专利名称：一类用于端粒酶活性检测的引物的制作方法
一类用于端粒酶活性检测的引物
技术领域：
本发明涉及一类新型的用于端粒酶活性检测的引物设计方案，属于生物技术领域。
背景技术：
目前，癌症已经成为了人类健康的第一杀手。研究发现细胞永生化是肿瘤细胞区 别于正常细胞的重要特征之一，也是肿瘤生长和转移的关键。研究发现细胞的寿命是由端 粒的长度决定的。端粒是位于真核细胞线性染色体末端的一种特殊结构。在正常细胞中， 随着细胞分裂的进行，端粒DNA不断縮短，当其縮短到一个临界值后，细胞停止分化，并出 现程序性死亡。而在大多数肿瘤细胞中，由于存在着一种特殊的活性酶类，可以使端粒的长 度不随细胞分裂次数的增加而縮短，而且可以延长端粒，帮助细胞跨越衰老、危象而达到永 生。这种酶被称之为端粒酶(telomerase)。专家预测，端粒酶的活性分析可用于癌症的早 期诊断及恶性程度判断。 目前，端粒酶活性的检测研究已成为国际上的研究热点，并已有多种方法见诸 报道。在这些方法中，以Kim等人于1994年建立的端粒重复扩增法(Telomeric r印eat amplification protocol, TRAP)最为引人注目。在此基础上，人们不断进行改良，提出了一 系列端粒酶活性检测的新方法。这些检测方法包括TRAP引物改良法、亲合闪烁分析-TRAP 法、TRAP-酶联免疫吸附分析法、杂交保护分析-TRAP法、比色杂交分析-TRAP法等。但就 这些方法而言，都存在着一定的缺陷与不足，PCR扩增技术的使用增加了样品间交叉污染的 危险性，这就为它们在临床上的应用推广设置了一定的障碍。 开发一种简便、价廉的端粒酶活性检测技术，省去对PCR扩增的需求无疑具有极 大的吸引力。为此，Willner等人开发了一种用于端粒酶活性检测的催化分子信标方法。 通过将一段可形成G-四联体结构的DNA序列巧妙地包埋在分子信标的发夹结构当中，使其 不能形成G-四联体结构，而当该分子信标的3'-端在端粒酶的作用下延伸出端粒重复序 列以后，分子信标的环部序列与延伸出的端粒重复序列结合而导致分子信标的发夹结构打 开，G-四联体结构重新形成。该G-四联体与氯化血红素结合后可催化过氧化氢氧化多种 底物的反应，产生可测的吸收信号或化学发光信号，从而实现端粒酶活性的检测。这种方法 的开发为端粒酶活性的检测开辟了一个全新的方向，在此基础上，可望开发出简便、价廉的 端粒酶活性检测方法，克服传统端粒酶活性检测方法的一些缺陷，进而实现在临床上的推 广及应用。但就该方法而言，同样存在一定的缺陷与不足，如(l)该方法所用的端粒酶引 物上包含有四组连续的G序列，即自身满足了 G-四联体形成的条件。虽然通过将这部分序 列包埋于发夹结构中的方法阻止了部分G-四联体的形成，但这种阻止作用并不完全。即这 种方法存在较强的背景信号，从而在一定程度上影响了检测的灵敏度。(2)该方法中，引物 在端粒酶的作用下延伸出较长的端粒重复序列(至少2个以上的端粒重复序列)后才能导 致G-四联体结构的形成，从而产生可测的信号。也就是说，该方法要求检测的端粒酶具有 较高的活性，这也在一定程度上影响了检测的灵敏度。
发明内容
本发明目的是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一类全新的用于端粒酶活性检 测的引物，使用该类引物，可建立一种简便、价廉的端粒酶检测方法，省去了对传统的PCR 扩增的需求，可实现端粒酶活性的快速检测。 本发明提供的一类用于端粒酶活性检测的引物中包含有三组连续的鸟嘌呤G序 列，引物的序列特征如下 5'-环序列l-Gj-环序列2-Gn-环序列3-Gm-环序列4-3' 其中j = 2-6 ;n = 2-6 ;m = 2-6， 环序列4与人端粒序列相同，即该序列为T、 TT、 TTA、 TTAG或TTAGG。 环序列1、2、3可以是任意序列。 所设计的引物可以是但不限於 序列1 5, _tgggtagggcgggtt￡i_3, 序列2 5, _tgggtagggcgggtt_3, 序列3 5, _tgggtgggtgggtta_3, 序列4 5, _tgggtgggtgggtt_3, 序列5 5, _tgggtgggcgggtta_3, 序列6 5, _tgggtgggcgggtt_3, 序列7 5, _tgggtegggtgggtte_3, 序列8 5, _tgggtagggtgggtt_3, 序列9 5, _tgggtgggagggtte_3, 序列10 5, _tgggtgggagggtt_3, 序列11 5, tgggagggcgggtte_3, 序列12 5, _tgggagggcgggtt_3,(其中斜体加黑的ggg为3组连续的鸟嘌呤G序列，其余的为环序列) 本发明设计的引物包含有3组连续的G序列，引物自身不能满足G-四联体的形成
条件。而在端粒酶的作用下，该引物的3'-端可再延伸出一组连续G序列，从而满足G-四联体的形成条件，并在特定条件下可以形成G-四联体，该四联体与氯化血红素结合后可以显示过氧化物酶活性，催化过氧化氢氧化2，2'-氨基-二 (3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)的反应产生绿色产物，同时体系在A 二 422nm处的吸光度增强。根据测试样品体系与阴性对照(将测试样品加热使端粒酶失活)之间产生的吸光度差别的大小可对端粒酶的活性进行大致的判断。 利用该引物进行端粒酶活性检测的大致机理如图1所示 端粒酶引物的合理设计是这一方法的关键因素，设计的引物应满足下面四个条件(1)引物自身不能形成G-四联体结构；(2)引物在活性端粒酶的作用下3'-端可以进行延伸；(3)延伸产物可以形成G-四联体结构；(4)形成的G-四联体结构在与氯化血红素结合后具有过氧化物酶活性。为满足这些条件，我们设计的引物中包含有3组连续的G序列，连续G序列中核苷酸G的个数在2-6之间。该端粒酶引物的3'-端的序列与人端粒序列相同。 利用本发明的端粒酶引物进行端粒酶活性测定的优点和积极效果如下
(1)操作简便，省去了常用的PCR扩增步骤，不仅消除了因PCR产物交叉污染造成假阳性检测结果的危险性，而且使其更加适用于大批量样品的快速测定；(2)试剂价廉，端粒酶引物上不需要进行任何标记，同时不需要任何特殊、昂贵的仪器，只需普通的紫外_可见分光光度计即可；(3)与Willner等人开发的方法相比，该方法所具有的优点如下(a)端粒酶引物上只含有三组连续的G-序列，自身不存在形成分子内G-四联体的可能性，因此极大地减弱了背景信号对检测灵敏度所带来的不利影响；(b)在端粒酶的作用下，端粒酶引物只需要延伸出一组连续G序列，延伸出的片段明显要短得多，从而有利于增加端粒酶的周转率(turnover)，使更多的端粒酶引物得以延伸，从而生成更多的具有催化能力的G-四联体，进而可极大地提高检测的灵敏度。
图1是利用设计的引物进行端粒酶活性检测的机理图示。 图2是利用模拟端粒酶产物验证设计的引物用于端粒酶活性检测的可行性。(1)氯化血红素单独存在下的催化反应；(2)端粒酶引物存在下的氯化血红素的催化反应；(3)端粒酶引物模拟延伸产物存在下的氯化血红素的催化反应。 图3是用设计的引物进行白血病HL-60细胞中端粒酶活性检测的结果。(1)被测样品的检测结果；(2)阴性对照的检测结果。
具体实施方式
为了能更好地理解本发明，下面通过实施例对本发明作进一步的描述，但并不限制本发明。 实施例1.端粒酶引物的设计 设计的端粒酶引物序列如下5' -1~^1八^(:^7^，该引物中包含有三组连续G序列(带下划线的部分)，每组连续G序列中均含有3个G碱基。为验证设计的引物是否可用于端粒酶的活性分析，在该引物的3'-端引入GGG来模拟引物在端粒酶作用下的延伸产物，其具体序列为5' -T^TA^C^TTA,。通过考察端粒酶引物及模拟延伸产物在该DNA序列用作端粒酶
引物的可行性。 具体步骤如下 平行配制3管反应，反应液总体积为100 ii L。其成分如下10mmol/L Tris-HCl，pH = 8. 3， 1. 6mmol/L KCl，O. 8mmol/L Mg2+，0. 0017% TritonX-100。在其中两管中分别加入0. 9 i！ mol/L的端粒酶引物和端粒酶引物模拟延伸产物，另一管作为空白对照。将3管反应液在95t:下加热5分钟以破坏DNA可能存在的二级结构，然后降温至37t:并保持1小时以促进相应G-四联体结构的生成。向反应管中分别加入1. 75ymol/L氯化血红素，并继续在37t:下保持1小时使G-四联体与氯化血红素充分结合，之后连续加入11. 5mmol/L的2，2' _氨基_ 二 (3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)及11. 5mmol/L的过氧化氢。观察反应体系的颜色变化，并用数码相机照像记录。得到的结果如图2所示。从图2可以看出，在没有DNA的存在下，氯化血红素自身的催化能力很弱，反应体系没有显示出明显的颜色；端粒酶引物的存在并没有使氯化血红素的催化能力得到明显改善，反应体系基本上仍为无色。而端粒酶引物模拟延伸产物的存在使氯化血红素的催化能力得到了明显的提高，可强烈地催化过氧化氢氧化2， 2' _氨基_ 二 (3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)的反应生成绿色的反应产物，反应体系呈现出明显的绿色。从这一结果可以看出，此处设计的端粒酶引物可用于端粒酶活性的检测。 使用序列表中列出的其余ll个引物也取得了同样的结果，说明这ll个引物同样也可用于端粒酶活性的检测。 实施例2.将设计的引物用于白血病HL-60细胞中端粒酶活性的检测 本实施例中使用与实施例1中相同的端粒酶引物。在本实施例中，从HL-60细胞
中提取端粒酶并将提取出的端粒酶作用于端粒酶引物，同时使用灭活的提取物作为阴性对
照。对于具有端粒酶活性的待测样品而言，端粒酶引物可在端粒酶的作用下延伸，生成与实
施例1中端粒酶模拟延伸产物相同的序列；而对于阴性对照而言，端粒酶引物不能延伸。通
过比较待测样品反应体系及阴性对照与氯化血红素作用后所表现出来的过氧化物酶活性
的差别，进行待测样品中端粒酶活性的检测。对于过氧化氢氧化2，2'-氨基_二(3-乙
基-苯并噻唑啉-6-磺酸)的反应，通过观察A = 422nm处吸光度的变化来进行监测。 具体步骤如下 (1)细胞中端粒酶的提取 收集培养的白血病细胞HL-60，3000rpm离心3min分离沉淀细胞，弃上清。沉淀用预冷的PBS缓冲液悬浮，3000rpm离心3min，弃上清。将细胞重悬于预冷的冲洗缓冲液(H印es-KOH 10mmol/L，pH = 7. 5，MgCl2l. 5mmol/L，KCl 10mmol/L，DTT lmmol/L)中。4。C下，10000rpm离心lmin收集沉淀。将沉淀置于1. 5mL离心管中，加入200 y L裂解液(Tris-HCl10mmol/L， pH 7. 5， EGTA1,1/L， MgCl2 lmmol/L， P -巯基乙醇5mmol/L，甘油10%， CHAPS0. 5% ， PMSF 0. lmmol/L)，冰浴裂解30min，期间用移液器反复抽吸3次，以保证充分裂解。然后，于4°C ， 14000rpm离心30min，吸取上清液，依次10倍稀释。稀释液用液氮快速冷冻，置-7(TC保存备用。 阴性对照样品的制备取5 ii L细胞提取液，95t:下热处理30min使端粒酶失活。
(2)端粒酶活性的检测其成分如下1 X TRAP缓冲液(20,l/LTris-HCl， pH = 8. 3， 1,1/L EGTA，63,1/L KCl，O. 005 % Tween_20，0. lmg/mL BSA) ， 12mmol/L Mg2+， 3. 68 ii mol/L d(5' _TG3TAG3CG3T2A) ， lmmol/L dGTP。 一管中加入1 P L的端粒酶提取物，另一管中加入1 P L的阴性对照。将反应液在37t:下作用4小时，然后加入75 L水将总体积补足到100 L，并在95t:下加热5分钟以灭活其中的端粒酶并破坏DNA可能存在的二级结构，然后降温至37t:并保持1小时以促进相应G-四联体结构的生成。向反应管中分别加入1. 75iimol/L氯化血红素，并继续在37t:并保持1小时使G-四联体与氯化血红素充分结合，之后连续加入11.5mmol/L的2，2'-氨基-二 (3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)及过氧化氢。观察反应体系在A = 414nm处吸光度的变化(AA)。检测结果如图3所示。从该图可以看出，被测样品吸光度的变化要明显大于阴性对照，4分钟后两者的吸光度的差值达到最大。本实施例中两者在4分钟时AA可以达到O. 24。多次测定研究结果表明，在被测样品与阴性对照的AA超过0.05时，被测样品中端粒酶的活性可认定为阳性。 使用序列表中列出的其余ll个引物也取得了同样的结果，说明这ll个引物同样也可用于细胞提取物中端粒酶活性的检测。序列表〈no〉南开大学〈120〉 一类用于端粒酶活性检测的引物〈160>12〈210>1〈211>16〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1tgggtegggcgggtte〈210>2〈211>15〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tgggtegggcgggtt〈210>3〈211>15〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3tgggtgggtgggtte〈210>4〈211>14〈213〉人工序列〈400>4tgggtgggtgggtt<210>5〈211>15〈212>DNA〈213〉人工序列<400>5tgggtgggcgggtte〈210>6〈211>14〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6tgggtgggcgggtt〈210>7〈211>16〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7tgggtegggtgggtte〈210>8〈211>15〈212>DNA<213>人工序列〈400>8tgggtegggtgggtt〈210〉9<211>15〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>9tgggtggg鄉gttEl〈210>10〈211>14〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>10
〈210>11〈211>15<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉11tggg￡lgggCgggtt￡l
C0130]〈210〉12〈211>14〈212>DNA<213>人工序列〈400>12tggg郷gcgggtt
权利要求
一类用于端粒酶活性检测的引物，其特征在于该引物中包含有三组连续的鸟嘌呤G序列，引物的序列特征如下5′-环序列1-Gj-环序列2-Gn-环序列3-Gm-环序列4-3′其中j＝2-6；n＝2-6；m＝2-6，环序列4与人端粒序列相同，即该序列为T、TT、TTA、TTAG或TTAGG。
2. 根据权利要求l所述的引物，其特征在于该引物的序列可以是但不限于下列序列序列1`5, -tgggtegggcgggtte-3,序列2`5, _tgggtegggcgggtt_3,序列3`5, _tgggtgggtgggtte_3,序列4`5, _tgggtgggtgggtt_3,序列5`5, _tgggtgggcgggtte_3,序列6`5, _tgggtgggcgggtt_3,序列7`5,_tgggt￡lgggtgggtt￡l_3,序列8`5, _tgggtegggtgggtt_3,序列9`5,_tgggtggg￡lgggtt￡l_3,序列10`5, _tgggtggg￡igggtt_3,序列11`5,tggg￡lgggCgggtt￡l_3,序列12`5, _tggg￡igggcgggtt_3,。
全文摘要
一类新型的用于端粒酶活性检测的引物。该引物的序列特征为5′-环序列1-Gj-环序列2-Gn-环序列3-Gm-环序列4-3′；其中j、n、m＝2-6，环序列4与人端粒序列相同，即该序列为T、TT、TTA、TTAG或TTAGG。该引物中包含有3组连续的鸟嘌呤(G)序列。当以此引物作为端粒酶引物时，在端粒酶的作用下，该引物的3′-端可再延伸出一组连续G序列，从而使设计的引物满足G-四联体的形成条件，并可在特定条件下形成G-四联体结构，形成的G-四联体结构与氯化血红素结合后可以显示过氧化物酶活性，催化过氧化氢氧化2，2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)的反应，根据反应体系在λ＝422nm的吸光度变化可进行端粒酶活性的检测。检测操作简便，试剂价廉，检测灵敏度高。
文档编号C12N15/11GK101705277SQ20091022853
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月13日 优先权日2009年11月13日
发明者孔德明, 沈含熙, 蔡莉莉 申请人:南开大学 被以下专利引用 (2),