专利名称：应用毕赤酵母的pGAP调控表达异淀粉酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种应用毕赤酵母的pGAP启动子调控生产生物 蛋白的方法，具体是一种应用毕赤酵母的PGAP调控表达异淀粉酶的方法。
背景技术：
异淀粉酶((Isoamylase EC 3. 2. 1. 68)，亦称a _1， 6_葡萄糖苷酶，支链淀粉酶。 异淀粉酶广泛存在于微生物界，现已知产异淀粉酶的微生物有细菌和真菌两大类。异淀粉 酶能够水解支链淀粉分支点的a-l，6-葡萄糖苷键，催化支链淀粉、糖原及某些分支糊精 中的a-l，6糖苷键的断裂反应。由于在淀粉质原料中含有75_80%的支链淀粉，一般的 a -淀粉酶、13 -淀粉酶等只能够水解直链淀粉中的a -1，4_糖苷键，因此，异淀粉酶在提高 淀粉原料利用率及产品质量等方面有实用价值。目前工业生产上是以天然的含异淀粉酶菌 株进行发酵生产异淀粉酶。但是，由于天然的产异淀粉酶菌株的生长缓慢，生产周期长，而 且培养基的营养成分要求较高，导致生产成本较高，不利于异淀粉酶的大规模生产和普及 利用。 毕赤酵母(Pichia pastoris)是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不 高，适合于高密度发酵的大规模生产方式，由于Pichi即astoris分泌自身的蛋白很少，有 利于表达产物的纯化。pGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是Pichia pastoris的组成型 强启动子，与Pichia pastoris的pA0Xl (醇氧化酶1启动子)相比其优越性主要是不需要 有毒性的甲醇作为碳源。
发明内容
本发明的目的是为解决应用天然的产异淀粉酶菌株的生长缓慢，营养要求较高， 使异淀粉酶生产成本较高的问题，而提供一种应用毕赤酵母的pGAP (三磷酸甘油醛脱氢酶 启动子)调控表达异淀粉酶的方法。
本发明所采用的技术方案是 —种应用毕赤酵母的pGAP调控表达异淀粉酶的方法，其步骤是
1、首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子； 2、在异淀粉酶序列的3'末端融合His6标签，构建由pGAP调控异淀粉酶基因的毕
赤酵母表达载体，并将这一载体转化毕赤酵母基因组； 3、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株； 4、将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于28 3(TC在生物反应器中发酵
工程菌1 2d分泌表达异淀粉酶。所述液体培养基是由以下组分组成85%磷酸25
28ml/L，CaS04 *2H20 0. 8 1. 2g/L，K2S0417 19g/L， MgS04 7H20 13 16g/L，K0H 3. 5
4. 5g/L，碳源15 45g/L，蛋白胨18 22g/L，Yeast extract 8 12g/L，PTM4 3 5ml/L。
所述PTM4是由以下组分组成:CuS04 5H20 2. 0g/L， Nal 2H20 0. lg/L， MnS04 H20 3. 0g/L，
Na2Mo04 2H20 0. 2g/L， H3B030. 02g/L， CoCl2 6H20 1. 05g/L， ZnCl27. 0g/L， Fe2(S04)3 7H2022g/L，生物素0. 2g/L，硫酸lml/L 所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。 本发明采用了毕赤酵母的pGAP调控表达的异淀粉酶，具有下列优点 1、生产成本低，只需使用普通的无机盐、碳源和氮源作为发酵培养基。 2、可在生物反应器中发酵毕赤酵母，其细胞能生长至细胞密度达200A以上，能以
足够多的细胞数量表达异淀粉酶，有利于异淀粉酶的大规模生产。 3、发酵周期短，整个发酵周期只需1 2d。 4、使用无毒性的碳源，不需要使用有毒性的甲醇作为碳源，无毒副作用。 5、由于pGAP是毕赤酵母的强启动子，由pGAP调控表达的异淀粉酶约占总分泌蛋
白的比例较高，并且由于在异淀粉酶的C端融合了His6标签，有利于产物的纯化。
具体实施例方式
下面采用非限定性实施例对本发明作进一步说明。
实施例一 1、首先从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子； 2、在异淀粉酶基因序列的3'末端融合His6标签，构建由pGAP调控异淀粉酶基因
的Pichia pastoris表达载体，并将这一载体转化为Pichia pastoris基因组； 3、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株； 4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升)85%磷酸
25. Oml， CaS04 2H20 0. 93g， K2S0417. 5g， MgS04 7H20 13. 9g， KOH 4. 13g，甘油40g，蛋白 胨19g， Yeast extract 9g， PTM4微量元素4mlPTM4配方(每升)CuS04 5H20 2. Og， Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. Og， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl27. Og， Fe2(S04)3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸1ml，在生物反应器中进行发酵表达异 淀粉酶。其发酵参数为温度28t:，pH5.0，搅拌转速300r/min。发酵2d后离心收获上清进 行纯化异淀粉酶。通过蛋白电泳和酶活性测定对表达的异淀粉酶进行鉴定(蛋白电泳证明 发酵表达的目标蛋白符合异淀粉酶蛋白分子量，并且异淀粉酶活性> ly/yg目标蛋白) 而证明本实施所获得的产品是异淀粉酶。 实施例二 1、首先从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子； 2、在异淀粉酶基因序列的3'末端融合His6标签，构建由pGAP调控异淀粉酶基因
的Pichia pastoris表达载体，并将这一载体转化Pichia pastoris基因组； 3、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株； 4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升)85%磷酸
26. 7ml， CaS04 2H20 0. 93g， K2S0418. 5g， MgS04 7H20 14. 9g， KOH 4. 13g，油酸20g，蛋白 胨20g， Yeast extract 10g， PTM4微量元素4mlPTM4配方(每升)CuS04 5H20 2. Og， Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. Og， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl27. Og， Fe2(S04)3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸1ml，在生物反应器中进行发酵表达异 淀粉酶。其发酵参数为温度28t:，pH5.0，搅拌转速500r/min。发酵ld后离心收获上清进 行纯化异淀粉酶。通过蛋白电泳和酶活性测定对表达的异淀粉酶进行鉴定(蛋白电泳证明发酵表达的目标蛋白符合异淀粉酶蛋白分子量，并且异淀粉酶活性> lp/yg目标蛋白) 而证明本实施所获得的产品是异淀粉酶。
实施例三 1、首先从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子； 2、在异淀粉酶基因序列的3'末端融合His6标签，构建由pGAP调控异淀粉酶基因 的Pichia pastoris表达载体，并将这一载体转化Pichia pastoris基因组；
3、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；
4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升)85%磷酸 27. 7ml， CaS04 2H20 1. 03g， K2S0418. 2g， MgS04 7H20 14. 5g， K0H 3. 83g，山梨醇35g，蛋白 胨21g， Yeast extract 12g， PTM4微量元素3mlPTM4配方(每升)CuS04 5H20 2. 0g， Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. 0g， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl27. 0g， Fe2(S04)3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸1ml，在生物反应器中进行发酵表达异 淀粉酶。其发酵参数为温度3(TC，pH5.0，搅拌转速600r/min。发酵2d后离心收获上清进 行纯化异淀粉酶。通过蛋白电泳和酶活性测定对表达的异淀粉酶进行鉴定(蛋白电泳证明 发酵表达的目标蛋白符合异淀粉酶蛋白分子量，并且异淀粉酶活性> ly/yg目标蛋白) 而证明本实施所获得的产品是异淀粉酶。
实施例四 1、首先从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子； 2、在异淀粉酶基因序列的3'末端融合His6标签，构建由pGAP调控异淀粉酶基因 的Pichia pastoris表达载体，并将这一载体转化Pichia pastoris基因组；
3、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；
4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升)85%磷酸 27. 5ml， CaS04 2H20 1. 13g， K2S0418. 5g， MgS04 7H20 15. 5g， K0H 4. 23g，葡萄糖40g，蛋白 胨20g， Yeast extract llg， PTM4微量元素3mlPTM4配方(每升)CuS04 5H20 2. Og， Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. Og， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl27. 0g， Fe2(S04)3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸1ml，在生物反应器中进行发酵表达异 淀粉酶。其发酵参数为温度3(TC，pH5.0，搅拌转速800r/min。发酵ld后离心收获上清进 行纯化异淀粉酶。通过蛋白电泳和酶活性测定对表达的异淀粉酶进行鉴定(蛋白电泳证明 发酵表达的目标蛋白符合异淀粉酶蛋白分子量，并且异淀粉酶活性> ly/yg目标蛋白) 而证明本实施所获得的产品是异淀粉酶。
实施例五 1、首先从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子； 2、在异淀粉酶基因序列的3'末端融合His6标签，构建由pGAP调控异淀粉酶基因
的Pichia pastoris表达载体，并将这一载体转化Pichia pastoris基因组； 3、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株； 4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升)85%磷酸
26. 7ml， CaS04 2H20 0. 93g， K2S0418. 2g， MgS04 7H20 14. 9g， KOH 4. 13g，乳酸30g，蛋白
胨20g， Yeast extract 10g， PTM4微量元素4ml(PTM4配方(每升)CuS04 5H20 2. Og，
Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. Og， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g，ZnCl27. 0g， Fe2(S04)3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸1ml)，在生物反应器中进行发酵表达异 淀粉酶。其发酵参数为温度28 30°C ， pH5. 0，搅拌转速200-900r/min。发酵1 2d后 离心收获上清进行纯化异淀粉酶。通过蛋白电泳和酶活性测定对表达的异淀粉酶进行鉴定 (蛋白电泳证明发酵表达的目标蛋白符合异淀粉酶蛋白分子量，并且异淀粉酶活性> 1 P / P g目标蛋白)而证明本实施所获得的产品是异淀粉酶。
权利要求
一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达异淀粉酶的方法，其特征在于，其步骤如下1)、首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；2)、在异淀粉酶序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控异淀粉酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转化毕赤酵母基因组；3)、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；4)、将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于28～30℃在生物反应器中发酵工程菌1～2d分泌表达异淀粉酶；所述液体培养基是由以下组分组成85％磷酸25～28ml/L，CaSO4·2H2O 0.8～1.2g/L，K2SO417～19g/L，MgSO4·7H2O 13～16g/L，KOH 3.5～4.5g/L，碳源15～45g/L，蛋白胨18～22g/L，Yeast extract 8～12g/L，PTM43～5ml/L；所述PTM4是由以下组分组成CuSO4·5H2O 2.0g/L，NaI·2H2O 0.1g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO30.02g/L，CoCl2·6H2O 1.05g/L，ZnCl27.0g/L，Fe2(SO4)3·7H2O 22g/L，生物素0.2g/L，硫酸1ml/L。
2. 根据权利要求1所述的应用毕赤酵母的pGAP调控表达异淀粉酶的方法，其特征在 于所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。
全文摘要
本发明属生物技术领域，是一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达异淀粉酶的方法，首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；构建由pGAP调控异淀粉酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转化毕赤酵母基因组；根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中发酵工程菌分泌表达异淀粉酶。本发明生产成本低，发酵周期短，利用毕赤酵母的pGAP调控表达的异淀粉酶有利于产物的纯化，解决应用天然产异淀粉酶的菌株生产异淀粉酶的成本较高、产物难于纯化等的问题，有利于异淀粉酶的大规模生产。
文档编号C12R1/84GK101696403SQ200910209239
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月25日 优先权日2009年10月25日
发明者刘振旺, 尹慧祥, 张添元, 张爱联, 易国辉, 罗进贤 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所;