专利名称：一种快速评判微藻细胞生长活力的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速评判微藻细胞生长活力的方法。即通过检测微藻细胞总ATP 酶活力的大小来评判微藻细胞的生长活力。本发明是一种快速，准确的藻细胞生长活力的 评价方法，可适用于所有单细胞藻类细胞生长活力的评判。
背景技术：
微藻是一类单细胞或单细胞集群的生物，在自然界分布广泛、环境适应力强、光合 作用效率高、生长周期短、生物产量高。目前对微藻的开发利用涉及饲料、水产、食品、药品、 保健品、污水处理和环境保护及生物能源开发等多个领域，具有广阔的开发应用前景。微藻 作为水产动物鱼、虾、贝类育苗的生物饵料时，是影响幼苗成活率和质量的关键因素之一。 在微藻培养过程中，微藻细胞的生长活性如何直接关系到培养措施的调整及微藻培养的成 败，而所培养的微藻能否按生产计划持续、稳定地供给又直接关系到水产动物苗种培育的 成败。因此，研究快捷、简便的藻细胞生长活力检测方法是十分必要的。在藻细胞培养过程中，通常采用培养一段时间前后藻细胞密度的变化来判定藻细 胞的生长活力。这种方法一般需要培养M小时以上才能得出结果，耗时较长，不能即时反 应特定时刻藻细胞的生长活力。通过测定藻液中溶解氧的变化，也可以间接地判断微藻细 胞的生长活性，但这种方法只适用于微藻的静止培养，无法应用于充气培养，而微藻的生产 性培养多为充气培养。在动物细胞活力鉴定方面，传统的方法是使用台盼蓝染色法。但藻类细胞因其具 有色素体，特别是蓝绿藻，干扰染色效果的判别，影响鉴定的准确性，不适用于微藻细胞活 力的快速判别。荧光染色法(FDA)也被用于检测动物细胞的活性，但FDA法实际是对细胞 膜完整性和细胞内酶活性的检测，细胞膜完整性通常与细胞活性相关。而微藻细胞通常具 有细胞壁，即使胞内酶失去活力，藻细胞膜还有可能保持完好，此时的藻细胞可能不被FDA 染色，表现为不发荧光。因此荧光染色法(FDA)检测微藻细胞的活性也有局限性。三磷酸腺苷(ATP)是体内最重要的能量来源，在维持生物体的正常机能上有着无 可替代的作用。ATP作为代谢作用的能量载体，存在于所有的动物、植物和微生物的活体细 胞中。它与活体微生物量之间的相关性，使其成为较好的活体微生物的检测指标。
发明内容
本发明提供一种有效、即时、简便的评判微藻细胞生长活力的方法。使用本方法可 快速判断微藻细胞的生长活力。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是用离心收集藻细胞，用超声波细胞 粉碎机破碎藻细胞，用ATP酶测定试剂盒测定藻细胞总ATP酶活力，根据藻细胞酶活力的高 低判别细胞生长活力。所述的快速评判微藻细胞生长活力的方法，其检测步骤为1)将待检测藻液装入 5ml离心管中，4C离心，弃上清液，留沉淀的藻细胞，加适量生理盐水制备成IO6个细胞/ml的藻细胞悬液，并准确计数细胞浓度；2)采用超声波细胞粉碎机在冰水浴中对藻细胞进行完全破碎处理；3)取细胞破碎液lOOul，用总ATP酶测定试剂盒测藻细胞总ATP酶活力大 小；总ATP酶的定义为规定每小时IO6个藻细胞中ATP酶分解ATP产生Iumol无机磷的量 为一个ATP酶活力单位。所述的快速评判微藻细胞生长活力的方法，其藻液离心的速率和时间随微藻 种类不同而不同，如离心扁藻(Platymonas spp.)细胞采用5000r/min，3min ；等边金藻 (Isochrysis spp.)8000r/min,5min。所述的快速评判微藻细胞生长活力的方法，其超声破碎是在冰水浴中进行。所述的快速评判微藻细胞生长活力的方法，其藻细胞完全破碎时的超声波工作参 数随微藻种类不同而不同，如扁藻细胞破碎时超声波输出效率为400W，超声时间3S，间隔 时间3S，全程时间5min，等边金藻细胞破碎时超声波输出效率为400W，超声时间3S，间隔时 间3S，全程时间8min。本发明与现有技术相比，其优点为方法简单易操作，省时，具有较强的实际应用 性。
具体实施方案以亚心形扁藻为例，在批次培养模式下，在不同生长阶段分别取5ml藻液，5000r/ min的转速下4°C离心3min，弃上清，留下藻细胞沉淀，加适量的生理盐水制成IO6个ml—1细 胞悬液。在冰水浴条件下用超声波细胞粉碎机破碎藻细胞，其超声波细胞粉碎机的输出效 率为400W，超声时间3S，间隔时间3S，全程时间5min。显微镜下检查发现，扁藻细胞破碎率 在99%以上。用ATP酶测定试剂盒测得不同生长阶段藻细胞总ATP酶活力。实施效果结果表明，不同生长阶段的扁藻细胞总ATP酶活性有显著差异。处于延缓期的藻 细胞相对生长常数K为0. 066，总ATP酶活力0. 131U/百万细胞；处于指数生长期前期的藻 细胞相对生长常数K为0. 198，总ATP酶活力最高为0. 327U/百万细胞，后期的藻细胞相对 生长常数K为0. 203，总ATP酶活力为0. 320U/百万细胞；相对生长下降期藻细胞相对生 长常数K为0. 178，总ATP酶活力为0. 208U/百万细胞；静止期藻细胞相对生长常数K为 0. 146，总ATP酶活力为0. 169U/百万细胞。细胞相对生长常数与总ATP酶活力具有显著的 相关性(P < 0.05)，相关系数r = 0.977。因此，本方法可作为一种即时、准确判断扁藻细 胞生长活力的有效方法。
权利要求
1.一种通过测定细胞总ATP (T-ATP)酶活性来快速评价微藻细胞生长活力的方法，其 操作步骤为1)将待检测藻液装入5ml离心管中，4°C离心，弃上清液，留沉淀的藻细胞，加 适量生理盐水制备成IO6个细胞/ml的藻细胞悬液，并准确计数细胞浓度；幻采用超声波细 胞粉碎机在冰水浴中对藻细胞进行完全破碎处理；幻取细胞破碎液lOOul，用总ATP酶测定 试剂盒测藻细胞总ATP酶活力大小；总ATP酶的定义为规定每小时IO6个藻细胞中ATP酶 分解ATP产生Iumol无机磷的量为一个ATP酶活力单位。
2.如权利要求1所述的一种通过测定细胞总ATP(T-ATP)酶活性来快速评价微藻 细胞生长活力的方法，其藻液离心的速率和时间随微藻种类不同而不同，如离心扁藻 (Platymonas spp.)细胞采用 5000r/min，3min ；等边金藻(Isochrysis spp.) 8000r/min, 5min。
3.如权利要求1所述的一种通过测定细胞总ATP(T-ATP)酶活性来快速评价微藻细胞 生长活力的方法，其超声破碎是在冰水浴中进行。
4.如权利要求1所述的一种通过测定细胞总ATP(T-ATP)酶活性来快速评价微藻细胞 生长活力的方法，其藻细胞完全破碎时的超声波工作参数随微藻种类不同而不同，如扁藻 细胞破碎时超声波输出效率为400W，超声时间3S，间隔时间3S，全程时间5min，等边金藻细 胞破碎时超声波输出效率为400W，超声时间3S，间隔时间3S，全程时间8min。
全文摘要
本发明公布了一种通过测定细胞总ATP(T-ATP)酶活性来快速评价微藻细胞生长活力的方法。其特征是取待评价生长活力的微藻藻液，4℃离心，弃上清后取藻细胞，加生理盐水制成106细胞/ml的藻细胞悬液并准确计数细胞浓度，用超声波细胞破碎机在冰水浴条件下将藻细胞破碎，测定每100万藻细胞的总ATP酶活性。采用本发明所评价的藻细胞活力结果(UT-ATP/100万细胞)与藻细胞生长能力(生长常数K)存在极显著的线性回归关系。处于指数生长期的藻细胞活力(UT-ATP/100万细胞)最大，处于延缓期的藻细胞活力(UT-ATP/100万细胞)稍低，死亡期的细胞活力(UT-ATP/100万细胞)最小。本发明操作方便，简单快捷，可即时评价藻细胞生长活力。
文档编号C12Q1/42GK102041294SQ20091020171
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月23日 优先权日2009年10月23日
发明者黄征征, 黄旭雄 申请人:上海海洋大学