专利名称：一种乳源性抗氧化活性肽及其组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于食品生物技术领域，特别涉及一种乳源性抗氧化活性肽及其组合物。
背景技术：
牛乳是一种成分复杂的生物流体，其中蛋白质含量为30_35g/L，主要由酪蛋白和 乳清蛋白组成，其中酪蛋白约占80%，乳清蛋白约占20%。牛乳蛋白质在营养上是优质的 全价蛋白质，蕴藏着多种生物活性肽片段。机体摄入的蛋白质并非全部在肠道内被彻底降 解成游离氨基酸才能为人体吸收利用，蛋白质在消化过程中释放出的大量肽类物质，也有 可能被机体直接吸收并对人体的生理机能具有特殊的调节作用。某些生物活性肽进入体内 后，还可产生类似激素类活性物质的作用。研究人员已从牛乳蛋白的酶解产物中发现了具 有免疫调节、降血压、抗血栓、矿物质结合、抗氧化、抗菌和抗病毒等作用的活性肽类物质并 鉴定了其结构。自由基是人体生命活动过程中生物化学反应的中间产物。正常情况下，机体内自 由基的产生和清除处于一种动态平衡状态，不会对机体造成损害。但当自由基和活性氧基 团(ROS)的产生过量时，或者随着年龄的增长，机体正常的氧化还原平衡被破坏；脂类，蛋 白质和DNA就会发生氧化反应，导致组织细胞结构和功能的破坏并引起机体的损伤衰老， 这也是诱发肿瘤等恶性疾病发生的重要因素。通常把具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基功能的生物活性肽称为抗 氧化肽。随着人们对食品安全和合成抗氧化剂安全问题的日益关注，天然抗氧化肽因为具 有较强的抗氧化性和高安全性，近年来已成为各国科研人员研究的热点。然而到目前为止， 研究人员能够了解结构并进行相关机理研究的天然抗氧化肽仅仅限于肌肽、谷胱甘肽等少 数抗氧化肽，而研究更多的是各种天然蛋白酶解物中具有一定抗氧化性的低分子混和肽。 同时由于自由基生命科学的发展，具有抗氧化作用的功能性食品和药物也引起了众多研究 人员的关注，肌肽、谷胱甘肽以及大豆肽的抗氧化作用也逐渐显示出它们在医药、食品、饲 料等领域应用的优势。Sati^-Gracia等Q000)发现乳清蛋白中的乳铁传递蛋白对铁具有亲合力，特别 是在富含铁的婴儿食品中能够抑制由铁催化的氧化作用。进一步研究发现，乳清蛋白的 抗氧化活性可能是由于其提供了氢原子还原自由基以及来源于半胱氨酸的游离的巯基基 团抑制了脂类的自动氧化。Rival等O001)研究发现β-酪蛋白的胰蛋白酶酶解物及 胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的酪蛋白酶解物对亚油酸具有抑制活性。其中β-酪蛋白的 f (33-48) ^Pf (169-176)片段对亚油酸具有较高的抑制活性，而β _酪蛋白的f (177-183) 片段则对酶诱导的亚油酸氧化却几乎没有作用。Rival等O001)采用3种不同的方法研 究了合成肽的氨基酸序列和抗氧化活性之间的关系。结果表明与其结构相似的化合物，如 肌肽(β-Ala-His)既有自由基清除活性又有抑制脂氧合酶的能力。Suetsuna，Ukeda和 Ochi (2000)从酪蛋白酶解物中分离得到Tyr-Phe-Tyr-Pr0-Glu-Leu，深入研究发现其C端 的二肽Glu-Leu序列对羟基自由基和DPPH自由基清除具有重要影响。Hermindez-Ledesma等Q005)研究了由corolase PP水解β _乳球蛋白获得的肽，其中一个序列为Trp-Tyr-S er-Leu-Ala-Met-Ala-Ala-Ser-Asp-Ile的肽，具有比BHA更高的抗氧化活性。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的抗氧化肽数量少，抗氧化活性低， 抗氧化途径不清的缺陷，提供一种新的抗氧化活性肽。本发明人通过木瓜蛋白酶酶解乳清蛋白，酶解产物经过分离纯化等处理步骤获得 一种肽，发现其具有良好的抗氧化功能，并分析了其氨基酸序列，从而完成了本发明。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是一种乳源性抗氧化活性肽，其氨 基酸序列是组氨酸-异亮氨酸-精氨酸(即His-Ile-Arg)。本发明所述的乳源性抗氧化活性肽的制备方法，可以是常规的人工合成方法，即 通过全氨基酸序列合成而得。也可以采用基因工程技术，即利用重组的生物工程菌生产而 得。或者由乳清蛋白经过蛋白酶水解，从酶解产物中分离而得。本发明还提供含有所述的乳源性抗氧化活性肽的组合物，至少包括一种活性 成分为所述的乳源性抗氧化活性肽和一种载体，所述的载体可以是药用载体、食用载体 和/或者化妆品用载体。所述的乳源性抗氧化活性肽在组合物中的含量可以是0.1 99. 9 (wt) %。 本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明提供了乳源性的抗氧化活性肽， 经体外抗氧化活性实验显示具有良好的抗氧化活性，水溶性好，安全性高可以应用于食品、 化妆品和医药等领域。本发明方法对于实现乳清蛋白的综合利用和提高其附加值具有重要 的意义。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1是乳清蛋白酶解反应物的凝胶层析谱图。其中，1 5表示第1至第5个洗脱 峰。图2是乳抗氧化肽的半制备型RP-HPLC图谱。其中，1 6表示第1至第6个洗脱 峰。图3是乳抗氧化肽的分析型RP-HPLC图谱。图4是乳抗氧化肽的MALDI-TOF-TOF-MS —级图谱。图5是乳抗氧化肽的MALDI-TOF-TOF-MS 二级图谱。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述 的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。实施例1酶解乳清蛋白1、采用酶反应器进行酶解反应
(1)乳清蛋白溶解将IOOOmL蒸馏水加入酶解反应器中，升温至最佳温度45°C，称取40g乳清分离蛋 白(美国哥伦比亚公司)，在磁力搅拌下缓慢加入水中，用2MNa0H调节pH6. 5，在45°C的条 件下使乳清分离蛋白全部溶解，使酶解反应器中乳清分离蛋白的浓度为4% (w/v)。(2)酶角军按照酶量为底物(乳清分离蛋白)的2. 2 (wt) %的比例(500U/g酶)，加入木瓜蛋 白酶，维持反应温度为45°C，并通过ZDJ-4A自动电位滴定仪滴加2M的NaOH维持酶解液的 pH6. 5恒定，酶解时间为3. 5h。2、离心将酶解液加热至100°C，IOmin进行灭酶，然后冰浴快速冷却至室温，用2M盐酸调 酶解液至PH 7. 0，有沉淀析出，以IOOOOrpm离心30min除去沉淀，即未水解的乳清蛋白。3、超滤将离心后的酶解物上清液用截留分子量为5000Da的超滤膜超滤，收集分子量小 于5000Da的组分。将滤过液减压浓缩后，采用LABC0NC0冻干机真空冷冻干燥。冻干品置 于-20°C贮存备用。实施例2凝胶过滤层析将实施例1中所得的冻干品用蒸馏水溶解，配制成浓度为lOmg/mL的溶液， 12，OOOXg 离心 15min，上清液用于凝胶过滤色谱(gel fiItrationchromatography，GFC) 分离。凝胶过滤色谱参数如下色谱柱*kphadexG-15柱(1.6cmX72cm)，用20mM醋酸-醋 酸钠缓冲液平衡；检测波长为220nm ；进样量为IOmL ；洗脱液为20mM的醋酸-醋酸钠缓冲 液，流速为0. 5mL/min ；自动分布收集器收集洗脱峰。凝胶层析图谱见图1，从图1可见有5 个洗脱峰组分。合并每次收集的相同洗脱峰组分冻干，对所得的每种组分分别进行抗氧化 活性测定。实施例3DPPH自由基清除能力的检测2，2-二苯基-1-苦胼基自由基(2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl,DPPH)分析法 是一种筛选自由基清除剂的简便方法。DPPH自由基在有机溶剂中由于苯环的共轭和位阻效 应以及硝基的吸电子作用是一种稳定的以氮为中心的自由基，溶液颜色为紫色；其结构中 含有3个苯环，其中1个氮原子上有1个孤对电子，在517nm处有强吸收。当有自由基清除 剂存在时，DPPH自由基的孤对电子被配对而使溶液颜色变浅，反应结束后达到稳定；而且 这种颜色变浅的程度与配对电子数呈量效关系。若样品能将DPPH自由基清除，则表明样品 具有降低羟基自由基、烷基自由基或超氧阴离子自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反 应的作用。因此，可以通过此波长处吸光度的变化来评价样品对DPPH自由基的清除情况， 从而评价样品的抗氧化能力。将2mL 0. 2mM的DPPH无水乙醇溶液加入到含有2mL样品溶液的洁净试管中，混 勻。室温下放置30min后，于517nm处测定吸光值。清除率(%) = [I-(Ai-Aj)/A0] X 100%A0为2mL 0. 2mM的DPPH无水乙醇溶液，加2mL的样品溶剂时测得的吸光值，为空 白对照；Ai为2mL 0. 2mM的DPPH无水乙醇溶液，加2mL的样品时测得的吸光值；
Aj为2mL无水乙醇，加2mL的样品时测得的吸光值。分别将实施例2分布收集的洗脱液P1_P5(第一至第五个峰)组分冻干，用蒸馏水 稀释到相同浓度，按照上述方法测定抗氧化活性。P1-P5组分的DPPH自由基清除率分别为 29. 1%,37. 4%,40. 6%,53. 3%和 30. 2%。P1-P5 均有一定的抗氧化活性，P4 > P3 > P2 > P5 > P1，P1和P2清除率较低，小于分离前的样品峰。P4组分的自由基清除能力最强，抗氧 化活性最高，相对于其它峰抗氧化活性较显著。收集抗氧化活性最强的P4组分，经旋转蒸发得到浓缩液，将浓缩液经真空冷冻干 燥后得到冻干品。 实施例4RP-HPLC纯化(反相-高效液相色谱)1、半制备型 RP-HPLC将实施例3制得的抗氧化活性最强的P4组分冻干品用蒸馏水溶解后经高速离 心机12，OOOXg离心15min，再过0. 45 μ m滤膜过滤后，用半制备型RP-HPLC进行纯化。 RP-HPLC的分离纯化条件半制备型柱(UBondapakQ8 19mmX 300mm)；流动相A，5%乙腈， 含0.05%三氟乙酸(TFA)出，80%乙腈，含0.05%1 六；检测波长220歷，流速1111171^11，进 样量2mL。梯度洗脱程序为 0 5min，100% A ;5 20min，100% A 40% B ；20 30min， 40% B 100% B ；30 40min，100% B ；40 50min，100% B 100% A ；50 55min，100% Α。所述百分比为体积百分比。半制备型RP-HPLC图谱见图2。从图2可见，将待分离的P4组分经半制备型 RP-HPLC分离后主要得到6个洗脱峰组分，分别收集并冷冻干燥后测定其抗氧化活性。结 果如下:P1(27. 5% ), P2(42. 5% )，P3 (61. 3% ), P4 (40. 8% ), P5(31. 7% ), P6 (24. 5% )。 其中第3个洗脱峰组分的抗氧化活性最强P3 (61. 3%)0从梯度洗脱程序看，在此区域内采 用的是降低流动相极性(即降低流动相中水的含量)的线性梯度洗脱。2、分析型 RP-HPLC将半制备型RP-HPLC分离得到抗氧化活性最强的第3个洗脱峰组分收集冻 干；继续用分析型RP-HPLC分离。RP-HPLC的分离纯化条件分析型柱(μ Bondapak C18 3.9_X30(toim)；流动相A，5 % 乙腈，含 0. 05 %三氟乙酸(TFA) ；B，80 % 乙腈，含 0. 05 % TFA ；检测波长220nm，流速lmL/min，进样量2mL。梯度洗脱程序为0 5min，100% A ;5 20min, 100% A 40% B ；20 30min，40% B 100% B ；30 40min，100% B ；40 50min， 100% B 100% A ；50 55min，100% Α。所述百分比为体积百分比。分析型RP-HPLC图谱见图3。从图3可见，获得了单一的1个洗脱峰组分。实施例5结构鉴定(1)质谱分析将实施例4分析型RP-HPLC纯化后的洗脱峰组分采用 MALDI-T0F-T0F-MS进行结构鉴定。质谱分析参数如下激光源波长355nm =YAG激光器， 加速电压20kV，质量扫描范围m/z 100 800。质谱仪的分析软件采用4700Explorer TM Software。MALDI-T0F-T0F-MS的一级图谱见图4，二级图谱见图5。由图4，5中可以看出，质 谱图中大部分出现的是b和y系列碎片，这验证了肽链中酰胺键较容易断裂的推断，其中 丰度较强的主要离子峰都可以从结构上进行解释。此外，碱性氨基酸对肽键断裂也有特殊 的作用，它们的质子亲和能较高，具有使质子在肽链或碎片上定位的倾向。如果精氨酸在肽链的N端，碎裂中倾向于产生N端离子，精氨酸在C端则倾向于产生C端离子。由于木瓜 蛋白酶水解作用的专一性较强，只断裂赖氨酸或精氨酸羧基末端参与形成的肽键，精氨酸 应在肽链的C末端。因此，质谱图中应是y系列的离子(图4)。经过软件分析并标注(图 5)，可以看出在此区域内显示H(His)、I (lie)、R(Arg) 3种氨基酸的多个相关特征离子峰， 其中分别标注为H、I和R的3个峰所对应的是这3种氨基酸的亚氨正离子的质荷比。由于 L(Leu)与I (Ile)的相关特征离子峰是完全相同的。因此，图5中的离子峰可能是I。在得 到肽段的氨基酸残基种类的信息之后，运用De Novo Explorer分析软件对这几种氨基酸排 列的顺序进行分析。经过分析，我们认为这个抗氧化肽的氨基酸序列为HI(L)R,分子质量 为425.28Da。由于软件无法区分L(Leu)与I (lie)。因此，必须结合氨基酸组成分析的结 果进一步确定，这样才能最后确定该抗氧化肽氨基酸的种类和数量。(2)氨基酸序列分析将实施例4分析型RP-HPLC纯化后的组分用氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成分 析。结果表明该抗氧化肽主要由组氨酸(His，H)，异亮氨酸(lie，I)和精氨酸(Arg，R)组 成，相对摩尔比例为1 1 1，相对分子质量为425. ^Da。综上所述，本发明根据质谱分析和氨基酸组成分析结果两方面确证分离得到的乳 抗氧化肽的氨基酸序列为MR(His-Ile-Arg)。
权利要求
1.一种乳源性抗氧化活性肽，其特征在于，其氨基酸序列是组氨酸-异亮氨酸-精氨酸。
2.含有如权利要求1所述的乳源性抗氧化活性肽的组合物，其特征在于，至少包括一 种活性成分为所述的乳源性抗氧化活性肽和一种载体。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的载体是药用载体、食用载体和/或 者化妆品用载体。
4.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的乳源性抗氧化活性肽在组合物中 的含量是0. 1 99. 9 (wt) %。
5.氨基酸序列是组氨酸-异亮氨酸-精氨酸的小肽作为抗氧化活性肽的应用。
全文摘要
一种乳源性抗氧化活性肽及其组合物。该乳源性抗氧化活性肽的氨基酸序列是组氨酸-异亮氨酸-精氨酸(即His-Ile-Arg)。经体外抗氧化活性实验显示，其具有良好的抗氧化活性，可以应用于食品、化妆品和医药等领域。
文档编号A23L1/305GK102093469SQ200910200320
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者刘志东, 刘振民, 王荫榆, 郭本恒 申请人:光明乳业股份有限公司