专利名称：花椰菜杂交种dna指纹图谱的建立方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及花椰菜种子鉴定技术，具体地说是花椰菜杂交种DNA指纹图谱的建立 方法和应用。
背景技术：
目前，我国生产中推广应用的花椰菜(Brassica oleracea L. var. botrytisL)品 种许多为杂种一代。杂种一代能综合亲本的许多优良性状，经济效益较好。但是在制种过程中会由于管理措施不当和自交不亲和性本身的缺陷而常常产生 自交种子，即假杂种，导致种子纯度下降。因此，提高杂交种纯度是杂种优势利用研究领域 的重要课题。目前，品种鉴定和种子纯度分析方法大致有三种，即大田形态、生化标记和DNA 指纹图谱鉴定法。传统的大田鉴定法以种子、幼苗、叶、花、果实、花粉等组织器官的颜色、形 态等农艺性状作为鉴定的观测指标，在生产实践中虽然是一种较为可行的方法，但大田鉴 定需要额外占用土地，周期长、花费大，不仅受季节限制，而且很多性状的表现受栽培措施 及环境因子的影响，鉴定者的观察经验也制约着鉴定的准确性。大田鉴定最大的缺陷是不 能及时提供种子纯度信息，不能在种子大量交易前提供有关种子的质量信息，对种子质量 不能起到预先监督的作用。生化鉴定方法包括蛋白质电泳和同工酶电泳，已得到日益广泛 的应用，但不能完全显示品种间的多态性，难以对亲缘关系较近的品种进行有效的区分。
发明内容
本发明的目的是提供一种花椰菜杂交种DNA指纹图谱的建立方法和应用，以克服 现有技术存在的不足。本发明的技术构思是这样的DNA指纹图谱鉴定法是以DNA的多态性为基础的分子标记方法，可以弥补和克服 在种子纯度的形态学鉴定及同工酶、种子蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题。本发明利用 RAPD、SRAP技术构建了花椰菜杂交种与其亲本的DNA指纹图谱，可以为花椰菜杂交种的鉴 定和纯度检测提供科学依据，进而保护生产者和使用者的合法权益。本发明的花椰菜杂交种及其亲本的DNA指纹图谱，是由“1”和“0”组 成的数据。使用引物S140，花椰菜杂交种母本、Fl和父本的扩增数据分别为 001110111111、001111111111 和 110111111111。使用引物 M1-E18，数据分别为 11111111110111、11111111111111 和 11111111100111。使用引物 M8-E18，数据分别为 111111111111110011001,111111111111111111111 和 111011111101110110110。其中所述 数字“ 1，，表示图谱中某个位置上有扩增带存在，数字“0”表示在某个位置上没有扩增条带 存在。所说的花椰菜杂交种和亲本可以采用上海市农业科学院园艺研究所公开销售的 花椰菜DNA指纹图谱的建立方法，包括如下步骤
1)提取及纯化花椰菜基因组的DNA ；2)用获得的花椰菜DNA为模板进行RAPD、SRAP分析；3)选择有代表性的多态性扩增条带，根据所选择条带的有、无构建供试材料DNA 指纹图谱。其中所述花椰菜杂交种及其亲本都有其特异的DNA指纹，可以相互区分开 来。所述RAPD、SRAP扩增中采用的引物是由上海生工生物工程有限公司合成的寡核 苷酸引物。RAPD扩增采用的引物为S140:GGTCTAGAGG。SRAP扩增采用的引物为Ml TGAGTCCAAACCGGATA, M8 :TGAGTCCTTTCCGGTGC，E18 :GACTGCGTACGAATTCCT。本发明的DNA指纹图谱可以应用于花椰菜杂交种种子纯度的鉴定。本发明具有如下优点1、本发明创建了花椰菜杂交种及其亲本的DNA指纹图谱，公开了用DNA指纹分析 技术对花椰菜种子鉴定的研究结果，其建立方法能从遗传本质上对花椰菜种子进行鉴定， 因此准确、可靠。2、采用本发明，在对花椰菜种子样品进行真实检测时，用目前广泛应用的快速、微 量DNA提取法提取待测样品的DNA，用提取的DNA作为模板，进行RAPD、SRAP分析，在几个 小时内就可以知道该样品的DNA指纹，因此，就能迅速判断出它的真实性。3、由于本发明DNA指纹图谱是用图的形式表示，看起来比较直观、易懂；并由于转 换成了数码形式，便于计算机识读和分析。
附图为本发明建立的RAPD、SRAP指纹图谱，其中M为DGL 2000DNA标识；1为花 椰菜杂交种母本；2为花椰菜杂交种；3为花椰菜杂交种父本；箭头标出的为互补型特征片 段。A、B、C依次为引物M8-E18、M1-E18、和S140的扩增电泳图。
具体实施例方式实施例1本实施例采用SDS法提取花椰菜品种“早花60”及其亲本的基因组DNA，通过RAPD、 SRAP分子标记方法构建其DNA指纹图谱用于种子纯度鉴定。具体操作如下1、选用的试验材料材料为花椰菜杂交种“早花60”及其亲本。2、花椰菜DNA的提取及纯化按如下程序提取各个花椰菜材料的基因组DNA 取新鲜组织2g，在液氮中研磨成粉，置于50ml离心管，加入8ml提取液(IOOmM Tris pH 8. 0,50mM EDTA, 500mM NaCl，1. 5% SDS)，65°C情况下 30 分钟，不时颠倒混勻，加 2. 5ml 5M乙酸钾冰浴10分钟，加· 5ml氯仿，颠倒混勻，IOOOOrmp离心8分钟，取上清移入 新管，加2/3体积预冷异丙醇，颠倒混勻，-20°C置1-2小时，挑出絮状白色DNA，70%乙醇洗 1-2次，吹干，溶于IOOul (或适量)TE中，并在1 %琼脂糖凝胶上电泳，用标准λ DNA作对照， 估算花椰菜DNA样品的浓度，获得高纯度花椰菜DNA。3、用获得的高纯度花椰菜DNA为模板进行分子标记分析
RAPD 扩增反应采用 20yL 的反应体系，其中 25mmol/L MgC12 2. 0 μ 1,10XPCR Buffer 2. 0μ 1, lOmmol/L dNTP 0. 5 μ l,5U/y 1 Taq E 0. 2 μ 1，0. 1 μ mol/L 引物 3 μ 1， lOng/μ 1模板DNA 3 μ 1，灭菌双蒸水9. 3 μ 1。扩增程序为94°C预变性5min ；94°C变性 lmin，37°C退火 lmin，72°C延伸 1. 5min，40 个循环；72°C延伸 IOmin 后 4°C保存。PCR 产物 在1.5%琼脂糖凝胶中电泳1.5h，EB染色，Gel DocTM EQ 170-8060凝胶成像仪进行观察并 拍照分析。SRAP 扩增反应采用 20yL 的反应体系，其中 25mmol/L MgC12 2. OyL, 10XPCR Buffer 2. 0μ L, 10mmol/L dNTP 0. 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L，0· 1 μ mol/L 弓 |物 各3. 0 μ L，IOng/ μ L模板DNA 3. 0 μ L,灭菌双蒸水6. 4 μ L，加盖一滴矿物油进行扩增。扩增 程序为94°C预变性5min ；94°C变性lmin，35°C退火lmin，72°C延伸1. 5min，5个循环；94°C 变性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸1. 5min，35个循环；72°C延伸IOmin后4°C保存。扩增 产物用1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。反应结束后，PCR产物使用6%聚丙烯酰胺胶电 泳1. 5小时，采用快速银染法染色定影后拍照。4、引物筛选使用150个RAPD引物和30对SRAP引物对样品DNA进行PCR扩增，其中有118个 RAPD引物和全部的30对SRAP引物能扩增出清晰的条带，但大多数引物的扩增结果在双 亲及杂交种之间是一致的，不能起到鉴别的作用。最终筛选出2对SRAP引物(M8-E18和 M1-E18)可将双亲和Fl区分出来，另外还有1个RAPD引物(S140)可以将“早花60”的双 亲和Fl区分开(见图)。其中引物组合M1-E8在约650bp、250bp、200bp、190bp、170bp和 150bp处扩增出6条双亲的互补特征带，在约400bp处只在Fl扩增出特异条带；引物组合 E18-M1在约500bp处扩增出Fl的特异带。由此可见，3个(对)引物均能对“早花60”的 双亲和Fl进行有效鉴别。5、数字指纹的建立根据上述两种分子标记指纹图谱，以1和0分别代表某个等位基因位点扩增DNA 条带的有无，按照从上到下即由大片段向小片段的读带方向，将分子标记指纹图谱转换为 由1和0组成的字符串，即构成数字指纹。使用引物S140，“早花60”花椰菜的母本、杂交种和 父本的扩增数据分别为001110111111,001111111111和110111111111。使用引物M1-E18， 数据分别为 11111111110111,11111111111111 和 11111111100111。使用引物 M8-E18，数据 分别为 111111111111110011001、111111111111111111111 和 111011111101110110110。实施例2本发明的DNA指纹图谱用于“早花60”种子纯度的鉴定从制种基地生产的“早花60”杂交种中随机抽取50-80个单株，用微量DNA提取法 提取各单株样品的DNA，用提取的DNA作为模板，用相应的引物对其进行PCR扩增和电泳分 析。如利用S 140引物分析查出的单株DNA指纹是“001111111111”即为“早花60”真杂种 株，DNA指纹是“001110111111”或“110111111111”即为“早花60”亲本自交株，也就是假 杂种株。再如利用M8-E18引物分析查出的单株DNA指纹是“111111111111111111111”即为 “早花 60”真杂种株，DNA 指纹是“111111111111110011001”或“111011111101110110110” 即为“早花60”亲本自交株，也就是假杂种株。然后用假杂种株数除以总分析的株数，即可 获得制种基地生产的花椰菜杂交种的纯度，较大田种植调查纯度既省时又便捷，可以为花椰菜杂交种子的销售及时提供纯度信息。如果鉴定的纯度低于85%，就不能够作为种子进 行销售，以避免假种子伤农事件的发生。如果鉴定的种子纯度高于95%以上，就可以作为精 品种子销售，优质优价，使农民和种子经销商均获得好的经济效益。
权利要求
1.花椰菜DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤1)提取及纯化花椰菜基因组的DNA；2)用获得的花椰菜DNA为模板进行RAPD、SRAP分析；3)选择有代表性的多态性扩增条带，根据所选择条带的有、无构建供试材料DNA指纹 图谱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，花椰菜杂交种及其亲本的DNA指纹图 谱，是由“ 1”和“0”组成的数据，使用引物S140，花椰菜杂交种母本、杂交种和父本的扩增 数据分别为 001110111111,001111111111 和 110111111111。使用引物 M1-E18，数据分别 为 11111111110111、11111111111111 和 11111111100111。使用引物 M8-E18，数据分别为 111111111111110011001,111111111111111111111 和 111011111101110110110。其中所述 数字“ 1，，表示图谱中某个位置上有扩增带存在，数字“0”表示在某个位置上没有扩增条带 存在。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RAPD扩增采用的引物为S140 GGTCTAGAGG。SRAP 扩增采用的引物为 Ml :TGAGTCCAAACCGGATA，M8 :TGAGTCCTTTCCGGTGC 和 E18 :GACTGCGTACGAATTCCT。
4.权利要求2所述的方法建立的DNA指纹图谱的应用，其特征在于，用于花椰菜杂交种 种子纯度的鉴定。
全文摘要
本发明公开了一种花椰菜杂交种及其亲本DNA指纹图谱的建立方法和应用。建立方法包括1、花椰菜DNA的提取及纯化；2、用获得的高纯度花椰菜DNA为模板进行RAPD、SRAP分析；3、选择有代表性的多态性扩增条带构建供试材料DNA指纹图谱；在DNA指纹图谱中花椰菜杂交种及其亲本都有特异的DNA指纹，可以相互区分开来。由于本发明DNA指纹图谱是用图的形式表示，看起来比较直观、易懂；并将其转换成数码表示形式，便于计算机识读和分析。本发明可应用于花椰菜杂交种的种子纯度鉴定，结果准确、可靠，检测迅速。
文档编号C12Q1/68GK102108395SQ20091020083
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年12月25日
发明者缪体云, 薄天岳, 陈烨丽, 陈锦秀 申请人:上海市农业科学院, 上海科园种子有限公司, 上海科立特农科(集团)有限公司