专利名称：：基因工程大肠埃希氏菌及利用其产生的β-糖苷酶制备含低聚糖的低乳糖乳的方法
技术领域：
：本发明涉及一种菌种，同时涉及一种利用该菌种制备13-糖苷酶Tt13GLY的方法，以及利用P_糖苷酶Tt13GLY制备一种含低聚糖的低乳糖乳的制备方法。
背景技术：
：乳及乳制品中含有优质的蛋白质、易消化吸收的脂肪、丰富的矿物质和多种维生素，还含有多种免疫物质、酶、激素等具有生理活性调节功能的生物活性物质。总乳固体平均质量分数为13.0%，其中脂肪4.0%、蛋白质3.4%、乳糖4.8%、无机盐0.8%、CaO.11%，其钙含量高且钙磷比例适当，易被人体消化吸收，所以牛乳及乳制品是人类改善营养、增强体质不可缺少的理想食品。世界卫生组织把按人口平均的乳制品消费列为衡量一个国家人民生活水平的主要指标之一。许多国家都把增强国民牛乳的摄入量作为改善国民营养、增强国民体质的措施。目前世界人均牛乳年消费量为94kg，亚洲人均40kg，而我国仅为7kg，相差甚远，除了经济发展水平以外，还有一个原因就是在中国人群中有很大一部分人患有乳糖不耐受症。乳糖是奶类中特有的糖类，也是重要的营养成分之一。它是由半乳糖和葡萄糖通过|3_1，4糖苷键构成的双糖，在牛奶中的含量为4.8%左右，占总糖含量的99.8%。乳糖的营养功能是提供热能和促进金属离子的吸收。正常情况下，乳糖可在人体小肠上皮细胞的乳糖酶作用下，水解成葡萄糖和半乳糖后被吸收而进入血液。婴儿在出生时体内含有许多乳糖酶，乳糖对初生婴儿起到供应大部分热量的作用。一年以后，多数人的乳糖酶活性会迅速下降，儿童和成年人因体内缺乏乳糖酶，饮用牛乳后常会引起对乳糖的消化吸收不良。若乳糖酶缺乏者一次摄入较多乳糖，乳糖不能及时被消化吸收，乳糖就进入结肠后被肠道细菌分解，产生大量乳酸、甲酸等短链脂肪酸和氢气，造成渗透压升高，使肠腔中的水分增多，引起腹胀、肠鸣、肠绞痛直至发生腹泻等症状，我们称之为乳糖不耐症。牛奶中60%的热量是由乳糖提供的，对于乳糖不耐症患者，无法充分利用这些能量。一旦身体的能量需要不能完全得到满足，蛋白质就不能作为构成人体蛋白的氮源，而被用于满足能量需要，所以乳糖在营养方面起到节约蛋白的作用。不能吸收的乳糖，则会被肠道微生物作为一种碳水化合物的来源，发酵产酸产气，导致胃肠失调，并造成有价值的蛋白质和矿物质的损失。由于乳糖吸收不良，还会影响到对牛奶中钙的吸收。因为乳糖区别于其它糖，它是矿物质的载体，可促进矿物质的吸收。因此，假如乳糖不被吸收，将导致乳糖被排放到大肠无法利用，那么有乳糖吸收障碍的人将会发生矿物质和钙质丢失的症状，这与小儿佝楼病和成年人的骨质疏松症都有关系。另外，对无症状的乳糖吸收不良者来说，虽然不会刻意避免饮用牛奶，但由于本身乳糖酶缺乏也会使牛奶中的营养物质得不到充分的吸收。因而生产提供低乳糖乳制品是解决乳糖不耐症问题的最佳途径。低乳糖乳的生产国外早已商业化，国内刚起步。从理论上讲，低乳糖乳可以有三种生产方法即物理去除法、化学酸水解法和酶水解法。采用物理法如用超滤技术虽可将大部分乳糖去除，但同时维生素和矿物质也将和乳糖一起损失掉，不得不在去除乳糖后再将它们添加进去，这也造成了乳糖的极大浪费。化学法即利用酸对乳糖进行水解，但水解条件剧烈(pHl2，温度100150°C)，不能直接用于牛乳，而仅限于超滤乳清的水解。酶水解法即利用外源性乳糖酶将乳糖降解为易被人吸收利用的单糖。该法水解条件温和，产物简单，口感好不会破坏牛乳中其他营养成分，是目前在乳品加工中所采用的好方法。利用酶水解法生产低乳糖乳不仅能满足乳糖不耐症患者的需要，并且由于乳糖已经分解成葡萄糖和半乳糖，增加了产品的甜度，使乳糖不耐症患者可以顺利消化吸收的同时增加了产品的营养价值。在功能性乳制品的研究与开发方面，日本、美国、法国、德国、俄罗斯、意大利和芬兰等发达国家投入了大量的人力、物力进行了广泛而深入地研究，许多产品已推向市场。但已生产的功能性乳制品的种类多为具有降血压功效、改善人体免疫功能、改善心血管机能等功效的益生菌。例如，芬兰Valio公司的"Gefilus"品牌的含LGG益生菌，以及"埃优留斯"的蓝莓乳。在我国，功能性乳制品这一领域虽尚属起步阶段，但新的奶制品的开发已成为目前乳品行业的研发重点。利用P-半乳糖苷酶水解牛奶中的乳糖，生产低乳糖牛奶，国内已有报道，曾以申等人从蚕豆中提取的P-半乳糖苷酶加入鲜牛奶中，获得降低50%乳糖含量的乳制品。使用进口来源酵母kluveromyceslactis的P-半乳糖苷酶制剂，水解乳糖生产低乳糖牛奶也有报道。但以上研究均注重降低牛奶中乳糖含量，解决了人们饮用牛奶时的乳糖不耐症问题，而并未在生产低乳糖乳的同时得到功能性低聚半乳糖乳。现有的利用乳糖酶水解乳糖的方法中，在巴氏杀菌(85t:保持15S)后，冷却至37t:，加入乳糖酶，保持2小时后，再进行高温杀菌，得到低乳糖乳成品。采用该方法，首先得到的乳品不含低聚半乳糖，其次，在37t:保持时，牛奶很容易感染细菌而变质。
发明内容为解决现有技术中存在的不足，本发明目的在于提供一种大肠埃希氏菌，同时提供一种应用该菌种制备糖苷酶的方法，以及利用一步酶反应，在降低乳制品中乳糖含量的同时，能够产生低聚半乳糖的含低聚糖的低乳糖乳制品的制备方法。为实现上述发明目的，本发明的基因工程株大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)TTBGLYWTCGMCCNo.3078，于2009年5月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.3078。该菌株具有的特性该菌株大小0.40.7X13um，无芽胞，革兰氏阴性杆菌。合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37t:，在42-44t:条件下仍能生长，生长温度范围为15-46°C。普通营养琼脂上生长菌落形态为光滑型菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5，若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。菌株发酵乳糖产酸产气，并发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、木胶糖、阿拉伯胶等产酸产气。同时，本发明提供了一种13_糖苷酶Tt13GLY的制备方法，该方法是将大肠埃希氏4菌(Escherichiacoli)TTBGLYWTCGMCCNo.3078经发酵、提取制得。该菌经发酵、提取制得P-糖苷酶Ttl3GLY，以乳糖为底物的酶反应研究表明，该酶具有较高的乳糖水解活性，其最适温度为70°C，最适pH为7.0，乳糖水解的Km=1.566mmol/L，Vmax=0.406mM/min，在7(TC有较好的热稳定性。该酶同时具有较强的转糖基活性，在以40%乳糖为底物，加酶量42.5U/mL、反应温度7(TC、反应时间16h的条件下，低聚半乳糖的合成率达到35.3%。水解产物葡萄糖对乳糖水解反应和转糖基反应具有抑制作用，是影响G0S合成的重要因素。此外，本发明还提供了一种含低聚糖的低乳糖乳的制备方法，该方法包括常规的低乳糖乳的制备方法，即将生鲜乳加入酶进行水解，超高温杀菌后，灌装得成品，所述的酶为e-糖苷酶TtPGLY，该酶是由基因工程株大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)TTBGLYWTCGMCCNo.3078经发酵、提取制得。上述技术方案中，酶水解温度为50-85t:，反应时间为0.5-4.5小时。上述的P-糖苷酶Ttl3GLY为游离态酶，其用量为0.4-1.6IU/mL牛奶。上述的P-糖苷酶Ttl3GLY可为固定化酶，其用量为1_3.5IU/mL牛奶。上述技术方案中当反应温度低于5(TC时，P-糖苷酶Tt!3GLY活性较低，反应时间过长；反应温度高于85t:时，由于高温破坏酶的催化活性，不利于反应进行，因此，反应温度确定为50-85°C。且反应温度在50-85t:时，牛奶在反应过程中不易染菌。当反应时间低于0.5小时，反应不完全，乳糖水解率、G0S合成率较低；反应时间在4.5小时以上，乳糖水解基本不变，由于产物抑制及G0S分解，低聚糖含量则出现下降趋势，因此，反应时间确定为0.5-4.5小时。P-糖苷酶Ttl3GLY的用量确定依据为用量太少，则乳糖水解率太低，G0S合成量太低，用量大过上限后，继续加大酶量，效果不明显，且造成了酶的浪费，增加成本。采用本发明的制备方法制成的牛奶，通过采用高效液相色谱(HPLC)对低聚糖进行定量检测，检测器采用紫外检测器(UVD)，色谱柱为AjilentEclipseXDB-C18柱，4.6X250mm，5um，在检测前对糖类物质进行柱前衍生化。衍生化试剂为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)。流动相乙腈:磷酸缓冲液=25:75謂;进样量20ul;流速:0.8ml/min;柱温25"，波长设置为245nm。利用葡萄糖氧化酶法测定牛乳中葡萄糖含量，以确定牛乳中乳糖的水解率。最终结果表明，采用上述技术方案，能够在降低牛奶中乳糖含量的同时，合成大量的低聚半乳糖，其中，乳糖的水解率最高可达95.24%，低聚半乳糖占牛乳中糖分最高可达37.13%。具体实施例方式将大肠i矣希氏菌(Escherichiacoli)TTBGLYWTCGMCCNo.3078取出后，LB固体斜面培养基活化后，从斜面种子取一环菌接种至装有LB种子培养基的三角瓶中培养摇床转速200r/min，温度37t:，培养12H。将种子培养液按一定接种量接种至发酵培养基进行发酵培养转速200r/min，温度37。C，培养24H。将发酵液离心，获得菌体，破壁后离心，取上清液制酶即可得到P-糖苷酶Tt13GLY。在含低聚糖的低乳糖乳的制备方法过程中，结合现有的低乳糖乳的制备方法，在生鲜乳中加入上述制得的P_糖苷酶Tt13GLY进行水解，经过高温杀菌后，得到含低聚半乳糖的低乳糖乳，装罐或装袋后得到成品。现就加入P-糖苷酶的形式、含量及反应温度、时间通过以下实施例进行说明—、e-糖苷酶为游离态酶。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>二、|3-糖苷酶为固定化酶，以下实施例采用大孔树脂通过吸附和交联方法制得的固定化酶，反应为分批反应。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三、|3-糖苷酶为固定化酶，反应为连续反应。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。权利要求一种基因工程大肠埃希氏菌，其特征在于该基因工程大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)TTBGLYWTCGMCCNo.3078。2.—种P-糖苷酶Tt!3GLY的制备方法，其特征在于该方法是将基因工程大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)TTBGLYWTCGMCCNo.3078经发酵、提取制得。3.—种含低聚糖的低乳糖乳的制备方法，包括常规的低乳糖乳的制备方法，即将生鲜乳加入酶进行水解，超高温杀菌后，灌装得成品，其特征在于所述的酶为P-糖苷酶TtPGLY，该酶是由基因工程株大肠i矣希氏菌(Escherichiacoli)TTBGLYWTCGMCCNo.3078经发酵、提取制得。4.根据权利要求3所述的含低聚糖的低乳糖乳的制备方法，其特征在于酶水解温度为50-85"C，反应时间为0.5-4.5小时。5.根据权利要求4所述的含低聚糖的低乳糖乳的制备方法，其特征在于所述的P_糖苷酶Tt13GLY为游离态酶，其用量为0.4-1.6IU/mL牛奶。6.根据权利要求4所述的含低聚糖的低乳糖乳的制备方法，其特征在于所述的P-糖苷酶Ttl3GLY为固定化酶，其用量为1-3.51U/mL牛奶。全文摘要本发明涉及一种菌种，同时涉及一种利用该菌种制备β-糖苷酶TtβGLY的方法，以及利用β-糖苷酶TtβGLY制备一种含低聚糖的低乳糖乳的制备方法。大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)TTBGLYWTCGMCCNo.3078，该制备底乳糖乳的方法方法包括常规的低乳糖乳的制备方法，即将生鲜乳加入酶进行水解，超高温杀菌后，灌装得成品，所述的酶为β-糖苷酶TtβGLY该酶是由基因工程株大肠埃希氏菌TTBGLYWT经发酵、提取制得。采用上述技术方案，能够在降低牛奶中乳糖含量的同时，合成大量的低聚半乳糖，其中，乳糖的水解率最高可达95.24％，低聚半乳糖占牛乳中糖分最高可达37.13％。文档编号C12R1/19GK101781633SQ200910227840公开日2010年7月21日申请日期2009年12月23日优先权日2009年12月23日发明者仪宏,冯惠勇,卢楠,王丽丽,王卿卿申请人:河北科技大学