专利名称：一种解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑 制效应的方法。
背景技术：
由于石油资源的有限性以及国际原油价格的波动性，利用可再生资源制造生物能 源已受到世界各国的普遍重视。丁醇由于其优良的燃烧特性及较乙醇更优的储存运输特 性，有望在将来成为新一代生物燃料。自二战以来随着石油工业的发展，生物丁醇发酵由于 其较高的原料成本，其大规模发酵一直处于停滞状态，而且随着近年来粮食价格的不断上 涨及国家相关粮食安全战略的制定，采用粮食发酵生产燃料丁醇已受到严格限制。丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum是能够发酵产生丁醇的四种梭菌之 一 (Keis et al.，Int J Syst Evol Microbiol, Issue 6，Vol 51，2001)，在发酵过程中产 生丁醇、丙酮、乙醇、乙酸和丁酸。利用丙酮丁醇梭菌发酵生产丙酮、丁醇的历史已经有上百 年。Clostridium acetobutylicum除了能够利用葡萄糖、蔗糖、淀粉外，还能利用木糖、乳 糖、阿拉伯糖等多种碳源。纤维素和半纤维素水解后的主要成分就是葡萄糖、木糖及阿拉伯 糖，因而可以利用纤维素和半纤维素为原料进行生物丁醇发酵。纤维素和半纤维素在自然 界中占到植物界碳素的50%以上，利用纤维素和半纤维素水解液进行生物丁醇发酵，有望 大大降低原料成本。但丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum像很多其他细菌一样 存在着糖代谢物阻遏效应(carboncatabolite repression, CCR)，即在葡萄糖存在条件下， 其代谢产物阻遏了其他糖类的利用。目前的丙酮丁醇梭菌只能将木质纤维素水解液中的葡 萄糖利用完全，而木糖、阿拉伯糖等五碳糖的利用受到抑制，因此解除CCR效应成为木质纤 维素原料应用于丙酮丁醇发酵的关键技术之一。C. acetobutylicum属于革兰氏阳性菌，GC含量30 %，2001年完成全基因组测序 (Nolling et al.，J Bacteriol, Issue 16, Vol 183，2001)，其中含有 ccpA 基因，该基因在 NCBI核酸数据库查询号为gi :1119220o CCR效应在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtitles)中 得到了较多的研究，而在丙酮丁醇梭菌中的研究很少。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法，从而能 同步利用葡萄糖和木糖发酵生产丙酮、丁醇、乙醇。本发明提供的方法，通过抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达实现。根据本发明的一个优选实施例，通过在丙酮丁醇梭菌ccpA基因中插入DNA片段可 实现本发明。本发明还有一个目的在于，提供一种丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达被抑制的 Clostridium acetobutylicum 重组菌株。根据本发明的一个优选实施例，本发明提供的重组菌株的基因组中丙酮丁醇梭菌ccpA基因中已插入DNA片段。本发明还有一个目的在于，提供该重组菌株用于同步利用葡萄糖-木糖混合糖发 酵生产丙酮、丁醇、乙醇的应用。本发明还有一个目的在于，提供一种提高丙酮丁醇梭菌利用葡萄糖-木糖混合糖 发酵生产丙酮、丁醇、乙醇能力的方法。本发明提供的方法通过抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达实现。本发明中所指的“抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达”，既可以是降低丙酮丁醇梭 菌ccpA基因表达量，也可以是使丙酮丁醇梭菌ccpA基因不表达或不能表达出正确的蛋白 质。根据本发明的一个优选实施例，中断丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达，能解除丙酮丁 醇梭菌葡萄糖抑制效应。根据本发明，丙酮丁醇梭菌ccpA基因的中断，可采用二类内含子插入技术在该基 因内部的任何位点插入DNA实现；也可通过同源重组中断ccpA基因，用于中断ccpA基因的 插入片段可在ccpA基因中的任意位点插入，只需要能使ccpA基因表达被中断或抑制即可； 还可以通过同源重组敲除ccpA部分或全部序列实现，只要能使得ccpA基因的表达被中断 或表达出不完整的ccpA蛋白即可。上述三种方法用于将ccpA基因失活，除此之外还可以 采用反义核酸技术抑制ccpA基因的表达，将ccpA表达量下调。实现上述目的的方法在本 领域中为一般技术人员所熟知，因此在此不具体描述。根据本发明，“重组质粒载体”指的是用于敲除ccpA基因的重组质粒载体，该载体 应理解为具有与ccpA基因的特定序列进行特异位点配对序列的重组质粒载体，在上述重 组质粒载体中包括用于对ccpA基因进行特异性敲除的片段。本发明提供的Clostridium acetobutylicum重组菌株的基因组中的ccpA基因表 达被抑制，不能表达出具有完整结构的CcpA蛋白。本发明提供的重组菌株，解除了葡萄糖抑制效应，能同步利用葡萄糖-木糖进行 发酵，但不限于仅能利用葡萄糖-木糖进行发酵，也可利用受葡萄糖代谢物抑制的其他糖 类进行发酵，其中，使用的葡萄糖-木糖既可以是直接使用葡萄糖和木糖配制获得的葡萄 糖-木糖，也可以是发酵或水解高分子化合物，如水解纤维素或半纤维素等，获得的葡萄 糖-木糖。根据本发明，使用的重组菌株，既可以是本发明提供的抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基 因表达的菌株，也可以是根据本发明的教导和现有技术，制备的其他的抑制丙酮丁醇梭菌 ccpA基因表达的菌株，如采用反义核酸技术降低ccpA表达量的菌株。本发明的实施例中，使用的重组质粒载体pSY6-ccpA指的是用于敲除ccpA基因的 重组质粒载体，其中，使用的ccpA-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBSld位点碱基经修 改后，用于敲除ccpA基因的片段，该片段属于Li. LtrB内含子一部分，所述的Li. LtrB 二类 内含子为原核二类内含子，其中包含ItrA基因，但在重复本发明的试验时，可以选取其他 插入位点进行试验，甚至还可以不使用重组质粒载体进行试验，只要能在ccpA基因中插入 核酸片段以中断ccpA基因的表达即可。本发明提供的重组菌株能同步利用葡萄糖-木糖混合糖进行发酵，以用于生产丙 酮、丁醇、乙醇。
本发明提供的提高丙酮丁醇梭菌利用葡萄糖-木糖混合糖发酵生产丙酮、丁醇、 乙醇能力的方法，通过抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达实现。本发明提供的方法，中断了丙酮丁醇梭菌ccpA的表达，本发明提供的菌株中， ccpA经二类内含子插入失活后的菌株同步利用葡萄糖和木糖的能力显著提高，同时转化生 成的ABE浓度相应提高。本发明构建的工程菌株解除了葡萄糖抑制效应，能同步利用葡萄 糖-木糖进行发酵，因此该菌株有利用木质纤维素水解液进行丙酮丁醇发酵的潜力。
图1为ccpA中断菌株的菌落PCR鉴定的凝胶电泳检测结果，其中，NC表示未加模 板的阴性对照，WT所用的模板为C. acetobutylicum ATCC 824的基因组，ccpAmutant的模 板分别为转化子 8 AccpA 1-3，marker 为 Ikb DNA ladder。图 2 为发酵 0-72hr 的 Clostridium acetobutylicum Clostridiumacetobutylicum ATCC 824 的 0D600 的检测结果。图 3 为发酵 0-72hr 的 Clostridium acetobutylicum Clostridiumacetobutylicum ATCC 824 的残糖含量的检测结果。图 4 为发酵 0-72hr 的 Clostridium acetobutylicum Clostridiumacetobutylicum ATCC 8 的 ABE 含量的检测结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人， 分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明的下述实施例中，使用的菌株Clostridium acetobutylicum ATCC 8 含 有的ccpA基因是现有技术已知的，其在NCBI核酸数据库查询号为gi :1119220。本发明的下述实施例中，ABE为丙酮、丁醇、乙醇(Acetone-butanol-ethanol)的 简称，ABE浓度指的是溶液中丙酮、丁醇、乙醇的总浓度。本发明的下述实施例中，重组质粒载体pSY6-ccpA指的是用于敲除ccpA基因的重 组质粒载体，其中，使用的ccpA-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBSld位点碱基经修改 后，用于敲除ccpA基因的片段，该片段属于Li. LtrB内含子一部分，所述的Li. LtrB 二类内 含子为原核二类内含子，其中包含ItrA基因。本发明使用的菌株和质粒分别为质粒pSY6(Shao L.，Hu S.，Yang Y.，Chen J.，Yang Y, Jiang W, Yang S, Cellresearch, 2007, doi :10. 1038/cr. 2007. 91)，为俄 Ε. coli 和 C. acetobutylicum 的穿梭 质粒，在C. acetobutylicum中表达红霉素抗性基因，该质粒的序列见SEQ ID N0. :6。质粒pANSl，序列见SEQ ID N0. :7，含壮观霉素抗性基因；菌株俄E. coli ER2275 购自 New England Biolabs 公司。本发明中使用的PCR纯化和DNA凝胶回收纯化试剂盒均购自华舜生物制品有限公ccpA-突变株和 ccpA-突变株和 ccpA-突变株和 Gene Knockout System(TAOlOO)Kit 购自 Sigma-Aldrich 公司，基因组抽 提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。在本发明的下述实施例中，使用的培养基和缓冲液如下CGM 培养基配方如下(Joseph W. Roos et al, Biotechnology and Bioengineering, P681-694, Vol 557,1985) :2g (NH4) 2S04，Ig K2HPO4 · 3H20，0. 5g KH2PO4, 0. IgMgSO4 ·7Η20，0· 015g FeSO4 ·7Η20，0. Olg CaCl2,0. Olg MnSO4 ·Η20，0. 002g CoCl2,0. 002g ZnSO4, 2g Tryptone, Ig Yeast Extraction, 50g Glucose，2%琼月旨溶于 lL/jC中。P2 培养基的配制方法如下(F. Monot et al, Appl Environ Microbiol, Issue 6， Vol44,1982)溶液1 :40g D-葡萄糖，20g D-木糖，加H2O定溶至850mL ；溶液2 =NH4Ac 2. 2g, K2HPO4 · 3H20 0. 5g, KH2PO4 0. 5g,加 H2O 定溶至 IOOmL ；溶液3 2. Og MgSO4 · 7H20，0. Ig MnSO4 · H20,0. Ig NaCl,0. Ig FeSO4 · 7Η20 ；溶液 4 :100ml 蒸馏水中加入 IOOmg 氨基苯酸(p—aminobenzoic acid)，IOOmg 维生 素 Bl (thiamine)，Img 生物素(biotin)；溶液1和溶液2高温湿热灭菌，溶液3和溶液4过滤除菌，溶液1和溶液2冷却后 混合均勻，再加入IOmL溶液3和ImL溶液4，混勻后分装成95mL/瓶，配制培养基时在培养 体系中添加CaCO3,以过滤除菌队排除瓶中的空气。ETM 缓冲液配方如下270mM 蔗糖，0. 6mM Na2HPO4,4. 4mM NaH2PO4,10mMMgCl2。ET 缓冲液配方如下270mM 蔗糖，0. 6mM Na2HPO4,4. 4mM NaH2PO4。本发明使用的限制性内切酶，Taq DNA聚合酶，T4DNA连接酶和小牛碱性磷酸酶 (CIAP)均购自TaKaRa公司，KOD plus DNA聚合酶购自iToyobo公司。其他常规试剂均为国产或进口分装。本发明通过PCR扩增用于中断ccpA基因的targetron片断，然后经Xho I及BsrGI 双酶切并与经同样酶切的PSY6载体连接，得到中断质粒pSY6-ccpA，电转Clostridium acetobutylicumATCC 824，然后经菌落PCR鉴定出有内含子插入到基因组中的重组菌，并 经测序验证在ccpA基因的816-817bp间插入了 Li. LtrB内含子片段，经发酵验证确定ccpA 基因经插入失活后解除了葡萄糖抑制效应，能够同步利用葡萄糖-木糖混合碳源进行ABE 发酵，具体如下述实施例所示。实施例1、构建pSY6_ccpA质粒载体通过PCR扩增ccpA targetron片断，然后使用BioI和BsrG I进行双酶切，并与 同样经BioI和BsrG I酶切的pSY6载体连接，得到中断质粒pSY6-ccpA，其中，PCR扩增 ccpA targetron的模板及引物设计方法来源于Sigma-Aldrich公司的Targetron Gene Knockout System(TAOlOO) Kit，具体步骤如下1.1、引物设计参考Targetron Gene Knockout System(TAOlOO)Kit 提供的方法，分别设计引 物 ccpA-IBS(如序列 SEQ ID N0. 1 所示)、ccpA-EBSld(如序列 SEQ ID NO. :2 所示)禾口 ccpA-EBS2 (如序列SEQ ID NO. :3所示)，用于构建pSY6_ccpA质粒载体。PCR 扩增需要的 raS universal 由 Targetron Gene Knockout System(TAOlOO) Kit自带。6
1.2、PCR 扩增使用Sigma-Aldrich 的 Targetron Gene Knockout System(TAOlOO)Kit 进行PCR 扩增，扩增需要的模板和试剂由试剂盒提供，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用华 舜公司的胶回收试剂盒纯化回收350bp处的条带。1. 3、构建pSY6-ccpA重组质粒载体使用Bio I及BsrGI分别酶切载体pSY6和ccpA-targetron片段，然后使用华舜 公司的胶回收试剂盒纯化回收酶切后产物。将酶切后的ccpA-targetron片段与酶切后的载体片段使用T4DNA连接酶连接， 该连接反应在16°C水浴锅中进行10hr，将获得的连接产物以CaCl2热休克法转化E. coli DH5 α感受态细胞42°C热击90sec，然后添加4°C LB液体培养基复苏lhr，然后将细胞 以4500rpm离心5min，涂布到含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上培养 16-18hr0对获得的菌落进行菌落PCR，以检测350bp的targetron片段是否连接入pSY6载 体中，PCR扩增引物为IBS和EBSld0PCR检测结果显示，菌落PCR可以扩增出350bp特异性条带。随即挑取PCR呈阳性 的菌落以LB液体培养基扩陪，提取质粒。然后，以pIMPl-seq-for (如SEQ ID NO :9所示)作为引物，提取的质粒pSY6_ccpA 作为模板进行测序，测序结果如SEQ ID NO :10所示，其中196-244bp为IBS序列，485-544bp 为EBSld序列，为IBS2序列。根据SEQ ID NO 10的结果，扩增得到的350bp序列含有目的突变位点，因此，连接 产物转化E. coli DH5a感受态细胞后获得的阳性转化子含有重组质粒pSY6-ccpA。实施例 2、Clostridium acetobutylicum ccpA-突变株的构建与检测将pSY6_ccpA质粒经E. coli ER2275/pANSl在Cac8I位点甲基化后，电转 Clostridium acetobutylicum ATCC 824，复苏过夜后，取200 μ 1 细胞液涂布于加有40 μ g/ mL红霉素的CGM平板上，在厌氧箱内37°C培养48-96小时后，挑取单菌进行菌落PCR验证， 具体过程如下2. l、pSY6_ccpA 质粒的甲基化为防止外源DNA进入c. acetobutylicum后被其限制系统切割降解，pSY6_ccpA质 粒需甲基化(MermeIstein, L. D and Papoutsakis, Ε. Τ. Appl Environ Microbiol. vol59. issue 4.page 1077-81)。将pANSl质粒以CaCl2热休克法转化入Ε. coli ER2275，获得菌株Ε. coliER2275/ pANSl。将抽提获得的pSY6-ccpA质粒转化入Ε. coli ER2275/pANSl感受态细胞，由于 pANSl质粒具有壮观霉素抗性，因此涂布于含有100 μ g/mL氨苄青霉素和50 μ g/mL壮观 霉素的LB培养基平板上培养过夜后，挑取单菌落接至4mL添加有100 μ g/mL氨苄青霉素 和50 μ g/mL壮观霉素的LB液体培养基中过夜培养，获得含pANSl及pSY6-ccpA的E. coli ER2275，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，将抽提获得的质粒使用&itl酶切验证(以未转化入 E. coli ER2275/pANSl 的 pSY6_ccpA 为对照；satl 为 Cac824I 的同裂酶，与 Cac824I 具有相 同的识别位点)，酶切结果显示，经上述处理的质粒pSY6-ccpA不能被MtI酶切，而对照可被MtI酶切，根据酶切结果，经上述处理的质粒pSY6-ccpA的Cac824I酶切位点被甲基化 而不被clostridiumacetobutylicum的限制系统所识别。2. 2、pSY6-ccpA 质粒电转入 Clostridium acetobutylicum ATCC 824将C. acetobutylicum ATCC 824于CGM培养基平板上划线培养48hr后，挑取单菌 落接入5mL CGM液体培养基中培养l^ir，再按接种量接入50mL CGM液体培养基中培 养，当培养菌体的0D600达到0. 6-0. 7之间时取出培养菌，用于制备电转感受态细胞。取 30mL菌液，于4°C、4500rpm离心lOmin，弃上清，加入30mL4°C的ETM缓冲液悬浮，再于4°C、 4500rpm离心lOmin，弃上清，加入3mL 4°C的ET缓冲液，获得悬浮菌液。取上述悬浮菌液180 μ L，加入20 μ L (约1 3 μ g) pSY6-ccpA甲基化质粒(冰上 操作)，混勻后转入电转杯中Omrn直径)，使用Bio-Rad MicroPulser 电转仪电转，电压 2. OkV，其余参考使用手册，电击后迅速加入常温的CGM培养基lmL，于37°C培养8hr后，取 200 μ L细胞液涂布于加有40 μ g/mL红霉素的CGM平板上，于厌氧箱内37°C培养约2_4天。2. 3、菌落 PCR 验证pSY6_ccpA质粒转化入C. acetobutylicum ATCC 8 中后，可能会将二类内含子 的部分序列插入到基因组的ccpA基因中，是否有内含子插入可以使用插入位点上下游的 引物，通过菌落PCR加以验证(未插入内含子的野生型菌将扩增出219bp的条带，插入有内 含子的重组菌株将扩增出的条带为1133bp条带)，因此，随机挑取三个转化子(分别命名 为8MACCpA 1-3)进行验证，其中，以C. acetobutylicumATCC拟4基因组为负对照，具体 过程如下PCR反应使用的引物为CCPA (ID)-FW和CCPA (ID)-REV，其序列分别如SEQID No. 4 和 SEQ ID No. 5 所示；PCR反应体系与实施例1相同；PCR 反应条件95°C 5min ；95 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 1. 5min，30 个循环；72 °C 5min。将PCR反应获得的产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。根据图1的结果，得到的三个转化子均为插入了内含子的突变体。2. 4、测序验证阳性转化子随机挑取步骤2. 3中对应于图1中标记为4的阳性转化子，以加有40 μ g/mL红 霉素的CGM液体培养基培养后，抽提基因组。以抽提的基因组为模板，以CCPA(ID)-FW和 CCPA(ID)-REv为引物对进行PCR扩增，回收扩增获得的1. IkbDNA条带并测序，结果如SEQ ID N0. 8所示，测序结果显示，该序列的817-1731位点的DNA为插入的内含子序列，即内 含子序列精确地插入到预计的816 I 817位点之间。实施例 3、Clostridium acetobutylicum ccpA-突变株的发酵取步骤2. 2中获得的中断了 ccpA基因的Clostridium acetobutylicum菌株 Clostridium acetobutylicum ccpA_在P2培养基中发酵，并检测发酵液，具体过程如下从CGM平板上挑取单菌接入5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以1 %接种量接入 50mL CGM培养基中，培养8 IOhr菌浓0D600达到0. 4，以5%接入P2培养基中培养发 酵，并于0，12，25，34，48，60，72时取发酵液，检测0D600 (结果如图2所示)，残糖含量(使 用WATERS公司的sugar-pak柱经Agela 1200HPLC测定，结果如图3所示)以及丙酮、丁醇和乙醇含量(使用Agela 7890A气相色谱仪测定，结果如图4所示)，并以Clostridium acetobutylicum ATCC 8 作为对照，其中，测定发酵液中的残糖含量和丙酮、丁醇和乙醇 含量前需进行如下预处理发酵液经离心后分别取上清液测定残糖和丙酮、丁醇、乙醇上清液以H2O经20倍 稀释后用于残糖测定；400 μ L上清液与100 μ L内标混合均勻测定丙酮、丁醇和乙醇(内标 配方为25g异丁醇，5g异丁酸，50mL 37%浓盐酸，加水定容至1L)。根据图3的结果，ccpA基因经插入失活后，实现了葡萄糖和木糖的同步利用，发酵 60hr可以使20g/L的木糖利用81%，产率为0. ^g/L/hr，而野生型经60hr发酵仅能利用 12 %，产率为0. 04g/L/hr, ccpA突变后木糖利用能力提高6倍。可见ccpA经插入失活后解 除了葡萄糖抑制效应。根据图4的结果，ccpA突变菌株发酵液中的丙酮、丁醇和乙醇的终浓度均高于野 生菌株。综上所述，本发明提供的方法，中断了丙酮丁醇梭菌中ccpA基因的表达，本发明 提供的菌株中，ccpA基因经二类内含子插入失活后的菌株同步利用葡萄糖和木糖的能力显 著提高，同时转化生成的ABE浓度相应提高。本发明构建的工程菌株解除了葡萄糖抑制效 应，能同步利用葡萄糖-木糖进行发酵，因此该菌株有利用木质纤维素水解液进行丙酮丁 醇发酵的潜力。序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120> 一种解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法<130>P5091068<160>10<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>53<212>DNA<213> 引物<400>1aaaactcgag ataattatcc ttaaaggacg tagatgtgcg cccagatagg gtg53<210>2<211>60<212>DNA<213> 引物<400>2cagattgtac aaatgtggtg ataacagata agtcgtagat gttaacttac ctttctttgt60<210>3<211>49<212>DNA<213> 引物0112]<400>30113]tgaacgcaag tttctaattt cggtttccttccgatagagg aaagtgtct490114]<210>40115]<211>200116]<212>DNA0117]<213>引物0118]<400>40119]gatggaacag acggaataaa200120]<210>50121]<211>220122]<212>DNA0123]<213>引物0124]<400>50125]atcccatatc gtaagtaggt tg220126]<210>60127]<211>80320128]<212>DNA0129]<213> 质粒 pSY60130]<400>60131]tcgagataattatccttacc agcccatagggtgcgcccagatagggtgttaagtcaagta600132]gtttaaggtactactctgta agataacacagaaaacagccaacctaaccgaaaagcgaaa1200133]gctgatacgggaacagagca cggttggaaagcgatgagttacctaaagacaatcgggtac1800134]gactgagtcgcaatgttaat cagatataaggtataagttgtgtttactgaacgcaagttt2400135]ctaatttcggttgctggtcg atagaggaaagtgtctgaaacctctagtacaaagaaaggt3000136]aagttaagcctatggactta tctgttatcaccacatttgtacaatctgtaggagaaccta3600137]tgggaacgaaacgaaagcga tgccgagaatctgaatttaccaagacttaacactaactgg4200138]ggataccctaaacaagaatg cctaatagaaaggaggaaaaaggctatagcactagagctt4800139]gaaaatcttgcaagggtacg gagtactcgtagtagtctgagaagggtaacgccctttaca5400140]tggcaaaggggtacagttat tgtgtactaa￡1￡Ι ￡1￡1￡1￡1￡Ι tgattagggaggaaaacctc6000141]aaaatgaaaccaacaatggc aattttagaaagaatcagta￡1￡1￡1￡CclCclagaaaatata6600142]gacgaagtttttacaagact ttatcgttatcttttacgtccagatatttattacgtggcg7200143]acgcgttgggaaatggcaat gatagcgaaacaacgtaaaactcttgttgtatgctttcat7800144]tgtcatcgtcacgtgattca taaacacaagtgaatgtcgacagtgaatttttacgaacga8400145]acaataacagagccgtatac tccgagaggggtacgtacggttcccgaagagggtggtgca9000146]aaccagtcacagtaatgtga acaaggcggtacctccctacttcaccatatcattttctgc9600147]agccccctagaaataatttt gtttaactttaagaaggaga ￡Ι ￡10￡Ι ￡Ι ￡1tggctagatc10200148]gtccattccgacagcatcgc cagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatg10800149]caatttctatgcactcgtag tagtctgagaagggtaacgccctttacatggcaaaggggt11400150]acagttattgtgtactaaaa ttaaaaattgattagggagg￡l￡l￡l￡lCCtC￡l￡laatgaaacca120010
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〈213〉质粒 pANSl<400>7gtcgactctagaggatcccccatatgcaagattagaatgaatatttcccaccaccattttttcaatttttttataatttttttcattagtccattcaataaaaattctctccctatgttctaatggagaatttggtatgattttacccgtgtccatagttttggtttcatcatcctgataattatctattctcacatcagaaaatggaatatcaggtagtcttttattttttcgttttgcttggtaaagctgaggaatgtatccttgttcataaagctctttgggaggatgattccacggtaccatttctcgtaagttgcttttatctcctatttttttttctttactttgatctgtcaatggttcagatggttttagtccactctcaactcctgatccaaaatgtttccgaagtatttttttcactttactcctcactattttgattagtacctattttatttagtttatttatagatttcattggctttagttaattttattctagattatatatgatagtgtaaacctattcattgt 3.3.3.3.3. 3.atagttattataacatgtattcacgaacgaacggtctggttataggtacattgagcaacttgccattgggatatatcaacggtggtatatttagctcctgaaaatctcga133C C 3.3.3.3.tggtgaaagttggaacctcttacgtgccgacagggcttcccggtatcaacagggacaccagtcacaggtatttattcggcgcaaagtgcgtgtatgatggtgtttttgaggtgctccagtttcagctactgacggggtggtgcgtaacgggagtgtatactggcttactatgttggcactgcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtccttcctcgctcactgactcgctacgctcggacgaacggggcggagatttcctggaagatgggccgcggcaaagccgtttttccataggctacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgactggcggctccctcgtgcgctctcctgttccgttatggccgcgtttgtctcattccacgccccaagctggactgtatgcacgaaccccccgggtttattgttttctaaaatctgattacca60Q-Q-X^Q-Q-Q-Q-CQ-Q-aaaaattgaaaaaagtgttt120tttaatctgt 3. 3.3.3. 3.gtttatagtt180ttctctccaagataactacgaactgctaac240gattcagccactgcatttcccgcaatatct3003.3.3.3. C 3. 3. Cggcataaagttaatatagag360aattcctctgacgaatccataatggctctt420aattcctctaagtcataatttccgtatatt480attatggttaaatctgaatttaattccttc540tgtaaccattctccataaataaattcttgt600tgctgaataataattgttaattcaatatat660gaaataggtctaattttttgtataagtatt720acgacgactaaaaagtcaagatcactattt780aacatgtaagtaccaataaggttatttttt840ttaatttgttcgtatgtattcaaatatatc900atatccatagttgttaatta960ctaaattttttatctagataataattattt1020atgatctttcatttccataaaactaaagta1080tctcttgccagtcacgttacgttattagtt1140aaatcgatgggctgcaggaattcgatctga1200gactgaaatgcctcaaaatgttctttacga1260ccagtgatttttttctccattttagcttcc1320aatacgcccggtagtgatcttatttcatta1380tcaacgtctcattttcgccaaaagttggcc1440ggatttatttattctgcgaagtgatcttcc1500tcgggtgatgctgccaacttactgatttag1560ggcttctgtttctatcagctgtccctcctg1620caaaagcaccgccggacatcagcgctagcg1680gatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtg1740agcagaatatgtgatacaggatatattccg1800tcgttcgactgcggcgagcggaaatggctt1860ccaggaagatacttaacagggaagtgagag1920ccgcccccctgacaagcatcacgaaatctg1980aggactataaagataccaggcgtttccccc2040tgcctttcggtttaccggtgtcattccgct2100tgacactcagttccgggtaggcagttcgct2160ttcagtccgaccgctgcgccttatccggta2220
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1.一种解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法，其特征在于，所述方法通过抑制丙 酮丁醇梭菌的CcpA基因表达实现。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达通过 中断丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达实现。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述中断丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达通过 在丙酮丁醇梭菌ccpA基因中插入DNA片段实现。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述丙酮丁醇梭菌为 Clostridium acetobutylicum ATCC 824。
5.一种Clostridium acetobutylicum重组菌株，其特征在于，所述菌株的基因组中丙 酮丁醇梭菌的ccpA基因表达被抑制。
6.如权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株的丙酮丁醇梭菌ccpA基因表 达被中断。
7.如权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株的的丙酮丁醇梭菌ccpA基因 中插入DNA片段。
8.如权利要求5-7中任一项所述的重组菌株用于生产丙酮、丁醇、乙醇的应用，其特征 在于，所述菌株同步利用葡萄糖-木糖混合糖进行发酵。
9.一种提高丙酮丁醇梭菌利用葡萄糖-木糖混合糖发酵生产丙酮、丁醇、乙醇能力的 方法，其特征在于，所述方法通过抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达实现。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达通过 中断丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达实现。
全文摘要
本发明提供了一种解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法，以及一种基因组中丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达被抑制的重组菌株。本发明提供的解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法通过抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达来实现。使用本发明提供的方法，中断了丙酮丁醇梭菌ccpA基因的表达。本发明提供的菌株中，ccpA基因经二类内含子插入失活后菌株同步利用木糖和葡萄糖的能力显著提高，同时转化生成的ABE浓度相应提高。本发明构建的工程菌株解除了葡萄糖抑制效应，能同步利用葡萄糖和木糖进行发酵，因此该菌株有利用木质纤维素水解液进行丙酮丁醇发酵的潜力。
文档编号C12N15/74GK102041267SQ20091019728
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月16日 优先权日2009年10月16日
发明者任聪, 姜卫红, 杨晟, 胡世元, 顾阳 申请人:中国科学院上海生命科学研究院