专利名称：：重组副溶血弧菌外膜蛋白及制备方法
技术领域：
：本发明属于生物基因工程
技术领域：
，尤其涉及一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业化生产的重组副溶血弧菌外膜蛋白及制备方法。
背景技术：
：副溶血性弧菌是一种常见的革兰氏阴性细菌，广泛分布于海洋环境中。它是海水鱼类养殖业中常见的一种条件致病菌，在某些特定条件如水质恶化或异常环境等情况下，能引起养殖鱼类患病，给水产业造成了巨大的经济损失。弧菌的外膜在对宿主的感染和致病过程中发挥很重要的作用，作为外源物质，它们易被宿主免疫系统所识别。其中外膜蛋白是菌体外膜的主要成分之一，因外膜蛋白直接面对宿主的体液及组织，细菌利用外膜蛋白进行粘附、侵入和炎症等生理活动，更容易被宿主识别作为攻击目标，因此弧菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性。不仅可以剌激体液免疫，而且对细胞免疫亦有剌激作用。在外膜蛋白中，0mpW属于小的细菌外膜孔蛋白0mpW家族，由8股P片层结构形成一个狭长的疏水通道，与转运小的疏水分子通过细菌外膜有关。研究表明，OmpW与环境盐度(Nacl)和细菌渗透压调节密切相关，而盐度、温度和溶氧等环境因子对病原菌在宿主体内的生长和毒力的产生有显著影响，因此，研究副溶血弧菌外膜蛋白，可有效地控制养殖条件，抑制弧菌病的流行。然而，从弧菌中直接提取该蛋白的操作复杂、成本高、产量少，不能大规模产业化生产且所得蛋白容易降解，因此人们致力于重组制备副溶血弧菌外膜蛋白。现有技术已有关于对弧菌外膜蛋白OmpW表达的报道(RonghuaQian，ZhaohuaXiao，ChongwenZhangetal.ExpressionandpurificationoftwomajoroutermembraneproteinsfromVibrioalginolyticus.WorldJMicrobiolBiotechnol.2008，24:245-251)，是通过将溶藻弧菌外膜蛋白ompW基因与pET_30a(+)表达载体重组获得表达质粒来表达0mpW蛋白的，但是，此方法在表达过程中产生了包涵体，所以在纯化前要对样品进行变性和复性，不仅操作复杂，增加制备成本，也容易使蛋白结构遭到破坏。
发明内容本发明是为了克服现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于产业化生产的重组副溶血弧菌外膜蛋白及制备方法。本发明的技术解决方案是一种重组副溶血弧菌外膜蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:4。—种上述重组副溶血弧菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于按如下步骤进行a.培养副溶血弧菌菌种并提取DNA;b.设计副溶血弧菌外膜蛋白编码序列的引物对，以上述提取的副溶血弧菌DNA为模板进行PCR扩增；c.PCR电泳回收产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞DH5a，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养通过蓝白斑法筛选阳性克隆，选择579bp大小的条带进行回收；d.用限制性内切酶BamHI和XhoI分别双酶切c步骤回收产物和表达载体pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞DH5a进行培养并筛选提取重组表达质粒；e.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)内，培养菌株得菌液，用IPTG诱导菌液，收集菌种；f.将所收集的菌种进行扩大培养，收集菌体；g.将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。所述引物对的核苷酸序列为上游引物PaF:5'-CGCGGATCCCATAAACAAGGTGACTTCGTT-3';下游引物PaR:5'-CGCTCGAGGAACTTGTAACCGCCGCT-3'。所述PCR反应条件为94t:预变性5分钟后进行94t:变性30秒、58。C复性30秒、72t:延伸30秒的30个循环的扩增，72t:延伸7分钟后保存于4°C。所述e步骤是将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)后，挑取单菌落接种于5mlAmpLB液体培养基过夜培养，再取50yl过夜培养的菌液接种5mlAmpLB液体培养基，37°C、200转/分摇菌2.5小时，至菌液的0D600为0.4，向菌液中加诱导剂IPTG至终浓度为lmM，37。C摇菌4小时后，回收菌体。所述g步骤是用PBS重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并用孔径为0.22iim的过滤器过滤细菌裂解液，在4mlBindbuffer中加lml50^的Ni-NTAHisBind树脂悬液，轻轻混匀，静置，待树脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml细菌裂解液，轻轻混匀后用振荡器4°C，200rpm振荡12h形成混合液；将混合液移入纯化柱，用0.5mlElutebuffer洗脱，收集洗脱液。本发明根据GenBank中副溶血弧菌外膜蛋白的DNA序列，设计针对外膜蛋白编码序列的引物对，以CTAB法提取的副溶血弧菌DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物与pMD19T载体连接得重组质粒，经双酶切后再与表达载体pET-32a(+)连接，获重组表达质粒并转化至大肠杆菌BL21中；通过IPTG诱导实现了重组蛋白的可溶性表达。因在表达过程中不产生包涵体，该表达质粒表达的融合蛋白带有组氨酸标签，方便了样品的鉴定和纯化，避免了样品的变性和复性，不但操作简单，降低了制作成本，更主要的是蛋白结构不受破坏；重组蛋白纯度好、得率高且不易降解，适应于工业化生产，为进一步研究副溶血弧菌外膜蛋白的功能奠定基础。图1本发明实施例副溶血弧菌外膜蛋白基因片断的琼脂糖凝胶电泳分析图。图2本发明实施例重组表达质粒的双酶切电泳鉴定图。图3本发明实施例纯化柱洗脱组分的SDS-PAGE分析图。图4本发明实施例重组表达质粒表达产物的SDS-PAGE分析图。图5本发明实施例重组表达质粒诱导表达的蛋白印迹分析图。具体实施例方式实施例a.将副溶血弧菌菌种ATCC17802接种于2216E琼脂平板上，28。C过夜培养，从所述接种于2216E琼脂平板上的副溶血弧菌菌体中以CTAB法提取DNA。b.根据已发表的GenBank中副溶血弧菌的外膜蛋白基因保守序列设计针对外膜蛋白编码序列的引物对，以上述提取的副溶血弧菌DNA为模板进行PCR扩增，引物对的核苷酸序列为上游引物PaF:5'-CGCGGATCCCATAAACAAGGTGACTTCGTT-3';下游引物PaR:5'-CGCTCGAGGAACTTGTAACCGCCGCT-3'。PCR反应条件为94t:预变性5分钟后进行94t:变性30秒、58。C复性30秒、72。C延伸30秒的30个循环的扩增，72t:延伸7分钟后保存于4°C。引物对由上海生物工程有限公司合成，划线部分分别为BamHI酶切位点和Xhol酶切位点。以副溶血弧菌基因组DNA为模板，用PCR技术获得目的基因。目的基因片断的琼脂糖凝胶电泳分析图如图l所示，图中1:外膜蛋白基因的PCR产物；2:阴性对照；3:MakerDL2000。c.PCR电泳回收产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞DH5a，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养通过蓝白斑法筛选阳性克隆，用酶切方法对阳性克隆进行分析以鉴定重组质粒并选择579bp大小的条带进行回收。d.用限制性内切酶BamHI和XhoI分别双酶切c步骤回收产物和表达载体pET-32a(+)，37t:作用2小时后，酶切产物用DNAFragmentPurificationKit(Takara公司)回收，PCR酶切产物和载体酶切产物按5:1混合，T4DNA连接酶(Takara公司)16°C过夜连接，37t:过夜培养，提取重组表达质粒pET-ompW;用BamHI和XhoI对重组表达质粒双酶切鉴定，鉴定结果如图2所示图中1:MakerDL2000;2:pET-ompW质粒；3:pET-ompW经BamHI和XhoI双酶切产物。测序结果表明，所测序列与其他弧菌外膜蛋白OmpW编码序列同源性极高，故初步确认所提取的重组表达质粒为副溶血弧菌外膜蛋白OmpW的编码序列。e.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)内，培养菌株得菌液，挑取单菌落接种5mlAmpLB液体培养基过夜培养，取50yl过夜培养的菌液接种5mlAmpLB液体培养基，37°C200转/分摇菌2.5小时，至0D600为0.4，所摇菌液加诱导剂IPTG至终浓度为lmM，37t:摇菌4小时后，回收菌体，即得到菌种。f.将所收集的菌种进行扩大培养，收集菌体；g.用BllgBuste纖Ni-NTAHisBindPurificationkit(Novagen公司)纯化融合蛋白，具体操作步骤是用PBS重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并用孔径为0.22iim的过滤器过滤细菌裂解液，除去其中的大颗粒。在4mlBindbuffer中加1ml50%的Ni-NTAHisBind树脂悬液，轻轻混匀，静置，待树脂沉淀后用移液枪吸去上清液取沉淀；在沉淀中加4ml细菌裂解液，轻轻混匀后用振荡器4°C，200rpm振荡12h形成混合液；将混合液移入纯化柱，打开底部的盖子，收集液体；用4mlWashbuffer洗涤，收集洗涤液；用0.5mlElutebuffer洗脱，收集洗脱液。SDS-PAGE分析各收集液，其结果如图3所示图中1:洗涤部分；2:蛋白Marker;3:纯化蛋白部分；洗脱液部分即为纯化的蛋白液。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。重组副溶血弧菌外膜蛋白(0mpW)的鉴定l.SDS-PAGE电泳配制12%的分离胶和5%的浓縮胶。将诱导前的样品和诱导后的样品各取20分别加入20ill2XSDSloadingbuffer混匀，沸水煮5分钟，12000转/分离心10分钟，留取上清做SDS-PAGE。120V恒压电泳2h、考马斯亮蓝R250染色2小时、脱色液脱色。观察，在43.3kDa处有明显条带出现，如图4所示，图中1:pET32a(+)诱导前产物；2:pET32a(+)诱导后表达蛋白；3:蛋白Marker;4:pET-ompW诱导前产物；5:pET-ompW诱导后表达蛋白。2.WesternBlot鉴定当SDS-PAGE电泳即将结束时，用蒸馏水洗清石墨板，擦干。从SDS-PAGE胶上切下需要转膜的部分。戴手套操作，切6张滤纸和1张硝酸纤维素膜(NC)。把硝酸纤维素膜浸没于去离子水的水面中，滤纸浸没于转移缓冲液中，平衡5分钟。按纸、膜、胶、纸的顺序从阳极到阴极摆放正确，连接电源，注意正负极。根据凝胶面积按0.65-1.0mA/cm2接通电流，电转移0.5-2h。转移结束后，切断电源，从上至下拆卸装置，逐一拆去各层。在NC上作标记。把凝胶取出进行抗体标记。硝酸纤维素膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和Anti-HisAntibody。(Anti-HisAntibody为1:1000稀释)。37。C摇床中温育lh。取出硝酸纤维素膜，用PBS漂洗3次，每次10分钟。滤膜再用TBST漂洗10分钟。硝酸纤维素膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和l:2000稀释的HRP标记的羊抗鼠酶标二抗。37t:摇床中温育lh。取出NC膜，用PBS漂洗4次。将NC膜放在底物液中直到有条带出现(一般l-5min)，取出NC在水中漂洗一下，放在PBS中。观察结果，在43.3KDa处有一条特异性免疫条带。如图5所示，图中1:蛋白Marker;2:诱导后的pET-ompW;3:诱导前的pET-ompW作为阴性对照。结果和预期的pET-ompW大小一致。序列表〈110〉大连水产学院〈120〉重组副溶血弧菌外膜蛋白及制备方法〈160>4〈170>PatentinVersion3.1〈210>1〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>1cgcggatcccataaacaaggtgacttcgtt〈210>2〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>2cgctcgaggaacttgtaaccgccgct26〈210>3〈211>579〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈223〉副溶血弧菌外膜蛋白OmpW基因〈400>3cate朋c朋ggtgacttcgttcttcgtgttggtgcggcgtctgtcgttccaaatgacagc60agcgateagattcttggttctcaagaagaattga朋gtgg3ttca朋tecgcagcttggt120ttgacgtttggctecatgttcacagacaacatcagcctegagcttctegcagcaacacca180ttcagccatgatetttcaacagacttgtteggtcttggtgatetcgcggac3cc朋3C3c240cttccaccaacgcttetggttcagtectectttggcgagccacaaagteagttccgtcca300tecgttggtgcaggtctcaactecaccatcttttttgatg朋ggcttteac朋ca朋gcg360a朋朋cgtgggctteactgatctteagctegacgattcatttggtttegc3gca朋cgte420ggcgtggact3C3tg3tC皿cgatc皿tggttcctteacgcatctgcgtggtetgcaaac■3ttg朋3C3g皿gc皿catera皿tttggtggagcg朋gc朋朋朋ccgacgtc朋朋tt540aacccttgggtetttetgatcagcggcggttecaagttc579〈210>4〈211>193〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈223〉副溶血弧菌外膜蛋白OmpW〈400>4HisLysGinGlyAspPheValLeuArgValGlyAlaAlaSerVal151015ValProAsnAspSerSerAspLyslieLeuGlySerGinGluGlu202530<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求一种重组副溶血弧菌外膜蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO4。2.—种如权利要求1所述重组副溶血弧菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于按如下步骤进行a.培养副溶血弧菌菌种并提取DNA;b.设计副溶血弧菌外膜蛋白编码序列的引物对，以上述提取的副溶血弧菌DNA为模板进行PCR扩增；c.PCR电泳回收产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞DH5a，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，通过蓝白斑法筛选阳性克隆，选择579bp大小的条带进行回收；d.用限制性内切酶BamHI和XhoI分别双酶切c步骤回收产物和表达载体pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞DH5a进行培养并筛选提取重组表达质粒；e.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)内，培养菌株得菌液，用IPTG诱导菌液，收集菌种；f.将所收集的菌种进行扩大培养，收集菌体；g.将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。3.根据权利要求2所述的重组副溶血弧菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于所述引物对的核苷酸序列为上游引物PaF:5'-CGCGGATCCCATAAACAAGGTGACTTCGTT-3';下游引物PaR:5'-CGCTCGAGGAACTTGTAACCGCCGCT-3'。所述PCR反应条件为94t:预变性5分钟后进行94t:变性30秒、58"C复性30秒、72"C延伸30秒的30个循环的扩增，72t:延伸7分钟后保存于4°C。4.根据权利要求3所述的重组副溶血弧菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于所述e步骤是将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)后，挑取单菌落接种于5mlAmpLB液体培养基过夜培养，再取50yl过夜培养的菌液接种5mlAmpLB液体培养基，37°C、200转/分摇菌2.5小时，至菌液的0D600为0.4，向菌液中加诱导剂IPTG至终浓度为lmM，37t:摇菌4小时后，回收菌体。5.根据权利要求4所述的重组副溶血弧菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于所述g步骤是用PBS重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并用孔径为0.22iim的过滤器过滤细菌裂解液，在4mlBindbuffer中加lml50X的Ni-NTAHisBind树脂悬液，轻轻混匀，静置，待树脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml细菌裂解液，轻轻混匀后用振荡器4°C，200rpm振荡12h形成混合液；将混合液移入纯化柱，用0.5mlElutebuffer洗脱，收集洗脱液。全文摘要本发明公开一种重组副溶血弧菌外膜蛋白及制备方法，根据副溶血弧菌外膜蛋白的DNA序列，设计引物对并以CTAB法提取的副溶血弧菌DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物与pMD19T载体连接得重组质粒，经双酶切后再与表达载体pET-32a(+)连接，获重组表达质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中；通过IPTG诱导实现了重组蛋白的可溶性表达。因在表达过程中不产生包涵体，该表达质粒表达的融合蛋白带有组氨酸标签，方便了样品的鉴定和纯化，避免了样品的变性和复性，不但操作简单，降低了制作成本，更主要的是蛋白结构不受破坏；重组蛋白纯度好、得率高且不易降解，适应于工业化生产，为进一步研究副溶血弧菌外膜蛋白的功能奠定基础。文档编号C12N15/70GK101698674SQ20091021966公开日2010年4月28日申请日期2009年11月5日优先权日2009年11月5日发明者仇雪梅,刘洋,王秀利,袁野申请人:大连水产学院