专利名称：一种甘蓝型油菜ap2/erf家族转录因子基因及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及作物遗传育种领域，具体涉及一种甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子 基因及其制备方法和应用。
背景技术：
植物一生面临很多的生物和非生物胁迫，严重影响植物的生长发育，从而影响作 物的产量。植物在生长发育和对外界刺激的应答反应中，需要对各种逆境和发育信号作出 反应，这就要求对各种功能基因的表达进行精确调控。植物基因表达存在着精确的位置、时 间和空间上的次序性。研究表明导致这种基因表达差异的主要原因是转录因子在转录水 平上的调节作用。植物通过一系列信号传导激发相应的转录因子，从而启动相应功能基因 的转录表达，最后通过基因产物对外界信号在生理生化等方面作出合适的响应Yamaguchi 和Shinozaki，Annu Rev Plant Biol，2006，57 :781_803。很多基因被这些胁迫诱导表达， 以增强植物对逆境的抗性。转录因子是其中重要的一类调控基因，通过与顺式元件相互作 用调节植物对各种环境胁迫的适应。随着分子生物学与生物技术的发展，人们从分子水平对植物抗逆境胁迫开展了 多方面的研究，其研究范围主要集中在信号传导及基因表达调控等方面Xiong等，Plant Cell,2002,14 :165_183。目前已经从植物中分离克隆了数十类与提高逆境胁迫抗性相关 的功能基因Chinnusamy等，J Exp Bot，2004，55 :225_236。根据基因编码产物的功能，可 将它们分成两个大类(1)编码直接保护细胞免受逆境胁迫伤害的功能蛋白的基因(如胚 胎发育晚期丰富LEA蛋白、抗冻蛋白、水通道蛋白、离子通道蛋白和伴侣蛋白等)，编码渗透 调节因子合成酶的基因(如糖醇、脯氨酸、甜菜碱等)，编码毒性物质的降解酶的基因(如谷 胱甘肽-S-转移酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及抗坏血酸过氧化物酶等)。抗逆相关功 能蛋白基因的克隆及功能研究，为通过基因工程改良植物的抗逆性开辟了新途径。人们将 与提高逆境胁迫抗性相关的功能蛋白基因进行遗传转化，使转基因植物的抗逆性有了不同 程度的提高。目前已经通过LEA蛋白基因、脯氨酸合成酶基因及甜菜碱合成酶基因的转化， 获得了一些抗旱、耐盐性显著提高的转基因植物。(2)逆境胁迫下信号传导及转录调控有关 的基因，包括感应及转导胁迫信号的蛋白激酶(如MAP激酶、CDP激酶、受体蛋白激酶、核 糖体蛋白激酶和转录调控蛋白激酶等)，信号传导中起重要作用的蛋白酶(如磷酸酯酶、磷 脂酶C等)，抗逆相关的转录因子基因有bZIP转录因子、WRKY转录因子、MYC/MYB类、AREB 类及AP2/ERF类转录因子等刘强等，科学通报，2000，45 :1465_1474。AP2/ERF家族是植 物中重要的一类转录因子，包含一个高度保守的AP2-DNA结合域，其基因编码的产物具有 广泛的功能Okamuro 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997,94 :7076-7081 。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因，其碱基序列为SEQ ID No 1。所述转录因子基因编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID No 2。所述甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因为&iaERF-B3_8基因。所述&iaERF-B3_8基因编码阅读框由603bp组成，编码成一个200个氨基酸的蛋 白质。所述甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因在制备抗逆转基因植物中的应用。所述甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因用于植物转化。所述甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因的制备方法，包括以下步骤1)油菜cDNA文库的构建选取油菜幼苗提取总RNA，以总RNA为模板、Oligo (dT) 为引物，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA。2)设计一对弓丨物正向引物 GGATCCATGGCAACTA TTGAGGAAATC,反向引物 GAGCTCTC AGAATTCGTTTGATGATGAATTGC ；以上述cDNA为模板进行PCR扩增，获得油菜AP2/ERF家族转 录因子基因&iaERF-B3-8基因片段。3)将上述扩增片段回收后克隆入T载体，测序后即获得油菜抗逆AP2/ERF家族转 录因子BnaERF-B3-8基因。上述制备方法的具体实验步骤如下1.油菜cDNA文库的构建本发明将油菜种子经(VZV)NaOCl消毒后种植在黑土 珍珠岩蛭石 (1:1: 1)混合基质中，22°C、1^1光照培养生长20d。选生长健壮的幼苗提取总RNA。以 总RNA为模板，Oligo (dT)为引物，参照东洋纺上海生物科技有限公司cDNA合成试剂盒说 明(http://www. bio-toyobo. cn/)，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA。2.引物的设计与合成设计一对引物，引物两端分别引入Bam HI和Me I的酶切位点。正向引物 GGATCCATGGCAACTA TTGAGGAAAT C ；反向引物 GAGCTCTCAGAATTCGTTTGATGATGAATTGC。引物 由上海生工生物工程技术有限公司合成(http://WWW. sangon. com/)。3. PCR方法获得甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子&iaERF-B3_8基因片段PCR扩增采用大连宝生物工程有限公司(http://takara. com. cn/)的PCR试剂，在 50 μ 1的体系中进行PCR反应，反应参数为94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共 扩增30个循环，再72°C延伸lOmin。经过1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约 600bp的片段(参见图1)。4.克隆鉴定与序列测定扩增片段采用杭州维特洁生化技术有限公司(ymi axygen. com. cn/)DNA琼脂糖 凝胶回收试剂盒，回收后克隆到大连宝生物工程有限公司(http://takara.com.cn/)的 pMD-18-Simple T载体上进行克隆鉴定和序列测定。5.序列分析通过核苷酸序列测定分析，获得甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子&iaERF-B3_8 基因片段，它具有如下的碱基和氨基酸序列信息。碱基序列1 ATGGCAACTATTGAGGAAATCTCTGATTTGGAGAAGCATCTCTTTGAAGACTTGATGATC
61CCTGATGGTTTCATGGAAGATTTTGTCTTTGATGACGCTGCTTTTTTCTCAGGACTCTGG
121TCTCTAGAACCCTTAAACCAAGTTCCTAAACAGGAGCCTAGTTCACCGGCTCTTGATCCA
181GATTTCTATGTCCAAGAGTTTCTGCAAATGGAAGCAGAATCATCATCATCAACAACAACA
241ACAACTACAACTACAACATCACCTGAGGTTGAAACTGTCTCAAACCGGAAAAGATCAAAG
301AGAGCTGAAGAGACAAGGCATTACAGAGGCGTGAGAAGGAGGCCATGGGGAAAATTCGCA
361GCAGAGATTCGAGATCCGGCGAAGAAAGGATCAAGGATTTGGCTAGGCACTTTTGAGAGT
421GATATTGATGCTGCAAGAGCTTATGACCATGAAGCTTTTAAGCTCGGGGGAAGAAAAGCT
481GTGCTCAACTTTCCTTTGGACGCAGGAAAGTATGATGCTCCGGTCAATTCTTGCCGGAAG
541AGGAGAAGAAACGATGTGCCGGAGCCTCAAGGAACAACTACGAGCAATTCATCATCAAAC
601TGA 氨基酸序列1MATIEEISDLEKHLFEDLMI
21PDGFMEDFVFDDAAFFSGLW
41SLEPLNQVPKQEPSSPALDP
61DFYVQEFLQMEAESSSSTTT
81TTTTTTSPEVETVSNRKRSK
101RAEETRHYRGVRRRPWGKFA
121AEIRDPAKKGSRIWLGTFES
141DIDAARAYDHEAFKLGGRKA
161VLNFPLDAGKYDAPVNSCRK
181RRRNDVPEPQGTTTSNSSSN本发明实现的有益效果本发明克隆了甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因&iaERF-B3_8，为了进一步 分析该基因在低温逆境中的作用与功能，比较了转&iaERF-B3-8基因的拟南芥植株和野 生型拟南芥植株对低温胁迫的耐受性。结果表明野生型和转&iaERF-B3-8基因拟南芥 植株在存活率上有明显的差异，转基因植株比野生型拟南芥有明显的抗冻能力，这也表明 BnaERF-B3-8的转入提高了拟南芥植株的抗低温的能力。
图1为琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。图2为转&iaERF-B3_8基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株对低温胁迫的耐受 性，其中A为转&iaERF-B3-8基因的拟南芥植株，B为野生型拟南芥植株。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。下述实施例中，所用的试验材料及其来源分别如下双低甘蓝型油菜沪油15(Brassica napus L. Huyou 15)的种子经过(ν/ν) NaOCl消毒后种植在黑土 珍珠岩蛭石(1 1 1)的基质中，22°C，培养(16h光照，8h 黑暗，冷光源)生长20天。
6
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 α和酿酒酵母菌株由上海市农业科学院生物 技术研究所植物基因工程研究室保存。克隆载体pMD-18-SimpleT、各类限制性内切酶、 Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10XPCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公 司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。ABI PRIAM Big-DyeTerminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行Sambrook J, Frets E F, Mannsdes T et al. In :Molecular Cloning. 2nd ed. Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989。实施例1双低甘蓝型油菜沪油15幼苗RNA的抽提和cDNA合成(一 )试验方法1、RNA 的抽提加入IOOmL提取缓冲液(油菜RNA提取缓冲液配方CTAB 3% (ff/V) ；PVP 3% (W/ V) (Mw 4000) ；EDTA 25mM ；NaCl 2.OM ；Tris-HClIOOmM, pH 8.0 ；Spermidine 0.5g/L ；DEPC 0. 1% (V/V) ；0. 1% DEPC 处理的 SDS 0. 5% (W/V) ；0. 1% DEPC 处理的 LiCl 10Μ)到 50mL 聚丙烯管，65°C预热；称取5g植物材料倒入液氮使材料始终保持冻结和易碎的状态，研磨；研磨后细粉转移至预先加入65°C预热的提取缓冲液的50mL离心管；将离心管放入65°C水浴45min，并偶尔摇动以混合各成分；加入等体积氯仿-异戊醇混合液，轻柔地上下颠倒混合约IOmin ；在18°C，于 12000g 离心 IOmin ；吸取上清液，重复5，6步骤操作；吸取上清液，加入1/4体积的10M LiCl溶液，彻底混勻，4°C放置12h ；在4"C，12000g 离心 30min ；RNA沉淀用500 μ L 0. 5% SDS轻柔溶解，用氯仿-异戊醇混合液抽提，4°C，12000g 离心30min ；上清液转移至另一新的管子，加入2倍体积_20°C冰冷的无水乙醇，充分混合，放 置在_20°C条件下2h，沉淀总RNA ；12000g，4°C离心30min，用75%乙醇漂洗两次，保留RNA，真空风干；用200yL DEPC处理的去离子水重新溶解，取少量用于RNA质量和浓度的检测，其 余储存于_70°C，备用。2、cDNA 合成加入01igo(dT)20(10pmol/y L) 1 μ 1 ；总 RNA :10 IOOng ；补足 RNase Free H20 至Ij 12 μ L。65°C，5min后，立即置于冰上。再加入5 X RT Buffer 4 μ L ；dNTP Mixture (各 IOmM) 2 μ L ；RNaseInhibitor (10U/ yL)lyL;反转录酶IyL0反转录反应过程为30°CIOmin ；42°C 20min ；85°C 5min ；4°C 5min。瞬间离心，保存。
( 二)试验结果采用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物，结果可见明显的RNA条带。实施例2PCR方法获得甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因&iaERF-B3_8基因片段(一 )试验方法设计一对正向和反向引物，为了克隆鉴定等构建的需要，引物两端分别引入Bam HI和Me I的酶切位点。PCR 反应体系10 XPCR buffer 5. 0 μ L ;dNIPs (各 2. 5mM) 4 μ L ；双低甘蓝型油菜 沪油15的cDNA模板1 μ U20ng)；正向引物0. 5yL;反向引物0. 5yL ；Ex-Taq 0. 4 μ L(预 变性后加入)；加无菌水定容至50 μ L。PCR反应程序94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延 伸lmin，共扩增30个循环，再72°C延伸IOmin0( 二)试验结果经过1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约600bp的片段(参见图1)。实施例3克隆鉴定、序列测定(一)试验方法扩增片段采用杭州维特洁生化技术有限公司DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后 克隆到大连宝生物工程有限公司的pMD-18-Simple T载体上进行克隆鉴定和序列测定。通过核苷酸序列测定分析，最终获得甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因 &iaERF-B3-8基因，具有如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2的碱基和氨基酸序列信息(参见序 列表)。( 二)试验结果测序分析结果显示甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因&iaERF-B3_8基因编码 阅读框由603bp组成，编码成一个200个氨基酸的蛋白质。实施例4拟南芥转化(一 )试验方法1.农杆菌的准备1)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250转/分钟培养20h。2)取ImL菌液转接入20_30mL LB液体培养基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250 转 / 分钟培养约 12h，测 OD 600 ^ 1. 5。3)8000转/分钟，4°C，IOmin离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5%蔗糖， 0. 05% Silwet L-77)并稀释至 OD 600 ^ 0. 8。2.拟南芥蘸花法转化1)将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约IOs后取出，全部转化完毕后，托盘 中加入水，用保鲜膜罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置22°C避光培养，24h去掉保鲜
膜直立培养。2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。3)生长约两个月后，收集种子，4°C冰箱贮存待用。(二)试验结果经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。实施例5拟南芥种子的筛选(一)试验方法1)称25-30mg种子放入1. 5mL离心管。2) ImL 75%乙醇消毒Imin (不停摇晃振荡)，8000转/分钟离心5s，去上清。3)加入ImL过滤后的漂白粉(5% )消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)，8000 转/分钟离心&，去上清。4)无菌水洗涤3-4次。5)将种子均勻的播撒到V2MS平板(潮霉素50μ g/mL)上，Parafilm膜封口，4°C 冰箱放置两天，220C，16h光照培养6天。6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(Ttl) 培养至开花结实，收集Ttl植株上所结T1种子。实施例6转录因子基因&iaERF-B3-8转化植物后的抗逆分析幼苗生长四周后将幼苗放置于_20°C冷冻处理50分钟，然后于_4°C恢复M小时 后，在光照培养室恢复生长一周后拍照。结果表明野生型和转甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因&iaERF-B3_8拟南 芥植株在幼苗期抗冻性能上有明显的差异，转基因植株比野生型拟南芥抗冻能力有明显提 高(参见图2)。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围中。
0123]序列表0124]<110>上海市农业科学院0125]<120> 一种甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因及其制备方法和应用0126]<160>20127]<170>PatentIn version 3. 30128]<210>SEQ ID No 10129]<211>6030130]<212>DNA0131]<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)0132]<400>0133]1 ATGGCAACTATTGAGGAAATCTCTGATTTGGAGAAGCATCTCTTTGAAGACTTGATGATC0134]61 CCTGATGGTTTCATGGAAGATTTTGTCTTTGATGACGCTGCTTTTTTCTCAGGACTCTGG
121 TCTCTAGAACCCTTAAACCAAGTTCCTAAACAGGAGCCTAGTTCACCGGCTCTTGATCCA181 GATTTCTATGTCCAAGAGTTTCTGCAAATGGAAGCAGAATCATCATCATCAACAACAACA241 ACAACTACAACTACAACATCACCTGAGGTTGAAACTGTCTCAAACCGGAAAAGATCAAAG301 AGAGCTGAAGAGACAAGGCATTACAGAGGCGTGAGAAGGAGGCCATGGGGAAAATTCGCA361 GCAGAGATTCGAGATCCGGCGAAGAAAGGATCAAGGATTTGGCTAGGCACTTTTGAGAGT421 GATATTGATGCTGCAAGAGCTTATGACCATGAAGCTTTTAAGCTCGGGGGAAGAAAAGCT481 GTGCTCAACTTTCCTTTGGACGCAGGAAAGTATGATGCTCCGGTCAATTCTTGCCGGAAG541 AGGAGAAGAAACGATGTGCCGGAGCCTCAAGGAACAACTACGAGCAATTCATCATCAAAC601 TGA<210>SEQ ID No 2<211>200<212>PRT<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)<400>
0149]1MATIEEISDLEKHLFEDLMI0150]21PDGFMEDFVFDDAAFFSGLW0151]41SLEPLNQVPKQEPSSPALDP0152]61DFYVQEFLQMEAESSSSTTT0153]81TTTTTTSPEVETVSNRKRSK0154]101RAEETRHYRGVRRRPWGKFA0155]121AEIRDPAKKGSRIWLGTFES0156]141DIDAARAYDHEAFKLGGRKA0157]161VLNFPLDAGKYDAPVNSCRK0158]181RRRNDVPEPQGTTTSNSSSN
权利要求
1.一种甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因，其特征在于，所述转录因子基因的碱 基序列为SEQ ID No 1，具体如下1 ATGGCAACTATTGAGGAAATCTCTGATTTGGAGAAGCATCTCTTTGAAGACTTGATGATC 61 CCTGATGGTTTCATGGAAGATTTTGTCTTTGATGACGCTGCTTTTTTCTCAGGACTCTGG 121 TCTCTAGAACCCTTAAACCAAGTTCCTAAACAGGAGCCTAGTTCACCGGCTCTTGATCCA 181 GATTTCTATGTCCAAGAGTTTCTGCAAATGGAAGCAGAATCATCATCATCAACAACAACA 241 ACAACTACAACTACAACATCACCTGAGGTTGAAACTGTCTCAAACCGGAAAAGATCAAAG 301 AGAGCTGAAGAGACAAGGCATTACAGAGGCGTGAGAAGGAGGCCATGGGGAAAATTCGCA 361 GCAGAGATTCGAGATCCGGCGAAGAAAGGATCAAGGATTTGGCTAGGCACTTTTGAGAGT 421 GATATTGATGCTGCAAGAGCTTATGACCATGAAGCTTTTAAGCTCGGGGGAAGAAAAGCT 481 GTGCTCAACTTTCCTTTGGACGCAGGAAAGTATGATGCTCCGGTCAATTCTTGCCGGAAG 541 AGGAGAAGAAACGATGTGCCGGAGCCTCAAGGAACAACTACGAGCAATTCATCATCAAAC 601 TGA。
2.如权利要求1所述的甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因，其特征在于，所述转录基因编码的蛋白质，3ζ氨基酉I序列为SEQIDNo 2，具体如下1MATIEEISDLEKHLFEDLMI21PDGFMEDFVFDDAAFFSGLW41SLEPLNQVPKQEPSSPALDP61DFYVQEFLQMEAESSSSTTT81TTTTTTSPEVETVSNRKRSK101RAEETRHYRGVRRRPWGKFA121AEIRDPAKKGSRIWLGTFES141DIDAARAYDHEAFKLGGRKA161VLNFPLDAGKYDAPVNSCRK181RRRNDVPEPQGTTTSNSSSN。
3.如权利要求1所述的甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因，其特征在于，所述转录 因子基因为BnaERF-B3-8基因。
4.如权利要求3所述的甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因，其特征在于，所述 BnaERF-B3-8基因编码阅读框由603bp组成，编码成一个200个氨基酸的蛋白质。
5.一种制备权利要求1所述的油菜AP2/ERF家族转录因子基因的方法，包括以下步骤1)油菜cDNA文库的构建选取油菜幼苗提取总RNA，以总RNA为模板、Oligo(dT)为引 物，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA ；2)设计一对弓丨物正向引物GGATCCATGGCAACTA TTGAGGAAATC,反向引物 GAGCTCTCAGAA TTCGTTTGATGATGAATTGC ；以上述cDNA为模板进行PCR扩增，获得油菜AP2/ERF家族转录因 子基因&iaERF-B3-8基因片段；3)将上述扩增片段回收后克隆入T载体，测序后即获得油菜抗逆AP2/ERF家族转录因 子 BnaERF-B3-8 基因。
6.如要求1所述的甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因在制备抗逆转基因植物中的应用。
7.如要求1所述的甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因在植物转化中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因及其制备方法和用途。所述甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因为BnaERF-B3-8，其碱基序列为SEQ ID No 1，其蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No 2。本发明利用聚合酶扩增技术从油菜幼苗中克隆甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子基因序列，所获得的转录因子基因用于植物转化，培育提高植物抗逆性。
文档编号C12N15/10GK102094025SQ20091020101
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 熊爱生, 田永生, 赵伟, 金晓芬, 高峰 申请人:上海市农业科学院