专利名称：复合载体混合固定酵母菌发酵烟草下脚料制备乙醇的方法
技术领域：
本发明属烟草下脚料制备乙醇的技术领域，特别是涉及一种复合载体混合固定酵母菌发酵烟草下脚料制备乙醇的方法。
背景技术：
能源危机日益加剧，许多国家开始致力于开发各种可再生能源。生物质乙醇以其清洁性以及生物质能源在地球上存在的广泛性而引起了人们的特别关注。大部分的生物质乙醇发酵的原料是以甘蔗，甜菜和陈化粮为主，但仅限于不危害国家安全的前提下。利用废弃物发酵制取乙醇可以"一举两得"不仅能够带来环境的效益，还能够达到废弃物资源利用化的目的。
中国烟叶种植面积和年产量均居世界首位。在烟草种植和生产过程中，有大量的低次
烟叶和烟梗被废弃，大约占烟叶总产量的25%。如2002年全国有6.116X105t的废弃烟叶。由于烟叶中含有许多有用的成分，废弃烟叶的资源化利用研究日益受到人们的重视。国内外学者偏重于废弃烟叶中烟碱、茄尼醇、氨基酸、有机酸等的分析提取研究。但是，烟叶中含量最丰富的化合物是糖类。据测定，烟叶总糖平均占29.85%，最大值达到41.96%，还原糖占26.50% (以葡萄糖计，还原糖占16% 22%)，最大值达到38.99%。
现有的研究表明多种酵母菌的混合发酵有利于改善发酵结果，并且在一步中实现2种或者2种以上的转换。多种酵母菌的混合发酵实现了不同的微生物的协同作用。而固定化微生物可以进行高密度增殖培养，提高反应器单位体积的生物转化速率，延长发酵细胞的寿命，增加稳定性，利于实现连续化生产，利于产物分离等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种复合载体混合固定酵母菌发酵烟草下脚料制备乙醇的方法，该制备方法简单，成本低，产率高达49.3g/kg，适合于大规模生产；比单一酵母菌固定化发酵产率具有明显的优势。
本发明的一种复合载体混合固定酵母菌发酵烟草下脚料制备乙醇的方法，包括
(1) 种子液的培养
将拉斯12号，1346， 1578酵母(中国食品发酵工业研究所)分别接种于酵母种子培养基中,在30'C， 150r/min条件下培养24h-36h;
(2) 复合载体的制备
取10g聚乙烯醇、0.5g海藻酸钠和5g硅藻土,加入60ml蒸馏水浸泡24h-36h,之后在ll(TC
3下灭菌10min ,冷却至40'C;
(3) 固定化小球的制备
将步骤(1)三种酵母菌种子液与步骤(2)复合载体混合均匀，注射到含有P/。CaCl2饱和的硼酸溶液(300 mL)进行交联20h-22h,使用生理盐水和无菌水洗漆，得到固定化小球；
(4) 增殖培养
将上述固定化小球接入增殖培养基中，3(TC活化24小时，进行固定化酵母的增值培
养；
(5) 将增殖培养后的固定化小球以10%的接种量接入发酵培养基，在25'C-35'C、 150r/min条件下发酵，即得。
所述步骤(3)三种酵母菌种子液的体积比l: 1: 1。
所述步骤(5)发酵培养基中烟草下脚料与双蒸水的固液比为1: 10，蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L。
所述步骤(5)发酵温度为35'C，时间为72h，固定化小球的填充率为15%，发酵液的pH值为3.5。
有益效果
(1) 本发明的制备方法简单，成本低，产率高达49.3g/kg，适合于大规模生产；
(2) 本发明的复合载体固定化小球中添加聚乙烯醇与海藻酸钠小球相比弹性明显增加，加入硅藻土使其内部小孔明显增加，增加了固定化小球的比表面积，硼酸饱和溶液的交联作用使其机械强度性能得到改善，利用烟草下脚料发酵制取乙醇达到了固废资源化目的。
图1固定化小球的表面在50倍下的电镜照片
图2固定化小球的表面在5000倍下的电镜照片
图3共固定酵母菌发酵图4酵母菌共固定化发酵的条件优化。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人
4员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
混合酵母菌株固定化小球的制备
(1) 挑选拉斯12号，1346， 1578酵母菌落，接种于种子培养基中，在3(TC、 150r/min条件下培养24h;
(2) 称取10g聚乙烯醇、0.5g海藻酸钠和5g硅藻土放入100mL烧杯内,加入60mL蒸馏水浸泡过夜，次日IIO 'C下灭菌10mhi，冷却至40 °C;
(3) 将上述三种酵母菌种子液按体积比l: 1: l混合后与复合载体混合均匀，用注射器注射到含有in/。CaCl2饱和的硼酸溶液(300mL)进行交联20-22小时，生理盐水和无菌水洗涤，得到固定化小球；
(4) 将上述固定化小球接入增殖培养基中，3(TC活化24小时，进行固定化酵母的增值培养；其表面电镜照片如图l，图2。
(5) 烟草下脚料用粉碎机粉碎，过40目，以固液比为l: 10将过40目的烟草下脚料和双蒸水混合，烟草下脚料浸湿，吸水膨胀，体积增大，然后加入65FPU的纤维素酶作为发酵料；
将上述增殖后的固定化小球，以10%接入发酵培养基进行燃料乙醇的发酵培养，发酵温度为3(TC，发酵周期为36小时。
实验结果如图3，在20h后三种酵母菌以1: 1: 1的比例共固定粒子发酵具有比任两种菌共固定化和单酵母菌固定发酵的优势明显。发酵36小时候达到产量49.3g/kg。发酵条件优化如图4。
权利要求
1.一种复合载体混合固定酵母菌发酵烟草下脚料制备乙醇的方法，包括(1)将拉斯12号，1346，1578酵母分别接种于酵母种子培养基中，在30℃，150r/min条件下培养24h-36h，得到种子液；(2)取10g聚乙烯醇、0.5g海藻酸钠和5g硅藻土，加入60ml蒸馏水浸泡24h-36h，之后在110℃下灭菌10min，冷却至40℃，制得复合载体；(3)将步骤(1)三种酵母菌种子液与步骤(2)复合载体混合均匀，注射到含有1％CaCl2饱和的硼酸溶液进行交联20h-22h，使用生理盐水和无菌水洗涤，得到固定化小球；(4)将上述固定化小球接入增殖培养基中，30℃活化24小时，进行固定化酵母的增值培养；(5)将上述增殖培养后的固定化小球以10％的接种量接入发酵培养基，在25℃-35℃、150r/min条件下发酵，即得。
2. 根据权利要求1所述的一种复合载体混合固定酵母菌发酵烟草下脚料制备乙醇的方法，其特征在于所述步骤(3)三种酵母菌种子液的体积比l: 1: 1。
3. 根据权利要求1所述的一种复合载体混合固定酵母菌发酵烟草下脚料制备乙醇的方法， 其特征在于所述步骤(5)发酵培养基中烟草下脚料与双蒸水的固液比为1: 10，蛋白胨 10g/L，酵母膏5g/L。
4. 根据权利要求1所述的一种复合载体混合固定酵母菌发酵烟草下脚料制备乙醇的方法， 其特征在于所述步骤(5)发酵温度为35'C，时间为72h，固定化小球的填充率为15%， 发酵液的pH值为3.5。
全文摘要
本发明涉及一种复合载体混合固定酵母菌发酵烟草下脚料制备乙醇的方法，包括(1)将拉斯12号，1346，1578酵母分别接种于酵母种子培养基中，在30℃，150r/min条件下培养；(2)聚乙烯醇、海藻酸钠和硅藻土，加入60ml蒸馏水浸泡24h-36h，灭菌；(3)三种酵母菌种子液与复合载体混合均匀，注射到含有1％CaCl<sub>2</sub>饱和的硼酸溶液进行交联20h-22h，洗涤；(4)将固定化小球接入增殖培养基中；(5)以10％的接种量接入发酵培养基，在25℃-35℃、150r/min条件下发酵。本发明方法简单，成本低，产率高达49.3g/kg，适合于大规模生产。
文档编号C12N11/00GK101671699SQ200910197400
公开日2010年3月17日 申请日期2009年10月20日 优先权日2009年10月20日
发明者谢丽萍, 赵晓祥 申请人:东华大学