专利名称：一种氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)的基因工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种氧化葡萄糖酸杆菌(G. oxydans) 的基因工程菌及其应用。
背景技术：
1，3-二羟基丙酮(l，3-Dihydr0XyaCet0ne，DHA)是最简单的多羟基酮糖，是一种 带有甜味的白色粉末状结晶，易溶于水及乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂。1，3_ 二羟丙酮分子 中含有两个羟基和一个酮基，化学性质活泼，广泛参与聚合和缩合等化学反应，是一种重要 的医药、化学合成中间体及原料，在精细化工、食品工业和化妆品工业等多种行业发挥着重 要的作用。目前，1，3-二羟丙酮的合成可通过两种途径实现，即化学合成法和微生物转化 法。与化学合成法相比，微生物转化法具有专一性强、转化率高、反应条件温和、生产工 艺简单等诸多优点，因此渐显取代化学合成法的趋势。据文献报道，能够生产1，3_ 二羟 丙酮的微生物有氧化杆菌属(GluconcAacter)、醋酸杆菌属(AcetcAacter)、芽孢杆菌 属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属 (Pichia)等原核及真核微生物。其中，应用最广泛、转化率最高的为氧化杆菌属的氧化葡萄 糖酸杆菌(G. oxydans)。然而，氧化葡萄糖酸杆菌为专性嗜氧菌，在细胞生长和生物催化过程中需要大量 氧气，由于生物反应器氧气供应相对不足，导致细胞产量和催化效率低下，而要提高反应器 的供氧量，则必将提高对反应器的设计要求，并导致耗能增加。因此，氧气的供应成为制约 氧化葡萄糖酸杆菌应用的重要因素之一。在保持现有设备和能耗压力不变的情况下，氧化 葡萄糖酸杆菌在细胞培养和催化过程中的供氧不足问题有待解决。透明颤菌血红蛋白(VHb)能在低氧条件下，从分子水平提高细胞自身对溶氧的利 用能力，满足菌体细胞的呼吸要求，使之适应较低的溶氧水平，促进细胞生长和代谢产物的 合成，提高目的产物的产量和收率，同时可降低氧气及能量消耗，因而降低发酵成本。目前， 该蛋白已被成功应用于耗氧量大、溶氧易成为限制性因素的抗生素工业、基因工程菌高密 度发酵和供氧受限制的动、植物细胞培养过程，但未见VHb在氧化葡萄糖酸杆菌中表达的 报导。
发明内容
本发明的第一个目的，在于提供一种用于在胞内表达VHb的重组质粒。本发明的第二个目的，在于提供所述重组质粒的构建方法。本发明的第三个目的，在于提供一种能在胞内表达VHb的基因工程菌。本发明的第四个目的，在于提供所述基因工程菌的构建方法。本发明的第五个目的，在于提供所述基因工程菌的应用。
本发明的用于在胞内表达VHb的重组质粒由透明颤菌血红蛋白基因vgb、氧化葡 萄糖酸杆菌(G.oxydans)的PtufB启动子、以及合适的载体构成。根据本发明，所述载体为广宿主质粒pBBRlMCS-5。本发明的所述重组质粒的构建方法包括以下步骤A、扩增透明颤菌血红蛋白基因vgb，将其连入合适的载体，获得质粒pBBR-VHb ；B、扩增氧化葡萄糖酸杆菌(G. oxydans)的PtufB启动子，连入质粒pBBR-VHb，获得 重组质粒 pBBR-PtufB-VHb。本发明的用于在胞内表达VHb的基因工程菌通过将上述重组质粒转入氧化葡萄 糖酸杆菌(G. oxydans)而获得。本发明的所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤A、扩增透明颤菌血红蛋白基因vgb，将其连入合适的载体，获得质粒pBBR-VHb ；B、扩增氧化葡萄糖酸杆菌(G. oxydans)的PtufB启动子，连入质粒pBBR-VHb，获得 重组质粒 pBBR-PtufB-VHb。C、将重组质粒pBBR-PtufB-VHb转化至氧化葡萄糖酸杆菌(G. oxydans)，获得氧化 葡萄糖酸杆菌(G. oxydans)的基因工程菌。
根据本发明，所述重组质粒pBBR-PtufB-VHb在转化氧化葡萄糖酸杆菌 (G. oxydans)前先使用大肠杆菌(E. Coli)进行扩增。本发明的所述基因工程菌可以在胞内表达VHb，以及用于转化甘油生产1，3_ 二羟基丙酮。本发明所构建的VHb表达载体为组成型表达载体，在菌体生长的过程中即可同步 表达，其表达不需低水平溶氧的诱导。本发明所用的启动子是氧化葡萄糖酸杆菌同源启动子PtufB，菌体生长便可启动 基因表达。对本发明所构建的氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌的性能进行测试，包括VHb表 达量、在限氧和非限氧条件下生长状况以及其静息细胞转化甘油生产1，3-二羟丙酮的效 果。结果显示，本发明所构建的氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌在胞内表达VHb，在限氧和 非限氧条件下，尤其是限氧条件下，VHb的表达促进了菌体的生长，提高了从甘油到1，3_ 二 羟丙酮的转化效率。本发明所构建的表达VHb的氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌，为在保 持现有设备和能耗压力不变的情况下，解决氧化葡萄糖酸杆菌在细胞培养和催化过程中的 供氧不足问题提供一条新的有效的途径。
图1为VHb基因Vgb的核酸电泳图。图2为质粒pBBR-VHb的双酶切及PCR验证图。图3为启动子PtufB核酸电泳图。图4为质粒pBBR-PtufB-VHb的双酶切及PCR验证图。图5为重组氧化葡萄糖酸杆菌裂解液CO差光谱扫描图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的分子生物学实验方法，均按照常规条件，参照《分子 克隆实验指南》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述条件进行。本发明中，静息细胞是指将在生长培养基上培养至一定时间后的微生物细胞，用 适当的方法收集并用缓冲液进行洗涤，去除营养成分的微生物细胞。实施例1、VHb表达载体的构建1. 1、质粒 pBBR-VHb 的构建根据GenBank中公布的VHb基因vgb的核苷酸序列设计引物，其序列如下VHb-F 5' -CGCTCTAGAAGGAAGACCCTCATGTTAG-3‘；VHb-R 5' -TTACTCGAGCAAAGCCCAATTGGACG-3’ ；以质粒pBR322_vgb (杨凌超，孙爱友等，华东理工大学学报，2006，32 (8) 925-929)为模板，以VHb-F和VHb-R为引物，PCR扩增目的基因，并在两端分别引入)(bal和 XhoI酶切位点(下划线所示)，具体条件如下反应体系Tag酶 0.5 μ 1，10 X buffer 5 μ 1，模板1口 1，dNTP (2. 5mmol/L) 4 μ 1，引 物(10 μ mol/L)各 1. 5 μ 1，ddH20 36. 5 μ 1 ；反应过程94°C5min，94°C 30s，55°C 45s, 72°C 90s，30 个循环，72°C延伸 IOmin0将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在1. 31Λ左右存在明显条带(图1)，符合 预期。用胶回收试剂盒纯化回收1.31Λ左右的DNA片段后，用^CbaI和B10I限制性内切酶 于37°C水浴酶切他，再次电泳胶回收，与同样酶切的具有硫酸庆大霉素抗性基因的广宿主 质粒 pBBRlMCS-5 (Kovach ME, Elzer PH, Hill DS, et al. · Gene，1995，166 175-176)连接， 重组质粒经双酶切及PCR扩增后进行电泳验证，结果如图2所示，其中泳道1为pBBR-VHb双 酶切图谱，泳道2为VHb基因的PCR扩增图谱，在泳道1和2的1. 3kb处均存在明显条带， 确认得到质粒pBBR-VHb。1. 2、质粒 pBBR-PtufB-VHb 的构建根据文献报道的氧化葡萄糖酸杆菌(G. oxydans)的PtufB启动子的核苷酸序列， 设计引物，序列如下PtufB-F 5' -ACTGAGCTCCGATGGTAAGAAATCCACTGC-3’ ；PtufB-R 5' -ATATCTAGACCAAAACCCCGCTCCACC-3’ ；\)X G. oxydans M5 (Yang XP, Wei LJ, Lin JP, et al. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74 :5250-5253)菌株基因组为模板，以 PtufB-F 和 PtufB-R 为引物， PCR扩增，在启动子序列两端分别引入Mel和^CbaI酶切位点，扩增条件如下反应体系Tag酶 0. 5 μ 1，10 X buffer 5 μ 1，模板 1 μ 1，dNTP (2. 5mmol/L) 4 μ 1，引 物(10 μ mol/L)各 1. 5 μ 1，ddH20 36. 5 μ 1 ；反应过程94°C5min，94°C 30s,50°C 30s，72°C 30s，30 个循环，72°C延伸 lOmin。将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在450bp左右存在明显条带(图3)，符 合预期。用胶回收试剂盒纯化回收450bp左右的片段后，用McI和^CbaI限制性内切酶于 37°C水浴酶切他，再次电泳胶回收，与同样酶切的质粒pBBR-VHb连接，转化，重组质粒经双酶切、PCR后进行电泳，结果如图4所示，其中泳道1为重组质粒经McI和BioI双酶切的 电泳图谱，泳道2为以PtufB-F和VHb-R为引物的PCR扩增图谱，泳道1和2的1. 7kb处均 存在明显条带，大小符合预期，确认得到质粒为pBBR-PtufB-VHb。1. 3、氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌G. oxydans M5pBBR-PtufB_VHb的获得将1. 2中获得的重组质粒pBBR-PtufB-VHb先转化至大肠杆菌(E. coli)进行扩 增，然后从重组E. coli提取质粒pBBR-PtufB-VHb，用电转化方法转化至G. oxydans M5， 转化液在30°C摇床复苏3-4h，涂布到含有硫酸庆大霉素(25mg/ml)的山梨醇琼脂平板上， 于30°C培养2-3天后，长出的抗性菌落即阳性转化子。同时转化空质粒pBBRlMCS-5于 G. oxydans M5，得到 G. oxydans M5pBBRlMCS_5 作为空白对照。实施例2、VHb在氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌G. oxydans M5 pBBR-PtufB-VHb 中的表达及鉴定2. KG. oxydans M5 pBBR-PtufB-VHb 的培养方法培养基配方(g/L)山梨醇80，酵母粉 20，(NH4) 2804 5，KH2PO4 1. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，蒸馏水1000mL。培养基于121°C灭菌20min后备用。从山梨醇固体平板上挑取氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的单菌落接种于含有 25 μ g/mL的硫酸庆大霉素的山梨醇培养基试管中，在30°C，250rpm的摇床上培养20h左右 作为种子液，然后按的比例转接于含有100ml同样培养基的500ml三角瓶中，在250rpm 和30°C条件下，振荡培养Mh。2. 2、VHb 定量测定VHb浓度通过一氧化碳差光谱扫描法测定将培养的氧化葡萄糖酸杆菌的基因工 程菌菌液于4°C，8000rpm离心lOmin，弃上清取沉淀，沉淀用50mM、pH7. 5的Tris/HCl缓 冲液洗涤两次，最后重悬于同种缓冲液中。将细菌悬液于冰浴中超声破碎，然后于4°C， IOOOOrpm离心IOmin弃沉淀取上清液。上清液中按5mg/ml的浓度加入连二亚硫酸钠并混 勻，静置5min，然后在其中通CO 3min后，在400-500nm波长下扫描，进行差光谱分析，按消 光系数E419_436nm = 27^1^1计算VHb的含量。由图5的CO差光谱扫描图可以看出，重组了 vgb基因的氧化葡萄糖酸杆菌 G. oxydans M5 pBBR-PtufB-VHb的上清液在419nm处有明显的吸收峰，而空白对照菌 G. oxydans M5 pBBRlMCS-5的上清液在419nm没有吸收峰，这说明VHb蛋白已在G. oxydans M5中表达，通过计算可得，每克湿菌体含有VHb 19nmoL·实施例3、氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌在限氧和非限氧培养条件下的生长通过不同的培养基瓶装量和培养时摇床转速来实现氧化葡萄糖酸杆菌的基因工 程菌的限氧和非限氧培养。在250ml三角瓶中装100ml培养基，在150rpm转速下培养定为 限氧培养；在250ml三角瓶中装50ml培养基并在250rpm转速下培养定为非限氧培养。按2. 1的方法培养种子，按的接种量接种于上述含不同装量山梨醇培养基的 三角瓶中，置于30°C、150rpm和30°C、250rpm转速的摇床中培养，每隔4h取样一次，用山梨 醇新鲜培养基稀释OD值至0. 2-0. 6间，以新鲜山梨醇培养基做对照，在600nm下测定吸光 值，比较VHb表达菌株和空白对照菌株G. oxydans M5pBBRlMCS_5的菌体浓度。如表1中的结果所示，VHb的表达可以促进氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌的生 长。通过计算，在非限氧培养条件下培养氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌24h后，VHb表达菌的菌体浓度比对照菌的菌体浓度提高了 12. 69%，在限氧培养条件下这种影响更加显著， 菌体浓度提高至23.沈％。表1、基因工程菌在限氧和非限氧培养条件下的菌体浓度(OD)培养时间(h)6121824150rpm IOOml对照0.350.981.742.15VHb表达菌株0.381.322.122.65250rpm 50ml对照0.482.033.724.57VHb表达菌株0.522.174.215.15实施例4、氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌静息细胞转化甘油生产1，3-二羟基丙 酮4. 1、氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌静息细胞的制备按2. 1的方法培养24h的细胞在4°C，8000rpm离心lOmin，所得菌体用50mM，pH6. O 的磷酸缓冲液洗涤两次，经过洗涤后所得的细胞即为用来催化的静息细胞。4.2,1,3- 二羟基丙酮浓度的测量方法称取0.6g 二苯胺，溶于5細1冰醋酸中，然后加入6ml 98%的浓硫酸制成二苯胺显 色液。取0. 5ml稀释至50-300ug/ml的1，3_ 二羟基丙酮转化液，加入4. 5ml显色液，于密 闭试管中水浴煮沸20min，迅速置于冷水中冷却后，以不加转化液的同样处理的显色液做对 照，于615nm波长下测定吸光值，根据1，3-二羟丙酮标准曲线计算其浓度。4.3、VHb表达对氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌转化甘油生成1，3-二羟基丙酮 的影响配制含甘油40g/L的200mM，pH6. O的磷酸缓冲液作为反应液。称量100mg4. 1中 制备的静息细胞置于25ml三角瓶中，加入5ml反应液，均勻悬浮细胞，分别于30°C，150rpm 和30°C，250rpm的摇床内转化Mh，定时取样，测量1，3-二羟丙酮的浓度，比较在限氧和非 限氧条件下，VHb表达对氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌转化甘油生成1，3_ 二羟基丙酮的影响。表2、氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌在不同转化条件下生成1，3_ 二羟丙酮的浓度(g/L)转化时间(h)6121824150rpm对照2.45.777.878.97VHb表达菌株2.687.329.6111.08250rpm对照5.4610.3613.8415.71VHb表达菌株6.1411.715.4217.97
如表2中的结果所示，VHb基因的表达明显促进氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌 转化甘油生成1，3- 二羟基丙酮，通过计算，经过24h的转化后，在限氧和非限氧条件下，VHb 表达菌组生成的1，3_ 二羟基丙酮的最终浓度比对照菌组生成的1，3_ 二羟基丙酮的最终浓 度分别提高23. 52%和14. 39%。综上所述，本发明所构建的表达VHb的氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌，通过VHb 的表达，可在保持现有设备和能耗压力不变的情况下，提高细胞生物量及催化产物的产量， 为解决氧化葡萄糖酸杆菌在细胞培养和催化过程中的供氧不足问题提供一条有效的途径。序列表<110>华东理工大学<120> 一种氧化葡萄糖酸杆菌(G. oxydans)的基因工程菌及其应用<130>P5091050<140>200910196972· 1<141>2009-10-10<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>28<212>DNA<213> 引物<400>1cgctctagaa ggaagaccct catgttag28<210>2<211>26<212>DNA<213> 引物<400>2ttactcgagc aaagcccaat tggacg26<210>3<211>30<212>DNA<213> 引物<400>3actgagctcc gatggtaaga aatccactgc30<210>4<211>27<212>DNA<213> 引物<400>4atatctagac caaaaccccg ctccacc2权利要求
1.一种重组质粒PBBR-PtufB-VHb,其特征在于所述重组质粒由透明颤菌血红蛋白基 因vgb、氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)的PtufB启动子以及合适的载体构成。
2.根据权利要求1所述的重组质粒pBBR-PtufB-VHb，其特征在于所述载体为广宿主 质粒 pBBRlMCS-5。
3.根据权利要求1所述的重组质粒pBBR-PtufB-VHb的构建方法，其特征在于包括以下 步骤A、扩增透明颤菌血红蛋白基因vgb，将其连入合适的载体，获得质粒pBBR-VHb；B、扩增氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)的PtufB启动子，连入质粒pBBR-VHb，获得重组 质粒 pBBR-PtufB-VHb。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述载体为广宿主质粒pBBRlMCS-5。
5.一种氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)的基因工程菌，其特征在于所述工程菌通过 将权利要求1或2所述的重组质粒pBBR-PtufB-VHb转入氧化葡萄糖酸杆菌(G. oxydans) 而获得。
6.一种氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以 下步骤A、扩增透明颤菌血红蛋白基因vgb，将其连入合适的载体，获得质粒pBBR-VHb；B、扩增氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)的PtufB启动子，连入质粒pBBR-VHb，获得重组 质粒 pBBR-PtufB-VHb。C、将重组质粒pBBR-PtufB-VHb转化至氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)，获得氧化葡萄 糖酸杆菌(G. oxydans)的基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述重组质粒pBBR-PtufB-VHb在转化氧 化葡萄糖酸杆菌(G. oxydans)前先使用大肠杆菌(E. Coli)进行扩增。
8.根据权利要求5所述的氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)的基因工程菌的应用，其特 征在于在生长过程中可表达透明颤菌血红蛋白VHb。
9.根据权利要求5所述的氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)的基因工程菌的应用，其特 征在于用于转化甘油生产1，3-二羟基丙酮。
全文摘要
本发明公开了一种用于在胞内表达透明颤菌血红蛋白的重组质粒、该重组质粒的构建方法，一种氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)的基因工程菌、该工程菌的构建方法及其应用。本发明的重组质粒由透明颤菌血红蛋白基因vgb、氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)的PtufB启动子以及合适的载体构成，所述基因工程菌由所述重组质粒转化宿主菌获得。本发明的基因工程菌可在胞内表达透明颤菌血红蛋白，可用于在保持现有设备和能耗压力不变的情况下，提高细胞生物量及催化产物1，3-二羟丙酮的产量，为解决氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)在细胞培养和催化过程中的供氧不足问题提供一条有效的途径。
文档编号C12N15/63GK102041264SQ20091019697
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月10日 优先权日2009年10月10日
发明者吴建, 李明华, 林金萍, 魏东芝 申请人:华东理工大学