专利名称：热稳定脂肪酶,其编码基因的表达及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体的说，涉及一种突变的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)来源的脂肪酶，其编码基因，及含有该编码基因的重组质粒和用于表 达目标脂肪酶蛋白的重组菌株；本发明还涉及所表达的热稳定脂肪酶的用途。
背景技术：
脂肪酶(lipase，EC3. 1. 1. 3，甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶，在动植物组织及多 种微生物中普遍存在，其天然底物是生物产生的天然油脂，是最早被研究的酶类之一。自 1834年兔胰脂肪酶的活性报道至今，有关脂肪酶的研究已有上百年的历史。20世纪初国外 科研人员首次发现了微生物脂肪酶。微生物脂肪酶种类多，比动植物酶的作用PH、作用温度 以及对底物的专一性类型更广，便于进行工业化生产和获得高纯度酶制剂，这些因素促进 了微生物脂肪酶的研究，也极大地带动了脂肪酶在各领域中的基础和实际应用等方面的研 究。目前脂肪酶已经成为重要的工业用酶之一。脂肪酶的应用虽不如淀粉酶、蛋白酶广泛，但在许多方面已显示出不可估量的开 发潜力。据报道，脂肪酶占总用酶频度的25%左右。利用其天然底物长链脂肪酸酷(各种 油脂等)，脂肪酶可在异相系统油-水界面或有机相中起作用，并且具有一定的位置专一 性。脂肪酶在国内洗涤剂、制革、水产、饲料、生物化工、造纸、油脂化工、医药、环保等行业已 表现出十分重要的应用潜力，目前许多工业生产中已大量使用了脂肪酶。另外脂肪酶以其 来源广泛、催化功能多样以及催化底物类型广泛(酯、酸、醇、酸酐、酰胺等都可以成为它的 底物)等优点也已经使其成为生物技术及有机合成方面应用最广泛的一类酶。脂肪酶是一类作用于甘油酰基的酶，这类酶的活性包括两个方面，专一性水解甘 油酯键，释放更少酯键的甘油酯或甘油以及脂肪酸；在无水或少量水体系中催化水解的逆 反应，即酯化反应。脂肪酶温和的操作条件，优良的立体选择性，以及保护环境等特点使它 在有机合成，脂肪性质改良中有特殊的吸引力。但它应用的主要障碍有两点，一是成本高， 这一点已由固定化技术得到大大改进；二是稳定性与活性，这正是当今生化研究集中解决 的问题。脂肪酶应用研究日益增加，采用它进行的新型食品开发也正成为众多科学家的研 究的课题。脂肪酶应用的现状及前景可以归结为(1)广泛用来开发新型生化转移反应，已 有上百种采用脂肪酶的生化反应器报道，主要以固定化酶反应器为多大大提高了反应的得 率。( 它使用及建议使用的工业用途将大大超过蛋白酶和糖化酶的应用。因此，脂肪酶的 重要之处是它们的潜在用途而不仅是目前的应用水平。我国脂肪酶的研究仅有40多年历史，20世纪60年代末才有报道。1967年，中国 科学院微生物研究所筛选到一株解枝假丝酵母(Caudida lipolytica) AS2. 1203，并于1969 年制成酶制剂投放市场。20世纪70年代末我国开始碱性脂肪酶的研究，施巧琴于1981年 发表了我国第一篇关于碱性脂肪酶生产菌(Penicillium exansum)选育的研究论文，并且 于1984年首次在江苏南通投人生产。进人90年代，我国科技工作者紧跟国际研究热点，脂 肪酶的研究进人快速发展时期，这些都促进和加快了我国脂肪酶领域的研究工作。
我国脂肪酶的研究在1995 2001年的7年间，基础研究发展较快，其中以性质研 究工作最多，醋合成及产酶条件的研究次之，而有关酶结构功能、酶反应动力学、分子生物 学等方面的研究相对较少，特别是结构和性质作为不可分割的两个方面，现在却产生了较 大的差距。我们知道结构决定性质，只有将性质研究与结构研究结合起来，才能整体上推动 脂肪酶的基础研究。产生这种不平衡现象的主要原因是这部分工作属纯基础性的研究，与 过去我国的科研水平和宏观导向有一定的关系。另外，脂肪酶的应用研究在此期间呈现一 定的增长趋势，其中以油脂化工、洗涤剂、生物化工方面居多，环保研究最少。我国脂肪酶的基础研究、应用研究有了较深入的开展。我们还应看到就微生物脂 肪酶而言，虽在产酶条件、性质、酶促水解、合成、交换及工业应用上研究了几十年，但由于 脂肪酶结构和性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性和纯化困难以及应用范围不 广泛等问题，使得其研究进展与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多也窄得多。我们仍有许多工作 要做，结构研究、动力学研究、分子生物学研究仍是我们应重点加强的基础理论研究，同时 还要重视成果的产业转化，加强应用研究，加强环保方面的研究，使我国的脂肪酶研究在国 际上能逐渐占有重要位置。近年来，基因技术简化了下游加工，使微生物脂肪酶的产量增加了许多倍。而且引 入变性剂和诱导剂使我们有可能取得具有优势三维结构的脂肪酶，因为使用诱导剂和脂肪 酶生产出的产品具有专一性定向性和特殊的应用。随着研究的深入，脂肪酶的工业应用将 不断增加。因此，目前对于采用新方法获得新型有工业价值的脂肪酶有潜在的需要。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种新的脂肪酶，以使其满足工业上的需要。本发明的第一个方面公开了一种分离的脂肪酶，其含有如SEQ ID NO 2所示的氨 基酸序列。在该方面的一个优选例中，所述脂肪酶的氨基酸序列与SEQ IDNO :2具有至少有 至少50 %，优选至少60 %，更优选至少70 %，再优选至少80 %，更优选至少90 %，最优选至 少95%的相同性。在该方面的另一个优选例中，该脂肪酶还包括其功能性片段。在该方面 的一个最优选例中，该脂肪酶的氨基酸序列是SEQ ID NO :2。在本发明的另一个方面，提供了一种编码上述脂肪酶的核酸分子。在一个优选例 中，它具有如SEQ ID NO :1所示的核酸序列。在该方面的一个优选例中，所述核酸分子与 SEQ ID NO: 2具有至少有至少50%，优选至少60%，更优选至少70%，再优选至少80%，更 优选至少90%，最优选至少95%的相同性。在该方面的一个最优选例中，该核酸分子的核 苷酸序列是SEQ ID NO :2ο在本发明的第三个方面，提供了 一种载体，其包含上述多核苷酸。在本发明的第四个方面，提供了一种细胞，其包含上述载体，或其基因组中整合有 上述多核苷酸。在本发明的第五个方面，提供了上述脂肪酶的用途，用于催化酯合成、手性拆分或 将植物油转化为生物柴油。在本发明的第六个方面，提供了一种组合物，该组合物中含有上述脂肪酶和载体。 在该方面的一个优选例中，载体选自食品上、工业上、药用上的载体。在本发明的第七个方面，提供了一种生产上述脂肪酶的方法，包括培养上述宿主细胞，从培养物中分离出表达产物。在本发明的第八个方面，提供了一种将植物油转化为生物柴油的方法，包括用上 述脂肪酶处理植物油。在本发明的第九个方面，提供了一种催化酯合成的方法，包括在无水或少量水体 系中用上述脂肪酶催化酯化反应。在本发明的第十个方面，提供了一种手性拆分的方法，包括用上述脂肪酶催化手 性拆分。
图1 来自枯草芽孢杆菌的编码脂肪酶的核酸序列Lip CelKSEQ ID NO 1)及其 编码的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。图2 枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶在质粒pTrCHis2上的重组子结构图。图3 大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶的最适反应pH，以pH对相对酶活 力(％ )作图。图4 大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶的最适反应温度，以温度对相对 酶活力(％ )作图。图5 大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶的pH稳定性，以pH对残余酶活力 (%)作图。图6 大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶的热稳定性，以温度对残余酶活 力(％)作图。图7 大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶发酵过程中样品的SDS-PAGE电泳 图。图8 纯化后大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶的SDS-PAGE电泳图。图9 纯化后大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶的PAGE电泳图。图10 大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性 随时间变化的图。图11 脂肪酶催化酯合成的标准色谱图。图12 脂肪酶催化手性拆分的标准色谱图。图13 脂肪酶催化产生生物柴油的标准色谱图。
具体实施例方式通过对枯草杆菌的筛选，发明人发现了一种新型脂肪酶，其热稳定性好，具有高度 的应用性能。在此基础上完成本发明。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原 始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化 的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化 的。如本文所用，“分离的脂肪酶”是指该脂肪酶基本上不含天然与其相关的其它蛋 白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化脂肪酶。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。脂肪酶的纯度能用氨基酸序 列分析。本发明的脂肪酶可以是重组蛋白(多肽)、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本 发明的脂肪酶可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真 核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所 用的宿主，本发明的脂肪酶可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的脂肪酶还可包 括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括脂肪酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生 物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然脂肪酶相同的生物学功能或活性的蛋白。本 发明的脂肪酶片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是 由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成 熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋 白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或 用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的 教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“脂肪酶”指具有脂肪酶活性的SEQ ID NO 2的氨基酸序列的蛋 白。该术语还包括具有与脂肪酶相同功能的、SEQ ID NO :2序列的变异形式。这些变异形 式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，最 佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个 (通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中， 用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和 /或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括脂肪酶的 活性片段和活性衍生物。该脂肪酶的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱 导突变体、在高或低的严紧度条件下能与脂肪酶的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用 抗脂肪酶的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他蛋白，如包含脂肪酶或其片段 的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白外，本发明还包括了脂肪酶的可溶性片段。通常，该片段 具有脂肪酶序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50 个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。发明还提供脂肪酶的类似物。这些类似物与天然脂肪酶的差别可以是氨基酸序列 上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或 诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产 生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同 于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基 酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的脂肪酶并不限于上述例举的代表性的 蛋白。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动 物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪 氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优 化了溶解性能的蛋白。在本发明中，“脂肪酶保守性变异蛋白(多肽)”指与SEQ ID NO 2的氨基酸序列 相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似 或相近的氨基酸所替换而形成蛋白。这些保守性变异蛋白最好根据表1进行氨基酸替换而 产生。表 权利要求
1.一种分离的脂肪酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.—种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的脂肪酶。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，其核酸序列如SEQID N0:1所示。
4.一种载体，其特征在于，所述的载体包含权利要求2所述的多核苷酸。
5.一种细胞，其特征在于，其包含权利要求3所述的载体，或其基因组中整合有权利要 求2所述的多核苷酸。
6.如权利要求1所述的脂肪酶的用途，其特征在于，用于催化酯合成、手性拆分或将植 物油转化为生物柴油。
7.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的脂肪酶和载体。
8.—种生产权利要求1所述的脂肪酶的方法，其特征在于，包括培养权利要求5所述 的细胞，从培养物中分离出表达产物。
9.一种将植物油转化为生物柴油的方法，其特征在于，包括用权利要求1所述的脂肪 酶处理植物油。
10.一种催化酯合成的方法，其特征在于，在无水或少量水体系中用权利要求1所述的 脂肪酶催化酯化反应。
11.一种手性拆分的方法，其特征在于，用权利要求1所述的脂肪酶催化手性拆分。
全文摘要
公开了一种具有氨基酸序列SEQ ID NO2的分离的脂肪酶，其编码序列，含有其的载体、细胞、和组合物，其制备方法，以及其用于催化酯合成、手性拆分或将植物油转化为生物柴油的用途。发明名称为热稳定脂肪酶,其编码基因的表达及其用途。
文档编号C12N1/21GK102102094SQ200910201210
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者叶秀云, 张洋, 罗鋆琳, 陈萍, 靳伟刚 申请人:福建福大百特科技发展有限公司