专利名称：：一种葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株mk19及其培养方法
技术领域：
：本发明涉及一种葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株(PhaffiarhodozymaMK19)，该菌株已于2009年11月16日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，简称CGMCC，其保藏编号为CGMCCNo.3445。具体实施方式实施例1本发明的法夫酵母突变株MK19的培养PDA固体斜面培养基配制如下200g马铃薯经洗净去皮切碎后，加水1000ml煮沸半个小时，用纱布过滤，其滤液再加20g葡萄糖，混匀后用去离子水补充液体体积至1OOOml，在温度115°C下灭菌15分钟，得到PDA液体培养基，向该PDA液体培养基中加入15g琼脂，待琼脂溶解、凝固后得到PDA固体培养基。配制液体种子培养基将40g葡萄糖、4.Og酵母粉、2.4g尿素、2.Og磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中并定容于1000ml，调节pH至6.0。配制液体低糖发酵培养基将40g葡萄糖、4.Og酵母粉、0.6g尿素、2.Og磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中并定容于1000ml，调节pH至6.0。培养条件与方法固体种子活化将含有筛选突变株MK19的菌液涂布在前面制备的PDA固体培养基平板上，在温度24-26t:下进行斜面培养5天，然后置于温度4t:下保存；从PDA斜面挑取菌苔接种至新鲜PDA斜面上，再在温度24-26。C培养3天，得到活化突变株MK19固体种子；液体种子活化从上述得到的活化突变株MK19固体种子挑取两环菌苔转移到在前面制备的液体种子培养基中，在温度24-26t:与搅拌速度200rpm下培养3天；得到的液体种子再以所述的液体培养基体积计按照10%接种量加到所述的液体培养基中，在温度24-26t:与搅拌速度200rpm下培养36小时；采用紫外分光光度法测定该培养液的OD值为10。(3)发酵培养上述得到的活化液体种子以所述的低糖或高糖发酵培养基体积计按6%接种量加到所述的低糖或高糖发酵培养基中，在温度24-26t:与搅拌速度220rpm下培养5天，得到所述突变株MK19的发酵液。按照说明书公开的高压液相色谱法检测虾青素含量的方法测定了本发明法夫酵母突变株MK19发酵液的虾青素含量，其结果列于表1中。还测定了所述法夫酵母突变株MK19发酵液的细胞密度0D600，其结果列于表1中。实施例2本发明的法夫酵母突变株MK19的培养该实施例按照与实施例1的同样方式进行，只是使用液体高糖发酵培养基。液体高糖发酵培养基配制方法如下将110g葡萄糖、4.Og酵母粉、0.6g尿素、2.Og磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中，定容至1000mL，调节pH6.0。按照说明书公开的高压液相色谱法检测虾青素含量的方法测定了本发明法夫酵母突变株MK19的虾青素含量，其结果列于表1中。还测定了所述法夫酵母突变株MK19发酵液的细胞密度0D600，其结果列于表1中。对比实施例1野生型法夫酵母菌株JCM9042的培养野生菌株JCM9042购买自日本理化研究所。该实施例按照与实施例1的同样方式进行。按照说明书公开的高压液相色谱法检测虾青素含量的方法测定了野生菌株JCM9042发酵液的虾青素含量，其结果列于表1中。还测定了所述野生菌株JCM9042的发酵液的细胞密度0D600，其结果列于表1中。对比实施例2野生型法夫酵母菌株JCM9042的培养野生菌株JCM9042购买自日本理化研究所。该实施例按照与实施例2的同样方式进行。按照说明书公开的高压液相色谱法检测虾青素含量的方法测定了野生菌株JCM9042发酵液的虾青素含量，其结果列于表1中。还测定了所述野生菌株JCM9042的发酵液的细胞密度0D600，其结果列于表1中。表1不同葡萄糖浓度下野生型和突变株细胞生长密度于虾青素含量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表l结果表明，在初始葡萄糖浓度为110g/L的情况下，野生菌JCM9042最终细胞密度0D600=25.2，虾青素含量为40.36iig/g(干细胞)，而本发明突变株MK19细胞密度达0D600=32，虾青素含量为918.53yg/g(干细胞)，本发明突变株MK19突变株细胞内虾青素含量是野生型菌株JCM9042的22倍。测定结果还表明，本发明的突变株MK19葡萄糖代谢脱阻遏，在高糖和低糖的培养基中虾青素的含量基本一致。而野生菌株JCM9042中虾青素的积累却随着葡萄糖的增加而减少至1/3，其代谢受到抑制。权利要求一种葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株(PhaffiarhodozymaMK19)，其保藏编号为CGMCCNo.3445。2.根据权利要求1所述的葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株MK19的培养方法，其特征在于该方法的步骤如下A、PDA固体斜面培养基配制如下200g马铃薯经洗净去皮切碎后，加水lOOOml煮沸半个小时，用纱布过滤，其滤液再加20g葡萄糖，混匀后用去离子水补充液体体积至lOOOml，在温度115t:下灭菌15分钟，得到PDA液体培养基，往该PDA液体培养基中加入15g琼脂，待琼脂溶解、凝固后得到PDA固体培养基；B、配制液体种子培养基将36-44g葡萄糖、3.6-4.4g酵母粉、2.0-2.8g尿素、1.6-2.2g磷酸二氢钾、0.4-0.6g硫酸镁七水合物溶解于蒸馏水，定溶至1000ml，调节pH至5.8_6.2;C、配制液体低糖发酵培养基将36-44g葡萄糖、3.6-4.4g酵母粉、0.4_0.8g尿素、1.6-2.2g磷酸二氢钾、0.4-0.6g硫酸镁七水合物溶解于蒸馏水，定溶至1000ml，调节pH至5.8-6.2;D、配制液体高糖发酵培养基将100-120g葡萄糖、3.6-4.4g酵母粉、0.4_0.8g尿素、1.6-2.2g磷酸二氢钾、0.4-0.6g硫酸镁七水合物溶解于蒸馏水，定溶至1000ml，调节pH至5.8-6.2;E、培养条件与方法(1)固体种子活化将含有筛选突变株MK19的菌液涂布在步骤(A)制备的PDA固体培养基平板上，在温度21-25t:下进行斜面培养3-7天，然后置于温度3-5t:下保存；从PDA斜面挑取菌苔接种至新鲜PDA斜面上，再在温度24-26t:培养37天，得到活化突变株MK19固体种子；(2)液体种子活化从上述(1)得到的活化突变株MK19固体种子挑取两环菌苔转移到在步骤(B)制备的液体种子培养基中，在温度24-26t:及摇床振荡速度180-220rpm下培养3天；得到的液体种子再以所述的液体种子培养基体积计按照8-10%接种量加到所述的液体培养基中，在温度24-26t:与振荡速度180-220rpm下培养35-40小时；采用紫外分光光度法测定该培养液的0D值为9-12;(3)发酵培养上述(2)得到的活化液体种子以所述的低糖或高糖发酵培养基体积计按照5-7%接种量接种至所述的低糖或高糖发酵培养基中，在温度24-26t:与振荡速度200-240rpm下培养4_5天，得到所述突变株MK19的发酵液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将40g葡萄糖、4.0g酵母粉、2.4g尿素、2.Og磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，制备得到所述的液体种子培养基。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将40g葡萄糖、4.0g酵母粉、0.6g尿素、2.Og磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水，并定容至1000ml中，制备得到所述的液体低糖种子培养基。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将100g葡萄糖、4.0g酵母粉、0.6g尿素、2.Og磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，制备得到所述的液体高糖种子培养基。6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述突变株MK19发酵液的虾青素含量是20-30mg/L。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的虾青素含量是采用高压液相色谱法检测的。全文摘要本发明涉及葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株MK19及其培养方法。采用60Co诱变筛选方法由法夫酵母野生型试验菌株得到本发明的法夫酵母突变株MK19，该法夫酵母突变株MK19经过固体种子活化、液体种子活化与发酵培养得到所述突变株MK19的发酵液。本发明的法夫酵母突变株MK19细胞密度达OD600＝32，虾青素含量为918.53μg/g，因此，该突变株细胞内虾青素含量是野生型菌株的22倍。此外，该菌株营养成分要求简单，培养基成本低廉，工业上应用可以简化虾青素生产工艺，缩短法夫酵母的生产周期，从而减少成本。文档编号C12R1/645GK101717731SQ20091024135公开日2010年6月2日申请日期2009年12月7日优先权日2009年12月7日发明者关国华,李颖,王珍芳,苗莉莉,迟爽申请人:中国农业大学