专利名称：：一种芽孢杆菌活菌数量的检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种芽孢菌活菌数量的检测方法，属于微生物检测
技术领域：
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背景技术：
：益生素(Probiotic)又称微生态制剂或活菌制剂，是一类活性微生物添加剂。一方面，益生素被畜禽来食后能在消化道特别是肠道内发育、繁殖并起有益作用，能促进畜禽生长发育，提高饲料利用率，降低幼畜幼禽死亡率，防止消化道疾病，提高机体免疫力；另一方面，相对使用抗生素引起的药物残留、耐药菌株产生等问题，作为新型绿色添加剂的益生素，由于其无残留、无污染以及不产生耐药性等特点，有其独特的优越之处，因而益生素已成为很有前途的新型饲料添加剂。枯草芽孢杆菌、地农芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和乳酸芽孢杆菌等都属于益生素。当益生素中的芽孢杆菌以孢子状态进入畜禽消化道后迅速生长繁殖，消耗肠内的氧气，使局部的氧分子浓度下降，造成肠内厌氧环境，促进了厌氧菌的生长，从而恢复肠内微生物之间的微生态平衡，达到治病促生长之目的。益生素可以作为非特异免疫调节因子，通过细菌本身或细胞壁成份刺激宿主免疫细胞，使其激活，产生促分裂因子，促进吞噬细胞活力或作为佐剂发挥作用。益生素还可以发挥特异性免疫功能，促进动物体细胞产生抗体的能力。应用益生素后，消化道内双歧杆菌等厌氧菌增多，也是促进免疫作用的一个重要因素。由于芽孢在结构和化学成分上均有别于营养细胞，所以芽孢也就具有了许多不同于营养细胞的特性。芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。同时，芽孢还有很强的折光性。在显微镜下观察染色的芽孢细菌涂片时，可以很容易地将芽孢与营养细胞区别开，因为营养细胞染上了颜色，而芽孢因抗染料且折光性强，表现出透明而无色的外观。研究表明芽孢对不良环境因子的抗性主要由于其含水量低(40%)。且含有耐热的小分子酶类，富含大量特殊的吡啶二羧酸钙和带有二硫键的蛋白质，以及具有多层次厚而致密的芽孢壁等原因。现有的芽孢活菌检测方法是直接稀释后涂板培养，存在很多活菌未能检出，不能真实反应芽孢产品的活菌数的缺点。
发明内容本发明的目的是在现有通用检测方法NY/T1461-2007基础上，提供一种准确度较高的芽孢菌活菌数量的检测方法。为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种芽孢菌活菌数量的检测方法，其特征在于，具体步骤为第一步按照常规方法称取芽孢菌样品；第二步将上述芽孢菌样品以重量比l:8-10加入装有营养肉汤萌发剂的三角瓶或者试管中，所述营养肉汤萌发剂中含有0.001-0.1wt^硫酸锰、0.01-lwt^硫酸镁以及0.001-0.05wtX硫酸亚铁，将所述三角瓶或者试管置于80。C恒温水浴中高温处理10-15分钟，用常温流水冷却，在摇床上以转速200rpm震荡30分钟得到芽孢菌培养液；第三步将芽孢菌培养液用0.5-lwtX氯化钠稀释液稀释10倍，以体积比l:20-25接种到事先融化并冷却至5(TC的营养琼脂培养基中，待凝固后，放入37'C恒温箱中倒置培养48小时后平板上长出可见菌落；第四步按照常规方法计算获得该样品中的活菌数量。本发明提供的有效芽孢杆菌数量的检测方法，在现有通用检测方法的基础上根据芽孢萌发特点，通过高温处理刺激成熟芽孢萌发，再经过萌发剂培养，彻底让芽孢复苏，准确度高，适用于采用有效芽孢杆菌生产饲料微生物添加剂芽孢杆菌的产品质量检测使用。具体实施例方式下面结合实施例来具体说明本发明。实施例l从同一批地衣芽孢杆菌的固体产品中相同的取样2份，其中l份按中国农业行业标准NY/T1461-2007规定的常规方法，进行检测培养基的制备和平板的制作，以及样品的取样、称量、稀释、混板、培养和计算，获得样品的有效活菌数，结果列于表一.另一份样品使用本发明提供的方法，进行有效芽孢数量的检测，具体步骤如下第一步按照常规方法称取芽孢菌样品；第二步将上述芽孢菌样品以重量比1:8加入装有营养肉汤萌发剂的三角瓶或者试管中，所述营养肉汤萌发剂中含有0.001wt^硫酸锰、0.01wt^硫酸镁以及0.001讨％硫酸亚铁，将所述三角瓶或者试管置于80'C恒温水浴中高温处理10分钟，用常温流水冷却，在摇床上以转速200rpm震荡30分钟得到芽孢菌培养液；第三步将芽孢菌培养液用0.5wt^氯化钠稀释液稀释10倍，以体积比l:20接种到事先融化并冷却至50'C的营养琼脂培养基中，待凝固后，放入37'C恒温箱中倒置培养48小时后平板上长出可见菌落；第四步按照常规方法计算获得该样品中的活菌数量。2种方法的检测结果如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例2从同一批枯草芽孢杆菌的固体产品中相同的取样2份，其中l份按中国农业行业标准NY/T1461-2007规定的常规方法，进行检测培养基的制备和平板的制作，以及样品的取样、称量、稀释、混板、培养和计算，获得样品的有效活菌数，结果列于表二.另一份样品使用本发明提供的方法，进行有效芽孢数量的检测，具体步骤如下第一步按照常规方法称取芽孢菌样品；第二步将上述芽孢菌样品以重量比l:IO加入装有营养肉汤萌发剂的三角瓶或者试管中，所述营养肉汤萌发剂中含有O.lwt^硫酸锰、lwt^硫酸镁以及0.05wt^硫酸亚铁，将所述三角瓶或者试管置于8(TC恒温水浴中高温处理15分钟，用常温流水冷却，在摇床上以转速200rpm震荡30分钟得到芽孢菌培养液；第三步将芽孢菌培养液用lwtX氯化钠稀释液稀释10倍，以体积比l:25接种到事先融化并冷却至5(TC的营养琼脂培养基中，待凝固后，放入37'C恒温箱中倒置培养48小时后平板上长出可见菌落；第四步按照常规方法计算获得该样品中的活菌数量。2种方法的检测结果如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例3从同一批凝结芽孢杆菌的固体产品中相同的取样2份，其中l份按中国农业行业标准NY/T1461-2007规定的常规方法，进行检测培养基的制备和平板的制作，以及样品的取样、称量、稀释、混板、培养和计算，获得样品的有效活菌数，结果列于表三.另一份样品使用本发明提供的方法，进行有效芽孢数量的检测，具体步骤如下第一步按照常规方法称取芽孢菌样品；第二步将上述芽孢菌样品以重量比1:9加入装有营养肉汤萌发剂的三角瓶或者试管中，所述营养肉汤萌发剂中含有0.05wt^硫酸锰、0.05wtX硫酸镁以及0.03wt^硫酸亚铁，将所述三角瓶或者试管置于8(TC恒温水浴中高温处理12分钟，用常温流水冷却，在摇床上以转速200rpm震荡30分钟得到芽孢菌培养液；第三步将芽孢菌培养液用0。8wt^氯化钠稀释液稀释10倍，以体积比l:22接种到事先融化并冷却至5(TC的营养琼脂培养基中，待凝固后，放入37'C恒温箱中倒置培养48小时后平板上长出可见菌落；第四步按照常规方法计算获得该样品中的活菌数量。2种方法的检测结果如下表:检测方法产品出厂检测产品储存6个月检测常规方法8.3亿个/ml4.3亿个/ml本发明方法12.1亿个/ml11.8亿个/ml由上3张表所列的结果可以看出常规检测方法测得了较高数量的菌数。但是经过6个月后，采用常规方法检测很多芽孢都没有萌发，使用本发明后，6个月以后的检测结果地衣芽孢杆菌提高了204%，枯草芽孢杆菌提高了382%，凝结芽孢杆菌提高了174%。由于长时间存放让芽孢处于休眠状态，用常规方法不能准确的检测出。采用本发明所检测的结果，由于采用高温处理，热应激芽孢后，芽孢活菌明显提高，减少芽孢杆菌营养体检测的干扰。根据微生物饲料添加剂的要求及芽孢杆菌的生物特性，采用本发明的检测方法，可以排除样品内其它杂菌的干扰，测定结果更加符合实际情况，更为准确。权利要求1、一种芽孢菌活菌数量的检测方法，其特征在于，具体步骤为第一步按照常规方法称取芽孢菌样品；第二步将上述芽孢菌样品以重量比1∶8-10加入装有营养肉汤萌发剂的三角瓶或者试管中，所述营养肉汤萌发剂中含有0.001-0.1wt％硫酸锰、0.01-1wt％硫酸镁以及0.001-0.05wt％硫酸亚铁，将所述三角瓶或者试管置于80℃恒温水浴中高温处理10-15分钟，用常温流水冷却，在摇床上以转速200rpm震荡30分钟得到芽孢菌培养液；第三步将芽孢菌培养液用0.5-1wt％氯化钠稀释液稀释10倍，以体积比1∶20-25接种到事先融化并冷却至50℃的营养琼脂培养基中，待凝固后，放入37℃恒温箱中倒置培养48小时后平板上长出可见菌落；第四步按照常规方法计算获得该样品中的活菌数量。全文摘要本发明提供了一种芽孢菌活菌数量的检测方法，其特征在于，具体步骤为按照常规方法称取芽孢菌样品；将上述芽孢菌样品加入装有营养肉汤萌发剂的三角瓶或者试管中，所述营养肉汤萌发剂中含有硫酸锰、硫酸镁以及硫酸亚铁，将所述三角瓶或者试管置于80℃恒温水浴中高温处理10-15分钟，用常温流水冷却，在摇床上震荡30分钟得到芽孢菌培养液；将芽孢菌培养液用0.5-1wt％氯化钠稀释液稀释10倍，接种到事先融化并冷却至50℃的营养琼脂培养基中，待凝固后，放入37℃恒温箱中倒置培养48小时后平板上长出可见菌落；按照常规方法计算获得该样品中的活菌数量。本发明的优点是准确度高。文档编号C12Q1/06GK101659983SQ200910196640公开日2010年3月3日申请日期2009年9月28日优先权日2009年9月28日发明者张玉辉,瀚江申请人:上海创博生态工程有限公司