专利名称：羧酸酯酶的重组表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。
背景技术：
羧酸酯酶能够水解羧酸酯，从而产生羧酸(盐)和醇。羧酸酯酶属于水解酶超家 族。已经在从原核细胞到真核细胞的多种物种中鉴定出了羧酸酯酶。
发明内容
在一个方面中，本公开内容提供了一种用于产生蛋白质的方法，包括将经改造而 表达编码羧酸酯酶或其变体之基因的真核细胞在适于表达该羧酸酯酶或其变体的条件下 进行培养。在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于产生蛋白质的方法，包括将经改造 而表达编码微生物羧酸酯酶或其变体之基因的真核细胞在适于表达该微生物羧酸酯酶或 其变体的条件下进行培养。在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于产生蛋白质的方法，包括将经改造 而表达编码羧酸酯酶或其变体之基因的丝状真菌细胞在适于表达该羧酸酯酶或其变体的 条件下进行培养。在另一个方面中，本公开内容提供了表达载体，其包含编码羧酸酯酶或其变体的 基因以及能促进该羧酸酯酶或其变体在真核细胞中表达的调节序列，其中所述调节序列与 该基因可操纵地连接。在另一个方面中，本公开内容提供了包含表达载体的真核细胞，所述表达载体包 含编码羧酸酯酶或其变体的基因以及能促进该羧酸酯酶或其变体在真核细胞中表达的调 节序列，其中所述调节序列与该基因可操纵地连接。在另一个方面中，本公开内容提供了组合物，其包含真核细胞以及该真核细胞所 表达的羧酸酯酶或其变体。在另一个方面中，本公开内容提供了组合物，其包含丝状真菌细胞以及该丝状真 菌细胞所表达的羧酸酯酶或其变体。在另一个方面中，本公开内容提供了组合物，其包含通过本公开内容的方法所产 生的分离的羧酸酯酶或其变体。在另一个方面中，本公开内容提供了使用本公开内容之组合物的方法。以上概述仅用于说明，而并非旨在以任何方式进行限制。除了上述说明的各方面、 实施方案和特征以外，其它方面、实施方案和特征在参考附图和下文的详细说明之后将是 很明显的。
图1显示质粒pIGF的示意图。
图2显示质粒pYGl. 2的示意图。图3显示来自以下菌株的培养基凝胶电泳结果转化有pYGl. 2-CarE-his的黑曲 霉(Aspergillus niger)M54(L2)；转化有pYGl. 2的黑曲霉M54(L3)；以及未转化的黑曲霉 M54(L4)。蛋白分子量标志物示于Li。L2中所示的约29. OKD的条带是羧酸酯酶的条带。图4显示以下菌株所表达的羧酸酯酶的Western印迹结果转化有 pPIC9K-CarE-His 的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115 (L4)；以及转化有 pYGl. 2-CarE-His的黑曲霉M54(L5)。在以下阴性对照中未检测到羧酸酯酶的表达转化有 PPIC9K的巴斯德毕赤酵母GS115(L3)；未转化的黑曲霉M54 (L6)；转化有pYGl. 2的黑曲霉 M54(L7)。阳性对照(含有His标签的蛋白质)示于Li，蛋白标志物示于L2。图5显示转化有pPIC9K-CarE-His的巴斯德毕赤酵母GSl 15所表达羧酸酯酶的凝 胶电泳结果，其中在培养24小时(L3)、48小时(L4)和72小时(L5)后采样。蛋白标志物 示于Li，转化有pPIC9K的巴斯德毕赤酵母GSl 15的培养基示于L2。图6显示在培养的不同时间点从培养基中分离的羧酸酯酶的酶活性。图7显示在不同pH值下测量的重组羧酸酯酶的相对酶活性。图8显示在以不同温度将羧酸酯酶处理10或30分钟后在37°C下测量的重组羧酸 酯酶的相对酶活性。图9显示在不同温度下测量的重组羧酸酯酶的相对酶活性。 具体实施方案在下文的详细描述中，将参考构成本文一部分的附图。在附图中，相似的符号一般 指代相似的部分，除非其上下文有其他明确表述。在具体实施方案、附图和权利要求中描述 的说明性实施方案并无限制之意。可以利用其他实施方案、进行其他改动，而不偏离本文之 主题的构思或范围。本公开内容涉及用于产生羧酸酯酶及其变体的重组方法、可用于重组产生羧酸酯 酶及其变体的表达载体和宿主细胞。本公开内容还涉及包含所述重组产生的羧酸酯酶及其 变体的组合物以及使用该组合物的方法。在一个方面中，本公开内容提供了一种用于产生蛋白质的方法，所述方法包括将 经改造而表达编码羧酸酯酶或其变体之基因的真核细胞在适于表达该羧酸酯酶或其变体 的条件下进行培养。在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于产生蛋白质的方法，所述方法包括 将经改造而表达编码羧酸酯酶或其变体之基因的丝状真菌细胞在适于表达该羧酸酯酶或 其变体的条件下进行培养。在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于产生蛋白质的方法，所述方法包括 将经改造而表达编码微生物羧酸酯酶或其变体之基因的真核细胞在适于表达该微生物羧 酸酯酶或其变体的条件下进行培养。在某些实施方案中，该方法还可包括从真核细胞培养物中分离所述羧酸酯酶或其 变体。在某些实施方案中，该方法还可包括将含有编码羧酸酯酶或其变体之基因的表达载 体引入所述真核细胞中。真核细胞
真核细胞是组织成包裹在膜中的复杂结构(尤其包括含有遗传物质的与膜结合 的核)的细胞。本公开内容的真核细胞包括但不限于真菌细胞、原生生物细胞、动物细胞和 植物细胞。真菌细胞可包括但不限于酵母细胞和丝状真菌细胞。本公开内容的酵母细胞可根据其系统发生特征而归为子囊真菌亚门 (Ascomycota)和担子真菌亚门(Basidiomycota)。酵母细胞的说明性实例包括但不仅 限于毕赤酵母属物种如安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、甲 醇毕赤酵母(Pichia methanolica)和季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)； 汉逊酵母属(Hansenula)物种如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、多形汉逊酵母 (Hansenulapolymorpha)、温奇汉逊酵母(Hansenula wingei)、杰丁汉逊酵母(Hansenula jadinii)禾口 土星汉逊酵母(Hansenula saturnus)；酵母属(Saccharomyces)如酉良^ (Saccharomyces cerevisiae)、贝 _ BJ (Saccharomyces bayanus) > ^ ii
母(Saccharomyces boulardii)；假丝酵母属(Candida)物种如白假丝酵母(Candida albicans)、Candidamethylica、波氏假丝酵母(Candida boidinii)、热带假丝酵母 (Candidatropicalis) ,Candida wickerhamii、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)和光滑 假丝酵母(Candida glabrata)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)；以及克鲁维酵母菌 属(Kluyveromyces)物种禾口裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种。在一些实施方案中，所述酵母细胞为巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母、酿酒酵母或 光滑球拟酵母中的一种或多种。在一些实施方案中，所述酵母细胞为巴斯德毕赤酵母。在 一些实施方案中，所述酵母细胞为巴斯德毕赤酵母菌株GS115细胞、巴斯德毕赤酵母菌株 KM71细胞或巴斯德毕赤酵母菌株MC100-3细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述 酵母细胞为多形汉逊酵母菌株ATCC34438细胞。丝状真菌可包括但不仅限于以多细胞丝的形式生长的任何微小真菌 (microscopic fungi)物种。在一些实施方案中，所述丝状真菌细胞包括但不仅限 于支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属 (Humicola) >(Mucor),^M (Myceliophthora) > βM (Neurospora) > # 霉属(Penicillium)、梭孢壳菌属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)和木霉属 (Trichoderma)中的多个物种。在一些实施方案中，所述丝状真菌细胞为泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲 霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在一个 说明性实施方案中，所述丝状真菌细胞为黑曲霉ATCC 12049菌株细胞。在另一个说明性实 施方案中，所述丝状真菌细胞为米曲霉RIB40菌株细胞。原生生物细胞可包括但不仅限于原生动物细胞和藻类细胞。动物细胞可包括但不仅限于哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖类细胞和昆虫细 胞。动物细胞的说明性实例包括猪肝细胞、人胚肾293(HEK293)细胞、中国仓鼠卵巢细 胞(CH0)、斑马鱼PAC2细胞、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)A6肾上皮细胞、秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans)细胞和果蝇细胞。
植物细胞可包括但不限于薄壁组织细胞、厚角细胞和厚壁组织细胞。植物细胞的 说明性实例为烟草BY-2细胞、毛曼陀罗(Datura innoxia)细胞系和SB-I细胞系。在一些实施方案中，本公开内容的真核细胞可带有导致与野生型菌株相比发 生表型改变的一种或多种突变。真核细胞中的突变可以是天然或非天然的。天然突变 可在进化过程中自发形成。非天然突变可以使用本领域已知方法人工产生。在一个说 明性实例中，可以通过使细胞接触物理诱变剂(如UV照射)或化学诱变剂(如羟胺和 漠化乙,定)来产生突变(参阅如 Hopwood， The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology (J. R. Norris 禾口 D. W. Ribbons 编辑)1970，363—433，Academic Press, New York)。在另一个说明性实例中，可通过基因缺失技术(如同源重组)来产生突变，以破 坏一种或多种靶基因的表达(参阅如Alberts等，Chapter 5 DNAR印Ii cat ion，Repair, and Recombination, Molecular biology of the cell,2002,845, Garland Science. New York) 0在另一个说明性实例中，可以通过基因修饰技术(如聚合酶链式反应 (PCR))来产生突变(参阅如 Botstein 等，Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 1985, vol 229, No.4719,1193-1201 ；Lo 等，Specific amino acid substitutions in bacterioopsin !Replacement of a restriction fragment in the structural gene by syntheticDNA fragments containing altered codons,Proc. Natl. Acad.Sci. USA 1985, vol 81, No. 8,2285-2289 ；Youngman 等，Genetic transposition and insertionalmutagenesis in Bacillus subtilis with Streptococcus faecalis transposon Tn917, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983, vol 80，No. 8，2305-2309)。在一些实施方案中，本公开内容的真核细胞可带有使其无法合成细胞生长所必需 物质的一种或多种突变。突变可发生在参与氨基酸、核苷酸、糖、脂肪酸、维生素和其它必需 物质的合成和/或代谢的基因中。在一些实施方案中，所述真核细胞可以是突变体酵母细胞，其在分别参与尿苷、色 氨酸、腺苷和亮氨酸合成的ura、trp、ade和Ieu基因中带有突变(Agaphonov等，Isolation and characterization of the LEU2 gene ofHansenula polymorpha, Yeast 1994, vol 10, 509-513 ；Bogdanova等, Plasmideorganization during integrative transformation in Hansenula polymorpha, Yeast 1995, vol 11, 343-353 ;Merckelbach 等，Cloning and sequencing of theura3 locus of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha and its use forthe generation of a deletion by gene replacement,Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993，vol 40,361—364)。在一些实施方案中，所述真核细胞可以是缺失pyrG基因功能的突变体丝状 真菌细胞(例如黑曲霉菌株)，它们无法合成尿苷，因此不能在无尿苷的培养基上生长 (Liu 等，Construction of pyrG auxotrophic Aspergi1lusniger strain, Journal of microbiology 2001, vol 21，No. 3，15-16)。在一个说明性实施方案中，所述真核细胞是黑 曲霉M54，该菌株在2009年6月14日按照《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩 斯条约》(布达佩斯条约)的规定和条件保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏号为 CCTCC M 209121。在另一个说明性实施方案中，所述真核细胞是营养缺陷型米曲霉突变体菌 株，例如缺失argB基因的米曲霉M-2-3，该菌株无法合成精氨酸，因此不能在无精氨酸的培养基上生长(Gomi 等，Integrative transformation ofAspergillus oryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulans argBgene.Agric Biol Chem. 1987，vol 51，2549-2555)，还例如缺失niaD基因的米曲霉，其缺少硝酸还原酶，因 此无法在以硝酸盐作为唯一氮源的培养基上生长(Unkles等，The development of a homologous transformation systemfor Aspergillus oryzae based on the nitrate assimilation pathway :Aconvenient and general selection system for filamentous fungaltransformation,Molecular and General Geneticsl989,vol 218, No. 1,99-104)。羧酸酯酶及其变体本文使用的术语“羧酸酯酶”指能将羧酸酯水解成羧酸(盐)和醇的酶多肽。羧 酸酯酶可以是野生型羧酸酯酶或其任何变体。野生型羧酸酯酶的变体与野生型羧酸酯酶 的氨基酸序列和/或氨基酸修饰不同，但仍有将羧酸酯水解成羧酸(盐)和醇的能力。变 体可具有野生型羧酸酯酶的一个或多个氨基酸替换、添加、缺失、插入、截短、修饰(如磷酸 化、糖基化、标记等)或其任何组合。变体可包括野生型羧酸酯酶的天然变体以及人工多肽 序列，例如通过化学合成或重组方法获得的多肽序列。变体可包括野生型羧酸酯酶的片段、 突变体、杂合体、类似物和衍生物。变体可含有非天然氨基酸残基。已经从大量物种(包括但不仅限于动物、昆虫、植物和微生物)中鉴定和分离了羧 酸酯酶。已经鉴定了来自许多物种的羧酸酯酶的核苷酸序列和氨基酸序列。在一个实施方案中，所述羧酸酯酶来自微生物。术语“微生物”指除人、动物和植 物以外的任何有生命的生物。微生物可包括但不限于原核生物如细菌、原生动物、真菌、原 生生物和古细菌。微生物的说明性实例为大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热脂肪地芽孢 木干胃(Geobaci 1 lusstearothermophilus) >(Bacillus cereus) Λ^ΜΨχ^Μ 母(Candida rugosa)、恶性疱原虫(Plasmodium falciparum)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)禾口烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。已经从许多微生物中分离了羧酸酯酶，并获得了其相应的核苷酸序列和氨基酸序 列。表1列出了微生物羧酸酯酶的说明性实例以及以GenBank登记号标明的其核苷酸及多 肽序列。表1.不同微生物的羧酸酯酶的说明性实例
权利要求
1.一种用于产生蛋白质的方法，所述方法包括将经改造而表达编码来自微生物的羧酸酯酶或其变体之基因的真核细胞在适于表达 该羧酸酯酶或其变体的条件下进行培养。
2.权利要求1的方法，其中所述真核细胞是酵母细胞。
3.一种用于产生蛋白质的方法，所述方法包括将经改造而表达编码羧酸酯酶或其变体之基因的真核细胞在适于表达该羧酸酯酶或 其变体的条件下进行培养，其中所述真核细胞是丝状真菌细胞。
4.权利要求3的方法，其中所述丝状真菌细胞来自曲霉(Aspergillus)属。
5.一种表达载体，其包含编码微生物羧酸酯酶或其变体的基因； 禾口能促进该微生物羧酸酯酶或其变体在真核细胞中表达的调节序列，其中所述调节序列 与该基因可操纵地连接。
6.一种表达载体，其包含编码羧酸酯酶或其变体的基因； 禾口能促进该羧酸酯酶或其变体在丝状真菌细胞中表达的调节序列，其中所述调节序列与 该基因可操纵地连接。
7.一种包含权利要求5和6中任一项的表达载体的真核细胞。
8.一种组合物，其包含 真核细胞；和该真核细胞所表达的微生物羧酸酯酶或其变体。
9.一种组合物，其包含 丝状真菌细胞；和该丝状真菌细胞所表达的微生物羧酸酯酶或其变体。
10.一种将含有羧酸酯基团的化合物转化成无羧酸酯基团的化合物的方法，包括 将该化合物与通过权利要求1和3中任一项的方法所产生的羧酸酯酶或其变体一起孵
全文摘要
本公开内容提供了在真核细胞中产生羧酸酯酶或其变体的方法。本公开内容还提供了用于高水平表达羧酸酯酶的表达载体、包含所述表达载体的真核细胞以及它们的用途。本公开内容还提供了包含通过本申请所述方法所产生的羧酸酯酶或其变体的组合物，以及该组合物的用途。
文档编号C12N5/10GK101993861SQ200910166839
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月31日 优先权日2009年8月31日
发明者刘钟滨 申请人:同济大学