Lxr核受体激动剂在治疗和预防自身免疫性疾病中的应用的制作方法

专利名称：Lxr核受体激动剂在治疗和预防自身免疫性疾病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及LXR核受体激动剂在治疗和预防自身免疫性疾病中的应用。
背景技术：
Thl7是一群近年来发现的高分泌的⑶4+T细胞，在控制自身免疫和病原入侵方面 起着重要的作用(Harrington et al.，2005 ；Park et al.，2005)。在 IL-4 抗体和 IFNy 抗 体的辅助下，TGF β和IL-6可以把CD4+T细胞分化成Thl7(Vel dhoen etal.，2006)，在这 过程中 Stat3 (Yang et al. , 2007), ROR y t (Ivanov et al.，2006)禾口 ROR α (Yang et al.，
2008)起了重要的作用。最近有几个新的调控因子被发现，它们是STAT5，Ets-I，RAR，IRF4， Foxp3、AHR、Runxl、NR2F6、NLRP3、IBP、Gfil*PPARY (Chen et al. ,2008 ；Hermann-Kleiter et al.,2008 ；Huber et al.,2008 ；Ichiyama et al.,2009 ；Kimura et al. ,2008；Klotz et al.,2009 ；Laurence etal. ,2007 ；Meng et al. ,2009 ；Moisan et al. ,2007 ；Mucida et al.,2007 ；Quintanaet al. ,2008 ；Veldhoen et al. ,2008 ；Zhang et al. ,2008；Zhou et al.，2008)。人们认为可能还存在新的调节因子控制着Thl7的分化，实际上，通过药物筛 选，本发明人发现了 L)(R可能会是Thl7分化的一个新的调节因子。LXR(肝脏X受体)有两个亚型，分别为在肝脏、脂肪和巨噬细胞中表达的LXRa 和在多个组织中广泛表达的 LXR0 (Apfel et al. , 1994 ；Repa and Mangelsdorf，2000 ； Shinar et al. , 1994 ；Song et al. , 1994 ；Willy et al.，1995)。最近，NikolausMars 等 人发现LXR α和LXR β在⑶4+Τ细胞中有表达，这一发现提示LXR可能会在T细胞功能或 者效应T细胞分化中起着作用(Walcher et al.，2006)。L)(R和RXR形成异二聚体结合在 DNA上，通过调节ABCAl，ABCGl, SREBP-Ic (胆固醇调节元件结合蛋白-Ic)和脂肪酸合成 酶的表达来维持胆固醇动态平衡(Tontonoz andMangelsdorfdOO； )。最近的一些研究表 明，L)(R在免疫调控方面有一定的作用，但是有些报道说L)(R是个免疫的正调控因子，有的 则说是负调节因子，这可能于不同报道中使用的动物模型有关系。例如，有实验证实，LXR 对巨噬细胞的存活和对外来病原菌的抵抗至关重要(Jos^h et al. ,2004 ；Korf et al.,
2009)，而另外一方面，L)(R激活会抑制T细胞的增殖(Bensingeret al.，2008)。动物实验 表明，L)(R激活以后会缓解EAE (实验性变态反应性脑脊髓炎)病症，但是在类风湿性关节 炎中则起着加重病情的作用(Asquith et al. ,2009 ；Hindinger et al.，2006)。最近一个 研究还表示，LXR的激动剂会抑制IL-23和其他的Thl7的炎症因子，但是具体机制不详(Xu et al. ，2009)。Thl7细胞分泌的细胞因子为白介素17、白介素17F、白介素22、白介素21。这些 细胞因子都参与了特定类型炎症反应。Thl7细胞能迅速启动由中性粒细胞介导的炎症反应 过程。许多病原体感染都主要通过Thl7途径被控制，如革兰氏阳性痤疮丙酸杆菌以及革兰 氏阴性柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯杆菌、疏螺旋体属、结核分支杆菌及真菌(如白色念珠菌) 感染。过激的Thl7型反应过程或白介素17分泌过多与慢性炎症及免疫病理状态有关。白 介素17最早被发现可以诱导成纤维细胞和类风湿关节炎患者的滑膜细胞产生白介素6。很多细胞都表达白介素17受体，这些受体介导的信号通路可诱导靶细胞产生炎性因子，如白 介素6、白介素1、肿瘤坏死因子、白介素8和基质金属蛋白酶。白介素17通过诱导产生基 质蛋白酶能够破坏细胞外基质，引起骨质吸收。在骨骼，白介素17刺激成骨细胞表达核因 Ψ B(receptor activator of nuclear factor-B ligand，RANKL)。这
样的成骨细胞能够激活表面表达核因子B受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-B, RANK,即RANKL的受体)的破骨细胞。 1ι17细胞同样表达RANKL，但不能通过 RANKL和RANK相互作用激活破骨细胞，而是通过分泌白介素17，诱导诸如成骨细胞的RANKL 等生物学效应来激活破骨细胞。通过RANKL和RANK系统，白介素17在类风湿关节炎、牙周 病及假肢松动中起重要作用。在类风湿关节炎患者中，滑膜细胞产生的肿瘤坏死因子、白介 素1和白介素17对关节破坏有预测价值。除了类风湿关节炎，Thl7细胞还参与了银屑病、 多发性硬化及炎性肠病的发病过程。多发性硬化是一种以中枢神经系统脱髓鞘病变为特征的自身免疫性疾病。在多发 性硬化患者病变脑组织中，白介素17和白介素6基因是表达最高的基因，同时白介素17在 该病患者的血清和脑脊液中的量也增加。体外实验显示Thl7细胞能够突破血脑屏障进入 中枢神经系统的基质。多发性硬化患者的血标本中可以看到树突状细胞中白介素23的pl9 链表达增加，提示树突状细胞能促进Thl7细胞产生。白介素6及白介素1参与Thl7细胞分化的启动阶段(图2)。应用针对白介素6 受体的单克隆抗体(如tocilizumab，抗白介素6受体的人化单克隆抗体)及预先用白介素 1受体的拮抗剂(比如anakinra，一种重组人白介素1受体拮抗剂)处理是治疗类风湿关 节炎和其他自身免疫性疾病的两种有效方法。控制Thl7细胞生物学效应的最直接办法就是靶向中和其所产生的效应细胞因 子。针对白介素17或白介素17受体及可溶性白介素17受体的单克隆抗体已经开始临床 使用。针对白介素17的单克隆抗体(AIN457)治疗银屑病、类风湿关节炎、克罗恩病及银屑 病关节炎已经进入2期临床研究。一些细胞因子能够调控Thl7细胞的发育并有抗白介素17的特性。比如，白介素 4可以抑制白介素17的产生和功能；Th2细胞产生的白介素25也能通过下调白介素23、白 介素1和白介素6抑制白介素17的产生。用白介素25可以抑制鼠脑部自身免疫性炎症。白介素17能诱导白介素1和肿瘤坏死因子α产生。白介素1和肿瘤坏死因子α 不能直接阻断你即3+调节性T细胞的产生，但能阻断调节性T细胞的功能。这一现象可以 解释反复发作的自身免疫性疾病使用肿瘤坏死因子抑制剂后能够缓解。联合运用白介素17 和肿瘤坏死因子抑制剂(无论是同时服用还是序贯服用)能够更好地控制炎症及增强调节 性T细胞的功能。1995年，刚被发现的白介素17因缺乏对T细胞或B细胞的即刻效应而被认为重要 性不大。当它能够诱导炎症的作用被确立时，这一分子开始引起广泛关注。目前的共识是 白介素17在抗感染及诱导维持慢性炎性疾病中起着重要作用。Thl7细胞的诱导因子及其功能细胞因子已比较清楚，使Thl7细胞的调节有了很 大进展。调节性τ细胞和Thl7细胞的相互关系提示，通过调节二者的平衡、适当增强调节 性T细胞的功能有助于自身免疫疾病的治疗。非常有意思的是，本发明人在药物筛选中，偶然发现了 L)(R的激动剂抑制了 Thl7的体外分化。进一步的研究表明是SREBP-I介导了这个抑制过程，因为SREBP-I可以结合 到IL-17的启动子上，拮抗Thl7分化的正调节因子AHR。L)(R的激动剂在野生型小鼠诱导的 EAE中有明显的治疗作用，而在LXR缺陷型小鼠中则作用全无。这些实验表明，L)(R是Thl7 分化的一个负调节因子，是细胞分化的代谢监控点，而且本发明人的工作给治疗自身免疫 疾病提供了一个新的靶点。

发明内容
本申请第一方面涉及肝脏X受体和/或胆固醇调节元件结合蛋白-1在制备用于 治疗IL-17介导的疾病的药剂中的用途。在一优选实施例中，所述IL-17介导的疾病是自身免疫疾病。在另一优选实施例中，所述自身免疫疾病选自多发性硬化症、银屑病、类风湿关节 炎、克罗恩病和银屑病关节炎。在一优选实施例中，所述药剂含有肝脏X受体，或者肝脏X受体的激动剂或抑制 剂；或者是胆固醇调节元件结合蛋白-1、或其抑制剂或激动剂。本申请另一方面涉及肝脏X受体和/或胆固醇调节元件结合蛋白-1在制备用于 调节Thl7细胞的分化用的物质中的用途。在一优选实施例中，所述物质选自肝脏X受体、肝脏X受体的激动剂、肝脏X受体 的抑制剂、胆固醇调节元件结合蛋白-1、胆固醇调节元件结合蛋白-1的抑制剂、或胆固醇 调节元件结合蛋白-1的激动剂。本申请再一方面涉及一种体外调节Thl7细胞分化的方法，该方法包括使用(1)肝脏X受体或其激动剂或抑制剂，或( 胆固醇调节元件结合蛋白-1或 其抑制剂或激动剂处理CD4+T细胞，所述处理可以是体外或体内处理；和/或包括破坏IL-17的启动子区域，使其失去生物学活性。本申请还涉及一种筛选能调节Thl7细胞的分化的物质的方法，该方法包括使候选物质与表达肝脏X受体的细胞接触，和检测细胞中肝脏X受体、胆固醇调节元件结合蛋白-1和/或IL-17的表达水平，其中，能使上述任一种的表达水平发生明显变化的候选物质为能够调节Thl7细 胞的分化的物质。在一优选实施例中，该方法还包括将所筛选得到的物质进一步地与CD4+T细胞接 触，检测该CD4+T细胞向Thl7细胞的分化是否受到影响，其中，能影响CD4+T细胞向Th 17 细胞的分化的物质确定为能调节Thl7细胞的分化的物质。本申请也包括一种药物组合物，该组合物含有(a)肝脏X受体、肝脏X受体的激动剂、肝脏X受体的抑制剂、胆固醇调节元件结合 蛋白-1、胆固醇调节元件结合蛋白-1的抑制剂、或胆固醇调节元件结合蛋白-1的激动剂； 和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。


图1显示LXR激动剂抑制了体外Thl7的分化。㈧初始⑶4+T细胞在Thl7条件下分化4天，同时加入如图所示的各种药物，然后做IL-17和IFNy的细胞内染色。 metformin (AMPK 激活剂)，rosiglitazone (PPAR γ 激活剂)，BADGE (PPAR γ 抑制剂)， Wortmanin (PI3K/Akt 抑制剂)，SB-202190 (p38MAPK 抑制剂)，SP600125 (JNK/SAPK 抑制 剂)，T0901317 (L)CR激活剂)；(B)初始⑶4+T细胞在Thl7条件下分化4天，同时加入 T0901317 (0. 5 μ M，1 μ M，2 μ M)或者 GW3965 (2. 5 μ Μ, 5 μ Μ, 10 μ Μ)，然后做 IL-17 禾口 IFN γ 的细胞内染色。该实验至少重复了 3次。图2显示LXRa和LXR^在Thl7中选择性的降低。初始CD4+T细胞分别在ThO, Thl、Th2、Treg或Thl7条件下分化4天，然后收取RNA，反转成cDNA，做实时定量的PCR。分 别检测如图所示的各个基因。该实验至少重复了3次。图3显示LXR α / β负调控体外Thl7的分化。(A)初始⑶4+T细胞在ThO或者Thl7 条件下并且同时有或者没有LXR α / β逆转录病毒感染的情况下分化4天，然后做IL-17细 胞内染色。 )初始004+11细胞在11117条件下并且同时有^0^/^逆转录病毒感染以及 Τ0901317(2μΜ) ^P GW3965 (10 μ Μ)的情况下分化4天，然后做IL-17细胞内染色。(C)免 疫印迹证实LXRa/β在病毒感染的⑶4+Τ细胞中过表达。(D)L)(R野生型或者缺陷型小鼠 来源的初始CD4+T细胞在Thl7条件下分化4天，同时加入T0901317 (0. 5 μ M，1 μ M，2 μ M) 或者613965 0.5“11，5“11，1(^10，然后做11^-17和IFNY的细胞内染色。该实验重复了 3 次。图4显示LXR激动剂通过促使SREBP-I结合到IL-17启动子上的E_box元件来 抑制IL-17的转录活性。(A) —系列长度不同的IL-17启动子连接到萤火虫荧光素酶基因 的前面，然后把这些质粒转染到Jurkat细胞中，细胞培养液中含有T0901317或者对照溶 剂。(B)初始CD4+T细胞在 1ι17条件下分化4天，同时加入T0901317或者GW3965，然后收 取RNA，反转成cDNA，做实时RT-PCR。分别检测如图所示的各个基因。该实验至少重复了 3 次(*, P < 05 ；**，P < 0. 01)。(C)EMSA 分析 SREBP-I 和 IL-17 启动子上的 E-box 元件的 结合。(D) CHIP检测SREBP-I和IL-17启动子的结合，使用了两套引物。(E) SREBP-Ia或者 SREBP-Ic和IL-17的启动子-荧光素酶共转Jurkat，检测荧光素酶活性。该实验重复三 次，*，P < 0. 05。(F)初始⑶4+T细胞在Thl7条件下分化4天，同时用逆转录病毒过表达 SREBP-I或者作为载体感染针对于SREBP-I的shRNA，做IL-17的细胞内染色。(G)RT-PCR 来检测SREBP-Ia和SREBP-Ic过表达或者被抑制的效率。图5显示SREBP-I通过和AHR相互作用影响IL-17的表达。(A)分析一段含有 SREBP-I和AHR结合位点的IL-17启动子。(B)初始⑶4+T细胞在 1ι17条件下分化4天，同 时加入Τ0901317或者GW3965，然后收取蛋白质，用抗SREBP-I的抗体或者IgG对照做免疫 沉淀，然后将蛋白复合物做免疫印迹。(C)初始CD4+T细胞在Thl7条件下分化4天，同时加 入T0901317或者GW3965，经固定，破膜后，做免疫染色。DIC (微分干涉)图片表示了细胞 的轮廓；DAPI染核。⑶AHR和SREBP-I全长以及一系列缺失突变的示意图。bHLH(碱性螺 旋-环-螺旋结构域)和PAS (推定激活位点结构域)分别用蓝色和红色表示。SREBP-IN端 的酸性区域使用绿色表示。(E)带Flag标签的AHR和带Myc标签的SREBP-Ia或者SREBP-Ic 瞬转HEK293T细胞，用于做免疫共沉淀。(F)带Flag标签的全长的AHR和带Myc标签的 SREBP-Ia或者SREBP-Ic或其突变瞬转HEK293T细胞，用于做免疫共沉淀。(G)带Myc标签 的全长的SREBP-Ia或者SREBP-Ic和带Flag标签的AHR或其突变瞬转HEK293T细胞，用于做免疫共沉淀。(H)收取(J)所示的细胞的蛋白，做免疫印迹检测shRNA基因沉默的效率。 ⑴AHR，SREBP-Ia或者SREBP-Ic和IL-17的启动子-荧光素酶共转Jurkat，检测荧光素酶 活性。该实验重复三次，与AHR单转相比，#，P < 0. 01 ； §，P > 0. 05。(J)初始CD4+T细 胞在Hi 17条件下分化4天，同时用逆转录病毒表达针对于AHR的shRNA，同时加入T0901317 或者GW3965，做IL-17和IFN γ的细胞内染色。图6显示L)(R激动剂缓解ΕΑΕ。㈧在L)(R野生型或者敲除的小鼠中诱导EAE， 给予L)(R激动剂T0901317，GW3965或者安慰剂治疗(每组6只，从免疫的第三天持续到第 17天)。(B)最高发病程度设为> 3。初始CD4+T细胞在Thl7条件下分化4天，同时加入 T0901317或者GW3965，然后收取蛋白质，用抗SREBP-I的抗体或者IgG对照做免疫沉淀，然 后将蛋白复合物做免疫印迹。(C)第15天的脊髓切片做H&E染色或者Luxol fast blue染 色。放大倍数为40倍。白框内的图像扩大后显示在下方对应处。图7显示LXR激动剂降低了 EAE小鼠的IL-17和IFN γ的产生。㈧各组小鼠中 枢神经系统(CNS)，脾脏和淋巴结中的IL-17和IFNy细胞内染色。⑶各组小鼠的脊髓切 片的IL-17和IFNy染色。放大倍数，200倍。附图中使用流式细胞仪得出的结果的横坐标和纵坐标为IOciUO1UO2UO3等。
具体实施例方式本申请一方面涉及胆固醇调节元件结合蛋白-I(SREBP-I)在制备用于治疗或预 防IL-17介导的疾病的药剂中的用途。本申请另一方面涉及LXR在制备用于调节Thl7细胞的分化用的物质中的用途。本申请另一方面涉及SREBP-I在制备用于调节Thl7细胞的分化用的物质中的用途。本申请也包括调节Thl7细胞分化的方法，该方法包括使用(I)LXR或其激动剂或 抑制剂，或O) SREBP-I或其抑制剂或激动剂处理CD4+T细胞。所述处理可以是体外或体内 处理。该方法还包括破坏IL-17的启动子区域，使其失去生物学活性。更具体而言，可将 IL-17启动子中的E-box元件删除或突变，使其失去原本的功能。IL-17介导的疾病包括各种自身免疫疾病，例如多发性硬化症、银屑病、类风湿关 节炎、克罗恩病及银屑病关节炎等。用于治疗或预防IL-17介导的疾病的药剂可包括SREBP-I本身、SREBP-I的激动 剂或SREBP-I的抑制剂，和药学上可接受的载体或赋形剂。用于调节Thl7细胞的分化用的物质可以是L)(R激动剂，也可以是含有L)(R激动剂 或LXR的药剂；或者是SREBP-I本身、SREBP-I的激动剂或SREBP-I的抑制剂。所述物质可 用于调节Thl7细胞的分化。“调节”包括正调节和负调节，即包括促进CD4+T细胞分化成 Thl7细胞，或者抑制⑶4+T细胞分化成Thl7细胞。进一步的，可通过给予对象所述物质来治疗与Thl7细胞的分化相关的各种疾病 或病症。本文中，与Thl7细胞的分化相关的疾病包括各种自身免疫疾病，例如多发性硬化 症、银屑病、类风湿关节炎、克罗恩病及银屑病关节炎等。因此，本申请也包括L)(R在制备用于治疗或预防与Thl7细胞的分化相关的疾病用 的药物中的用途，和SREBP-I在制备用于治疗或预防与Thl7细胞的分化相关的疾病用的药
7物中的用途。具体而言，本申请也包括L)(R或SREBP-I在制备用于治疗或预防对象的自身免疫 疾病的药物中的用途。所述药物可包括L)(R本身，或者可包括L)(R的激动剂或抑制剂；或者 是SREBP-I本身、或其抑制剂或激动剂。药物中还可包括药学上可接受的载体或赋形剂。因此，本申请的制备用途实际上也包括LXR的激动剂或抑制剂和SREBP-I的激动 剂或抑制剂的制备用途。本文的对象包括哺乳动物，例如人。本文中SREBP-I可包括SREBP-Ia和SREBP-lc。 SREBP-I的激动剂可包括，例如LXR或LXR的激动剂。SREBP-I的抑制剂可包括例如瘦素 (Ieptin)、shRNA,以及SREBP-I的抗体等等。所述shRNA包括SEQID NOS :37-39所示的序 列。LXR的激动剂包括，已知的GW3965和T0901317。本文所述的LXR和SREBP-1的核苷酸序列如Genebank中所给出的序列所示 (LXRagene ID 22259 ；LXRb gene ID 22260 ；SREBP-I gene ID 20787)。本文包括任何形式 的L)(R和SREBP-1，例如，包括其全长序列或生物活性片段。经过一个或几个氨基酸残基的 取代、缺失或添加而形成的且保留了 LXR或SREBP-I的生物活性的LXR或SREBP-I突变体 或类似物也包括在本发明中。L)(R或SREBP-I或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的 替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。特别优选的 类似物包括性质上保守的取代，即这些取代发生在与它们的侧链有关的一类氨基酸中。具 体而言，氨基酸一般被分成四类(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；( 碱性——赖氨酸、精 氨酸、组氨酸；(3)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨 酸、色氨酸；(4)无电荷的极性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、 酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。例如，有理由预测单独用异 亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构上 相关的氨基酸取代类似的保守的氨基酸，这样的替代将不会对生物活性有重要影响。例如， 本发明的L)(R或SREBP-I可包括多达约5-10个保守的或不保守的氨基酸取代，甚至多达约 15-25个保守的或不保守的氨基酸取代，或2-25之间任何整数，只要该分子的所需功能仍 维持完整。本领域的熟练技术人员可结合本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲 线图，容易地测定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。本申请提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.00000l-50Wt% ；较佳的 0. 00001-20wt% ；更佳的，0. OOOl-IOwt % )的所述LXR、LXR的激动剂、LXR的抑制剂、 SREBP-U SREBP-I的抑制剂或SREBP-I的激动剂，以及药学上可接受的载体或赋形剂。所 述的组合物可用于调节Thl7细胞的分化，治疗或预防Thl7细胞介导的疾病，治疗或预防 IL-17介导的疾病。如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和 /或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋 形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没 有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的 载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充 剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染 试齐LU
可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的本申请的药物组合物给药于哺乳动 物。包括但不限于皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等。所述药物 组合物也可配制成口服剂型、注射剂型等。本申请还包括筛选能调节Thl7细胞的分化的物质的方法，该方法包括使候选物 质与表达LXR的细胞接触，检测细胞中LXR、SREBP-I和/或IL-17的表达水平，其中，能使上 述任一种的表达水平发生明显变化的候选物质为预期能够调节Thl7细胞的分化的物质。 该方法还包括将所筛选得到的物质进一步地与CD4+T细胞接触，检测该CD4+T细胞向Thl7 细胞的分化是否受到影响。也可通过此方法筛选能够治疗自身免疫疾病的药物。具体而言，本申请包括筛选L)(R激动剂的方法，以获得能够抑制Thl7细胞分化的 物质，例如化学小分子，或者多肽或其它活性物质。该方法包括将待筛选的物质与表达LXR 的细胞接触，检测细胞中LXR的表达水平，其中与对照相比能使LXR的表达水平升高的物质 确定为LXR的激动剂。进一步地，该方法还包括检测SREBP-I和/或IL-17的表达水平，其 中能使SREBP-I的水平升高、使IL-17的表达水平降低的物质确定为LXR的激动剂。LXR α在肝细胞、巨噬细胞和T细胞中有表达，而LXR β基本上在全身的组织细胞 中都有表达。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。本发明的实施除非另外说明，将使用本领域技术人员已知 的化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。这些技术在文献中有完整的解释。 参见，如《基础免疫学》(Fundamental Virology)，第二版，第I和II卷(B. N. Fields和 D.M. Knipe 编)；《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology)，第 I-IV 卷 (D. Μ· Weir 禾口 C. C. Blackwell 编，Blackwell ScientificPublications) ；Τ. E. Creighton, 〈〈蛋白质结构禾口 分子特性〉〉(Proteins :Structuresand Molecular properties) (W. H. Freeman and Company, 1993) ；A. L. Lehninger，《生物化学》(Biochemistry) (Worth Publishers, Inc.最新版)；Sambrook等，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning a Laboratory Manual)， 二片反，1989 ；(Methods in Engymology) (S. Colowick 和N. Kaplan编，AcademicPress, Inc.)。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例1.实验材料和步骤实验动物-LXR双敲除小鼠是由得克萨斯大学西南医学中心的DavidMangelstorf 赠送的。C57BL/6 mice购自上海的SLAC公司，动物实验都得到了中科院营养所伦理委员会 的批准。EAE诱导和治疗-L)(R敲除和野生小鼠(8_10周)，皮下免疫和完全弗氏佐剂乳化 的150微克的MOG肽段(由吉尔生化合成)。破伤风毒素在免疫当天和48小时腹腔注射， 起辅助发病的作用。从免疫的第三天到第十七天，小鼠每天灌胃给药GW3965Q0mg/kg)或 #T0901317(25mg/kg) (Sigma公司)。病状如此评分0，无病状；1，尾巴变软；2，一条后肢 瘫痪；3，两条后肢瘫痪；4，前肢瘫痪；5，极度虚弱，垂死或者死亡。组织切片染色-麻醉小鼠，先后用PBS和多聚甲醛心脏灌流，然后取出脊髓，液氮 速冻，存储于_80°C。脊髓切成冷冻切片(20 μ m)并且转移到涂过明胶的载玻片上。切片分 别经过苏木精和伊红染色(H&E)或者Luxol fast blue染色来分别确定脊髓的单个核细胞浸润和脱髓鞘情况。如果是要染IL-17和IFN γ，切片首先用冰丙酮固定，然后用1 % BSA阻 断非特异抗体结合，然后用IL-17和IFNy的一抗孵育，并用罗丹明或者FITC标记的二抗 孵育，然后用DAPI染核5分钟。Confocal图片使用LSM510 confocal显微镜(德国Zeiss 公司)拍摄，物镜放大倍数为20倍。其余普通光镜镜检。在中枢神经系统中纯化单个核细胞-通过密度梯度离心从中枢神经系统中分离 单个核细胞。麻醉小鼠，先用PBS做心脏灌流，然后取出脑和脊髓，磨碎后获得细胞悬液。细 胞悬液用Percoll(GE Healthcare)构建的一个梯度密度来分离。70%和37% Percoll中 间的一层即是单个核细胞。细胞纯化-为了分离小鼠的CD4+T细胞，首先分离小鼠脾脏，做成细胞悬液，使用 Dynal Biotech的⑶4+T细胞阴性选择试剂盒去掉B细胞、巨噬细胞、和⑶8+T细胞、NK细 胞、DC细胞、红细胞和粒细胞。为了进一步分离较纯的⑶4+⑶25-T细胞，已经分纯的⑶4+T 细胞先后和PE标记的抗⑶25的抗体、抗PE的磁珠孵育，然后用MACS分离柱(Miltenyi Biotec)纯化。下面再用⑶4+⑶62L+T细胞分离试剂盒中的⑶62L微磁珠组分处理，获得 CD4+CD25-CD62L+T 细胞。细胞培养-为了做T细胞分化，原代初始CD4+T细胞铺到96孔板理，加上 抗-^3/ 抗体(来源M2 μ g/mL)来刺激T细胞受体。ThO分化剂(α -IL-4抗体[10 μ g/ mL]和 α -IFN γ 抗体[10 μ g/mL])，Thl 分化剂(IL-12 [10ng/mL]，α-IL-4 抗体[10 μ g/ mL])，Th2 分化剂(IL-4[10ng/mL]和 α -IFNy 抗体[10 μ g/mL])，Treg分化剂(TGF β [2ng/ mL])或者 Thl7 分化剂(IL-6[10ng/mL]，TGFβ [2ng/mL]，α -IL-4 抗体[10 μ g/mL]和 α -IFN γ抗体[10 μ g/mL])分别用于各个亚群的分化(IL-6，Proteintech公司；TGFb, R&D公司；其余均购自BD公司。)。4天以后，T细胞用50ng/ml PMA(Sigma)和500ng/ml 离子霉素(Sigma)和GolgiPlug(BD Pharmingen)孵育5个小时，然后进行细胞染色。在 某些试验中加入了药物，其种类和浓度分别是:Metformin(l μ Μ)，rosiglitazone (1 μ Μ)， BADGE (1 μ Μ)，wortmannin (1 μ Μ)，SB-202190 (0· 5 μ g/ml)，SP600125 (1 μ Μ)，Τ0901317 和 GW3965。Τ0901317和GW3965购自Sigma公司；其余购自康成公司。荧光素酶分析-Jurkat细胞用DEMRIE-C Reagent (Invitrogen)转染相应的质粒 (如各处所示)以及内参质粒PSV40- β -gal (Promega公司)，42小时以后，用PMA和离子霉 素刺激6个小时，然后使用Promega公司提供的试剂盒检测荧光素酶活性。免疫印迹，免疫沉淀和免疫荧光-细胞裂解后获取蛋白，然后用10% SDS-PAGE跑 胶，分离，转膜，阻断，一抗4°C过夜，二抗(羊抗鼠二抗；驴抗兔二抗均购自业力公司)室温 孵育一个小时。最后用Pierce提供的显色液显色。抗LXRa，LXR^，actin，Myc, FLAG的 抗体购自 Cell Signaling, AHR 的抗体购自 Ambion，SREBP-1 的抗体购自 BD Biosciences。 在免疫共沉淀实验中，分别用抗Myc或者FLAG或者SREBP-I的抗体沉降获得蛋白复合物， 做免疫印迹。在免疫荧光试验中，T细胞首先用多聚甲醛固定，用0. Triton X-100破 膜，然后分别孵育一抗和荧光标记的二抗，Confocal检测00倍油镜)前用DAPI染色5分 钟。染色质免疫沉淀(CHIP)-细胞首先用甲醛固定，而后裂解细胞，用对照抗体或者 SREBP-I抗体沉降，纯化出沉淀中的DNA作为模板，然后用两对引物扩增，2%琼脂糖凝胶电 泳检测PCR产物。
弓丨物 1 前5，-CCATACACACATGATA-3，(SEQ ID NO 1),引物 1 后5，-GGATGAAGAGTAGTGCTCCTT-3，(SEQ ID NO 2)；引物 2 前5，-GATGCTCTCTAGCCAGGGAA-3，(SEQ ID NO 3),引物 2 后5，-AGCATGACTTCTTGGGAGCT-3，(SEQ ID NO 4)；β -actin(CHIP)前5，-CAGCCAACTTTACGCCTAGC-3，(SEQ ID NO 5),β -actin(CHIP)后5，-TTTGGACAAAGACCCAGAGG-3，(SEQ ID NO :6)。电场泳动迁移分析(EMSA)-本发明人使用了 Pi erce公司的 LightShiftChemiluminescent试剂盒。简要的说，核蛋白准备好以后，和生物素标记的探针 孵育，然后跑6%聚丙烯酰胺胶。蛋白-DNA复合物转移到尼龙膜上，用紫外线交联，阻断非 特异结合，而后用亲和素-HRP孵育，最后用Pierce公司提供的显色剂显色。此外未标记的 野生型或者突变的探针作为对照。序列如下标记的探针生物素-5，-CATACACACATGATACTGAA-3，(SEQID NO 7)；未标记的探针5，-CATACACACATGATACTGAA-3，(SEQID NO :8)；未标记的突变探针5，-CATACATACATGATACTGAA-3，(SEQID NO 9)。实时定量PCR-将0. 5-1 μ g RNA反转成cDNA，1 μ 1新合成的cDNA作为模板，加入 到PCR反应体系中。使用ABI 7500 (Applied Biosystems)实时定量检测PCR反应。基因 表达都经过了 β-actin矫正。引物序列如下IFNy 前引物5，-TTGGCTTTGCAGCTCTTCCT-3，(SEQ ID NO 10),IFNy 后引物5，-TGACTGTGCCGTGGCAGTA-3，(SEQ ID NO 11)；IL-4 前引物5，-GGAGATGGATGTGCCAAACG-3，(SEQ ID NO 12),IL-4 后引物5，-CGAGCTCACTCTCTGTGGTGTT-3，(SEQ ID NO 13)；Foxp3 前引物5，-GGCAATAGTTCCTTCCCAGAGTT-3，(SEQ ID NO 14),Foxp3 后引物5，-GGGTCGCATATTGTGGTACTTG-3，(SEQ ID NO 15)；LXRa 前引物5，-CACGCCTACGTCTCCATCAA-3，(SEQ ID NO 16),LXRa 后引物5，-GCATCCGTGGGAACATCAG-3，(SEQ ID NO 17)；LXRβ 前引物5，-CAGACGCTACAACCACGAGACA-3，(SEQ ID NO: 18)，LXR^ 后引物5，-TCGTCCTTGCTGTAGGTGAAGTC-3，(SEQ ID NO 19)；IL-17 前引物5，-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3，(SEQ ID NO 20),IL-17 后引物5，-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3，(SEQ ID NO 21)；IL-17F 前引物5，-GAGGATAACACTGTGAGAGTTGAC-3，(SEQ ID NO 22),IL-17F 后引物5，-GAGTTCATGGTGCTGTCTTCC-3，(SEQ ID NO 23)；RORyt 前引物5，-CCGCTGAGAGGGCTTCAC-3，(SEQ ID NO 24)，1 01^{后引物5，-16。八66八61八660^。八117^八-3，(SEQ ID NO 25)；SREBP-Ia 前引物5，-GAGCTGGCCTTCGGT-3，(SEQ ID NO 26),SREBP-Ic 前引物5，-ATCGGCGCGGAAGCT-3，(SEQ ID NO 27),SREBP-la/c 后引物5，-TCAGGAGAGTTGGCA-3，(SEQ ID NO 28)；β -actin 前引物5，-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3，(SEQ ID NO 29)，3-&(；衍11后引物5，-61八01^。601^66八66八6-3，(SEQ ID NO :30)。流式细胞仪分析-为了染细胞表面的⑶4，T细胞用含有BSA的PBS重悬，加入荧光素标记的抗⑶4的抗体(eBioscience)，冰上孵育30分钟；为了染细胞内的细胞因 子，首先用4%多聚甲醛固定，而后用0. 皂素破膜，接着用荧光素标记的抗⑶4的抗体 (eBioscience)染色。最后本发明人使用FACSCalibur或者BDFACSAria来上机检测。逆转录病毒感染-为了在⑶4+T细胞中过表达基因，首先克隆该基因 的 cDNA 到载体 pMXs-IRES-GFP(Cell Biolabs)，为 了沉默 SREBP-I 或者 AHR 的表达，本发明人把下列序列克隆到载体pSilencer 5. 1 Retro (Ambion) SREBP-I (l#shRNA，5' -AACAGACACTGGCCGAGATGT-3' (SEQ ID NO :31)； 2#shRNA，5‘ -AAGACATGCTCCAGCTCATCA-3‘ (SEQ ID NO 32) ；3#shRNA， 5' -AAAGCTTGGCCTCCCAGCAGC-3' (SEQ ID NO :33);)以及 AHR(l#shRNA， 5，-AACATCACCTATGCCAGCCGC-3，(SEQ ID NO :34) ；2#shRNA，5’ -AACACAGAGTTAGACCGCCTG -3，(SEQ ID NO 35) ；3#shRNA，5，-AAAGTCATGGGATAAACTCAC-3，(SEQ ID NO :36))。本发明 人使用Platinum-Ε cell line (Cell Biolabs)包装逆转录病毒。初始CD4+T细胞在Thl7 或者ThO条件下预先刺激16个小时，而后和混有8 μ g/mL Polybrene (Sigma)Platinum-E 病毒上清在30°C离心1小时(2000rpm)。2 3天后做细胞染色。统计学分析-在EAE动物实验中，首先对每个时间点的两组数据进行单参数方差 分析，然后对两条曲线做Marm-Whiteny分析。Student's t检验用于其他比较。当P值小 于0. 05时，认为具有统计学差异。2.实验结果2. ILXR的激动剂抑制了体外的Thl7分化在众多的信号通路激活剂和抑制剂中，本发明人偶然发现了 LXR的激动剂 T0901317可以明显下调Thl7的分化(图1A)，而其他被检测的药物则没有明显作用。为了 证实LXR的激动剂对Thl7分化的抑制，本发明人使用了另外一种LXR的激动剂，GW3965，这 两种LXR的激动剂对Thl7的分化都具有梯度依赖的抑制(图1B)。2. 2LXR负调控体外Thl7分化既然L)(R激活以后可以下调Thl7的分化，那么L)(R是不是Thl7分化的一个负调节 因子？首先，在T细胞各个亚群ThO、Thl、Th2、Treg和Thl7中检测了 LXR两种亚型的mRNA 表达，如图2所示，LXR两种亚型的mRNA在 1ι17中是特异性的低表达。外源性表达LXR α和LXRi^可以下调Thl7的分化，而共同表达二者还有协同作用 (图3A)。在LXRa和LXRi^双表达的T细胞中，LXR的激动剂抑制了体外的Thl7分化(图 3B和3C)。本发明人还在LXR敲除的⑶4+T细胞中检测了 LXR的激动剂对体外的Thl7分 化的影响。T0901317和GW3965在LXR野生型而不是缺陷型的小鼠来源的CD4+T细胞中可 以梯度依赖的抑制 ι17的分化，而且LXR缺陷型的CD4+T细胞对Thl7诱导更加敏感，提示 LXR很可能是Thl7分化的一个负调节因子(图3D)。2. 3LXR 通过 SREBP-Ia 和 SREBP-lc 负调控体外 Thl7 分化通过IL-17启动子分析来解析LXR负调控体外Thl7分化的具体机制。首先把一 系列长度不同的IL-17启动子连接到萤火虫荧光素酶基因的前面，然后把这些质粒转染到 Jurkat细胞中，细胞培养液中含有T0901317或者对照溶剂。T0901317对IL-17启动子控 制下的荧光素酶表达有明显的抑制作用，但是这种抑制作用在启动子缩短至转录起始位点 上游_249bp的时候就消失了(图4A)。对IL-17启动子的这一区域(_261bp -M9bp)使用TESS软件(宾夕法尼亚大学医学工程和应用科学学院计算机生物和信息实验室)分析 显示这一区域含有一个SREBP-I的可能的结合位点E-box元件，缺失或者突变这个元件都 会破坏T0901317对IL-17启动子活性的抑制作用。所以发明人接下来想知道LXR激动剂 是不是通过改变SREBP-I (有两种亚型，分别是SREBP-Ia和SREBP-Ic)的表达来调节Thl7 的分化。Mangelstorf实验室曾经发现LXR激活以后会特异的促进小肠，肝脏和白色脂肪中 SREBP-Ic mRNA的表达，对SREBP-Ia则无显著影响(Itepa et al.，2000)。非常有趣的是， 在本申请的试验中，L)(R的激动剂可以同时上调这两种亚型(图4B)，提示了在不同组织中 LXR对SREBP-I的调控机理是不一样。接下来本发明人想知道SREBP-I能否直接结合到IL-17启动子上面(图4C和图 4D)。EMSA结果显示，一段对应IL-17启动子_261bp _M9bp的探针能够结合SREBP-I。此 外，未标记的探针而非未标记的突变探针能够竞争结合SREBP-I (图4C)。CHIP实验结果表 明在L)(R激活以后，大量的SREBP-I结合到了 IL-17启动子的这一区域上(图4D)。既然SREBP-I可以结合到IL-17的启动子上，那么SREBP-1对IL-17的转录活性 有什么影响呢？在荧光素酶报告基因分析中本发明人发现SREBP-Ia和SREBP-Ic可以剂量 依赖的抑制IL-17的转录活性，但是当E-box元件被删除或者突变掉以后这个抑制作用就 不复存在了(图4E)。为了进一步研究SREBP-Ia和SREBP-Ic在Thl7分化中的作用，本发 明人分别用逆转录病毒过表达或者使用shRNA(l#shRNA，5，-AACAGACACTGGCCGAGATGT-3，S EQ(SEQ ID NO 37) ；2#shRNA，5，-AAGACATGCTCCAGCTCATCA-3，(SEQ ID NO :38) ；3#shRNA, 5，-AAAGCTTGGCCTCCCAGCAGC-3，(SEQ ID NO :39))干扰 SREBP-la 和 SREBP-lc 的表达，实 验结果显示，SREBP-Ia和SREBP-Ic过表达和被抑制后会分别导致Thl7分化受到抑制或者 促进(图4F)。这里本发明人使用RT-PCR来检测SREBP-Ia和SREBP-Ic过表达或者被抑制 的效率，因为目前尚无抗体能够区分二者(图4G)。2. 4LXR通过干扰AHR来负调控体外Thl7分化对IL-17启动子进一步分析表明在SREBP-I结合位点临近的位置还有一个 AHR(Thl7分化的正调控因子)的结合位点(图5A)，这样一来，本发明人设想SREBP-I是不 是通过干扰了 AHR对IL-17转录的正调控作用来抑制Thl7的分化呢？为此，本发明人首先 通过免疫共沉淀作用检验L)(R激动剂或者对照溶剂处理过的Thl7细胞中的AHR和SREBP-I 可能的相互作用。使用抗SREBP-I抗体沉降下来的蛋白复合物做Western印记，可以检测 到AHR的条带(图5B)。而且非常有趣的是，即使在对照溶剂组处理的细胞中仍能检测到一 条微弱AHR条带，这暗示SREBP-I对AHR可能的拮抗作用是T细胞固有的一个限制Thl7分 化的机制，其生理意义可能是维持Thl7分化在一个合适的水平，不要引起自身免疫疾病。 本发明人还用了免疫染色检验AHR和SREBP-I的共定位。和前人的工作相一致，AHR作为 Thl7 分化的正调节因子，在 Thl7 中高表达(Kimura et al.，2008 ；Quintana et al.，2008 ； Veldhoen et al.，2008)，并且和SREBP-I有一些微弱的共定位(图5C，上面一排)。在激 活以前，SREBP-I定位内质网和核膜上。在L)(R激动剂存在的情况下，SREBP-I的N端被酶 解下来，转移到细胞核里。Confocal照片显示，在L)(R被激活以后，AHR和SREBP-I的共定 位明显增多了(图5C，中间一排和下面一排)。而且本发明人还注意到L)(R的激动剂下调 了细胞核里AHR的表达水平(图5C)。为了确定哪些结构域对与AHR和SREBP-I的相互作用是关键的，本发明人表达了带有Myc标签的SREBP-I和带有FLAG标签的AHR以及二者的一系列长度不等的突变体(图 5D)，然后共转到细胞中，做免疫共沉淀。全长的AHR和SREBP-I可以相互作用(图 5Ε)，但是当AHR的PAS结构域和SREBP-I的N端的酸性结构域缺失以后这种相互作用就没 有了(图5F和图5G)，这提示这两个结构域对二者的相互作用是至关重要的。在证实AHR和SREBP-I的相互作用以后，本发明人尝试弄清楚SREBP-I是怎样改 变IL-17启动子转录活性的。外源表达AHR可以上调IL-17启动子的活性，但是共表达AHR 和SREBP-Ia或者Ic则可以抑制这种上调。有意思的是，当共转一个突变型的SREBP-I或 者把E-box元件突变时不能抑制AHR对IL-17启动子活性的上调(图51)。另外，本发明人 还注意到，当用shRNA干扰AHR的表达以后，LXR的激动剂仍然可以下调Thl7的分化(图 5H和5J)，这一结果提示，SREBP-I依赖的对AHR的拮抗作用是主要的但可能不是LXR下调 Thl7分化的唯一解释。当然，这个也可能是由于shRNA不能完全抑制AHR的表达导致的。2. 5LXR激动剂缓解了 EAE发病除了体外实验以外，本发明人还在EAE动物模型中检测了 L)(R对Thl7分化的调节 作用。结果发现，GW3965或T0901317可以下调EAE发病的临床指数，而且可以下降最大发 病率(图6A和图6B)。而且有意思的是本发明人注意到了 LXR缺陷的小鼠比野生型小鼠 有更严重的病症，这个和本发明人在体外试验中发现的LXR敲除的CD4+T细胞具有更高的 Thl7分化是一致的(图3D)。组织切片染色数据表明，L)(R激动剂可以缓解L)(R野生型小鼠 的脊髓切片的淋巴细胞浸润和脱髓鞘状况，但是在L)(R敲除的小鼠中则是无效的(图6C)。除了 EAE临床发病指数和组织学分析，本发明人还检测了体内的细胞因子表达情 况。中枢神经系统(CNS)，脾脏和淋巴结中的IL-17和IFNy都是下调的(图7A)。为了证 实这一发现，本发明人还做了小鼠的脊髓切片的IL-17和IFNy染色。T0901317和GW3965 可以下调两种炎症因子在L)(R野生型而不是缺陷型的小鼠的脊髓切片的表达(图7B)。这 些实验数据表明，L)(R激动剂可以下降体内和体外的Thl7的分化。3.结果讨论自从发现Thl7亚群以来，人们发现了几个核受体在Thl7分化中起着重要的 作用，例如RORa (NRlFl), RORy (NR1F3)，AHR和NR2F6。在这个研究中，本发明人发现 LXRa (NR1H3)和LXRβ (NR1H2)通过激活SREBP-I负调控Thl7的分化。LXR同时作为胆固 醇的调控者和炎症性T细胞分化的调节者，把胆固醇代谢和细胞分化联系起来。在这种情 况下，胆固醇可能提供了一个限制炎症性T细胞分化和自身免疫疾病发病的信号。在半个 世纪以前，两个临床研究(Baker et al.，1965 ；Baker et al.，1964)表明多发性硬化患者 的胆固醇水平比正常人的要低，本发明人的研究解释了这个临床统计的原因，可能是因为 较低的胆固醇有利于Th 17分化和自身免疫疾病的发展。本发明人的研究还支持了这样一种分析胆固醇在多发性硬化病人体内病灶处可 能提供了一个自我保护机制。髓鞘是脑内胆固醇含量最高的组织(Saher et al.，2005)，当 髓鞘蛋白反应性的T细胞攻击髓鞘的时候，胆固醇泄露出来，进入了 T细胞，并在其中积聚， 氧化成LXR的内源配体氧化固醇，从而抑制IL-17的分化。LXR到底是免疫反应的正调节因子还是负调节因子至今尚有争论。有的报告说 L)(R对巨噬细胞的存活和抵抗病原菌入侵至关重要(Jos印h et al.，2004)，有的则说LXR 限制了 T细胞激活和获得性免疫功能(Bensinger et al.，2008)。最近一个研究发现LXR介导了巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬，从而避免了这些自身抗原暴露给T细胞从而诱发自身 免疫疾病(N et al.，2009)。这些实验结果表明L)(R在免疫中起的作用非常复杂，不能一言 定论，在本发明人这个研究中，本发明人发现了 L)(R是通过和另外一个核受体AHR的交叉对 话来完成对自身免疫疾病的负调控作用的。AHR是Thl7分化的一个重要的正调控因子，以前的报道说AHR可以直接和STATl、 STAT5(它们是Thl7分化的负调节因子)相互作用并且抑制STATl的磷酸化和活性，从而抑 制 ι17的分化(Kimura et al.，2008)。本发明人的工作显示AHR促进了 IL-17启动子活 性，而这个过程可以被SREBP-I抑制。本发明人的结果表明SREBP-I依赖的对AHR的拮抗 作用是LXR抑制Thl7分化的重要机制。但是在AHR的表达被shRNA干扰以后，LXR仍然能 够抑制Thl7的表达，这提示AHR拮抗作用可能并非唯一机制。而且，本发明人注意到LXR 激动剂可以下调AHR的表达，这个结果提示，LXR不仅控制着AHR的转录活性，还控制着AHR 的表达。此外，AHR和SREBP-I的相互作用以及共定位可以被L)(R激动剂增强，但是即使在 没有L)(R激动剂的情况下，二者仍然有较弱的相互作用和共定位，这就提示SREBP-I对AHR 的拮抗应该是T细胞进化获得的固有的机制，目的是为了限制Thl7的过量分化，维持机体 的免疫平衡。 ι17产生的过程是由AHR和SREBP-I的相互牵制来控制的。TGFi^和IL-6 促使AHR表达，使得平衡向Thl7分化倾斜，而LXR激动剂则加大SREBP-I的表达，使得该平 衡远离Thl7分化，从而使得整个免疫系统维持一个相对稳态。综上所述，本发明人发现了 L)(R是Thl7分化的一个负调节因子，其作用机制依赖 与SREBP-I介导的和AHR的对话。这个研究表明L)(R是炎症T细胞分化的一个代谢监控点， 揭示了 Thl7分化的调节者之间的交叉对话并且给自身免疫疾病治疗提供了新的靶点。4.采用检测LXR荧光素酶活性的方法来进行药物筛选L)(R激动剂将激活L)(R靶基因转录活性，所以可以根据含有LXR结合原件(LXRE) 的人工启动子控制的荧光素酶活性来筛选L)(R的激动剂。然后检查SREBP-I的活性等下游 试验进一步进行验证。构建含有LXRE的人工启动子。将LXRE重复四次，连接到荧光素酶编码序列的前 面，这样就形成了 LXR间接控制荧光素酶表达强度的系统(LXRE-Luciferase质粒)。将该 质粒转化到宿主细胞中。从药物筛选库中获得待筛选的药物。使待筛选的药物与宿主细胞 接触。如果某种待筛选的药物是LXR激动剂，该药物会激活LXR转录活性，从而启动荧光素 酶的表达。使用Luciferase报告基因检测试剂盒检测荧光素酶的表达。有荧光产生的待 选分子可能是LXR的激动剂。进一步地，还可检测SREBP-1、IL-17等的表达活性，与对照相比，能使SREBP-I的 表达升高、同时IL-17的表达降低的待选分子可进一步确定为LXR的激动剂。序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>LXR核受体激动剂在治疗和预防自身免疫性疾病中的应用<130)096570<160>39<170>PatentIn version 3.3<210>1
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<400>39aaagcnnggc cncccagcag c2权利要求
1.肝脏X受体和/或胆固醇调节元件结合蛋白-1在制备用于治疗IL-17介导的疾病 的药剂中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述IL-17介导的疾病是自身免疫疾病。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述自身免疫疾病选自多发性硬化症、银屑 病、类风湿关节炎、克罗恩病和银屑病关节炎。
4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述药剂含有肝脏X受体，或者 肝脏X受体的激动剂或抑制剂；或者是胆固醇调节元件结合蛋白-1、或其抑制剂或激动剂。
5.肝脏X受体和/或胆固醇调节元件结合蛋白-1在制备用于调节Thl7细胞的分化用 的物质中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述物质选自肝脏X受体、肝脏X受体的激 动剂、肝脏X受体的抑制剂、胆固醇调节元件结合蛋白-1、胆固醇调节元件结合蛋白-1的抑 制剂、或胆固醇调节元件结合蛋白-1的激动剂。
7.—种体外调节Thl7细胞分化的方法，该方法包括使用(1)肝脏X受体或其激动剂或抑制剂，或( 胆固醇调节元件结合蛋白-ι或其抑 制剂或激动剂处理CD4+T细胞，所述处理可以是体外或体内处理；和/或包括破坏IL-17的启动子区域，使其失去生物学活性。
8.一种筛选能调节Thl7细胞的分化的物质的方法，该方法包括使候选物质与表达肝脏X受体的细胞接触，和检测细胞中肝脏X受体、胆固醇调节元件结合蛋白-1和/或IL-17的表达水平，其中，能使上述任一种的表达水平发生明显变化的候选物质为能够调节Thl7细胞的 分化的物质。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，该方法还包括将所筛选得到的物质进一步 地与CD4+T细胞接触，检测该CD4+T细胞向Thl7细胞的分化是否受到影响，其中，能影响 CD4+T细胞向Thl7细胞的分化的物质确定为能调节Thl7细胞的分化的物质。
10.一种药物组合物，其特征在于，该组合物含有(a)肝脏X受体、肝脏X受体的激动剂、肝脏X受体的抑制剂、胆固醇调节元件结合蛋 白-1、胆固醇调节元件结合蛋白-1的抑制剂、或胆固醇调节元件结合蛋白-1的激动剂；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
全文摘要
本申请涉及LXR核受体激动剂在治疗和预防自身免疫性疾病中的应用。具体而言，本申请涉及肝脏X受体和/或胆固醇调节元件结合蛋白-1在制备用于治疗IL-17介导的疾病的药剂中的用途，还涉及肝脏X受体和/或胆固醇调节元件结合蛋白-1在制备用于调节Th17细胞的分化用的物质中的用途。本申请还涉及一种体外调节Th17细胞分化的方法和一种筛选能调节Th17细胞的分化的物质的方法。本申请还涉及用于所述用的药物组合物。
文档编号C12Q1/68GK102107001SQ20091020061
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者崔国梁, 秦莹 申请人:中国科学院上海生命科学研究院