagat960tcggtttgccttgtgccttctetecaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtga1020gatgttgggtteagtcccgc朋Cg3gCgC3acccttgtctcatgttgccagcacgttetg1080gtggggactcgtg卿g3Ctgccggggtcaactcggagga3ggtgggg3tgacgtc朋gt1140catcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggcgcgtec卿gggctgc1200gateccgtgaggtgg3gCg3atccctteaagcgcgtctcagttcggattggggtctgcaa1260ctcgaccccatg￡l￡lgtCgg￡lgtcgctagtaatcgcagatcagc朋cgctgcggtg朋tec1320gttcccgggccttgtecacaccgcccgtcaCgtC3tg朋3gtcggt朋cacccgaagccg1380gtggccteaccccttgtgggagggagctgtcg朋gg141权利要求
耐酪氨酸冢村氏菌(Tsukamurella tyrosinosolvens)E105，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏日期2009年12月16日，保藏编号CCTCC NOM 209306。
2. 如权利要求1所述的耐酪氨酸冢村氏菌E105，其特征在于所述耐酪氨酸冢村氏菌 E105的16S rDNA基因序列如下ACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTAAGGCCCTTCGGGG TACACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGACCTGCCCTGTACTTCGGGGTTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTACAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCTACGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGTAGCAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGAGCCTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGTAGGGGAGACTGGAATTCCTG GTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCG GGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACA GGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAA GCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGA GGGAGCTGTCGAAGG。
3. 如权利要求1所述的耐酪氨酸冢村氏菌E105在手性生物催化制备(S)-a -乙 基-2-氧-1-吡咯烷乙酸中的应用。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为以外消旋体a -乙 基-2-氧-l-妣咯烷乙酯为底物，加入耐酪氨酸冢村氏菌(Tsukamurellatyrosinosolvens) E105湿菌体细胞，25"C 35"C下，于pH为6. 0 8. 0的缓冲液中进行转化反应12 60小 时，反应结束后反应液经分离纯化得到(S)-a-乙基-2-氧-l-吡咯烷乙酸。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述缓冲液中底物外消旋体a -乙 基-2-氧-1-吡咯烷乙酯初始浓度为5. 2 31. 2g/L，耐酪氨酸冢村氏菌E105湿菌体细胞 的初始浓度以干重为10 35g/L。
6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述转化反应在pH为7. 0的磷酸盐缓冲液中 进行。
7. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述耐酪氨酸冢村氏菌E105湿菌体细胞 由如下方法制备得到将耐酪氨酸冢村氏菌E105菌种接种至发酵培养基，3(TC、200rpm振 荡培养36小时，发酵液离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成 如下葡萄糖10 35g/L，酵母粉5 30g/L， NH4C11. 9 11. 4g/L， K2HP040. 7 3. 3g/L， KH2P040. 3 1. 7g/L， MgS04 7H20 0. 2 1. Og/L， NaCl 0. 2 lg/L， pH 6. 3 7. 5。
8. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用如下(1) 将耐酪氨酸冢村氏菌E105菌种接种至发酵培养基，3(TC、200rpm振荡培养36小 时，发酵液离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下葡萄 糖15g/L，酵母粉12. lg/L，NH4Cl 9. 5g/L，KH2P04llgL，K2HP042g/L，MgS040 . 6g/L，NaCl 0. 6g/ L， pH 7. 0 ;(2) 取100mM pH为7. 0的磷酸盐缓冲液，加入步骤(1)所得湿菌体细胞，所述湿菌体细 胞浓度以干重计为30g/L，并加入底物外消旋体a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酯至底物浓度 为15. 2g/L，3(TC摇床振荡反应36小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积 的乙酸乙酯萃取两次，得到(S)-a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸。
全文摘要
本发明提供了一株新的菌种——耐酪氨酸冢村氏菌(Tsukamurella tyrosinosolvens)E105，及其在手性生物催化制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸中的应用。耐酪氨酸冢村氏菌E105，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏日期2009年12月16日，保藏编号CCTCC NOM209306。本发明首次采用微生物法制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸，并提供了一株具有高立体选择性，可制备高光学纯度的(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的新菌种。本发明通过采用耐酪氨酸冢村氏菌E105细胞的手性生物催化可使目的产物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的光学纯度达到99.4％e.e，产率达到48.1％。本发明通过筛选得到新菌种，从而在研究微生物法制备左乙拉西坦药物关键手性中间体，以及在生物转化的工艺优化方面提供了有益的参考。
文档编号C12N1/20GK101748087SQ20091015577
公开日2010年6月23日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年12月25日
发明者何军邀, 王普, 袁帅 申请人:浙江工业大学