专利名称：一种启动子BgIosP586、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种启动子，特别是一种单子叶植物例如水稻的启动子，以及所述启 动子的制备方法及用途。
背景技术：
启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、 结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活 化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。在转 基因植物中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效 率表达外源基因的关键。根据启动子的转录模式可将其分为3类组成型启动子、组织或器官特异性启动 子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育 阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型 启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子。另一种高效的组成型启动子CsVMV是从木薯 叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus)中分离的。人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子。例如肌动蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV 35S启动子，可以更有效 地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β亚基基因 和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV 35S启动子，在转基因烟草中也 取得了很好的表达效果(Plant biotechnology, 2002,19(1) 19-26)。单子叶植物基因中常见的启动子有Ubi启动子(Plant ubiquitinpromoter)、 Actin 启动子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-I 启动子(Maize alcohol dehydrogenase 1 promoter)。Ubi启动子以其启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐。目 前，已经从很多泛素基因中分离得到启动子序列，包括玉米基因组中的Ubi-I启动子、水稻 泛素RUBQ2启动子、拟南芥泛素启动子、向日葵泛素UbBl启动子、烟草泛素Ubi. U4启动子、 马铃薯泛素Ubi7启动子、番茄泛素Ubil-I启动子，大麦泛素Mubl启动子。玉米泛素Ubi-I 启动子已经广泛地应用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中，水稻泛素RUBQ2启动子在水稻 和甘蔗中也有较多的应用。Actin启动子1990年由康奈尔大学的McElroy等首次在水稻中发现，属于强组成 型启动子。Actin启动子在单子叶禾本科中作用显著，但是邻近科属的植物中的基因调控功 能却十分不理想。因此，许多相关研究通过其他单子叶植物寻找Actin启动子，并成功在香 蕉、甜瓜、玉米和拟南芥中陆续发现。Actin启动子由于对基因表达的强调控作用，在单子叶 植物优良性状的转基因中已经得到越来越广泛的应用。Adh-I启动子调控乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)基因，对植物在缺氧环 境下乙醇脱氢酶的表达至关重要。Adh-I启动子对单子叶植物特别是谷类植物如水稻、燕麦和大麦，和少部分双子叶植物如烟草，基因的调控功能比花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子 提高10-50倍。Adh-I启动子主要应用于单子叶植物，对绝大部分双子叶植物基因表达的调 控效果都很有限。单子叶植物是被子植物的主要类群，单子叶植物中的禾本科、百合科、棕榈科和天 南星等，是非常重要的农业作物。单子叶植物基因的强效启动子，能够调控植物高效率表达 具有特殊性状的外源基因，对优良作物的分子育种研究意义重大。在强效启动子相关研究领域，发现并验证了许多单子叶植物的启动子。此外，双子 叶植物中的一些强效启动子如CsVMV启动子、番茄E8启动子、白藜芦醇合酶基因Vstl启动 子等高效启动子，在单子叶植物中也有很强的基因调控作用。尽管已经有上述已知的单子叶植物的启动子，本发明人通过对水稻基因组的深入 研究，提供了一种新的单子叶植物启动子，所述启动子能够用于调控单子叶植物中目的基 因表达，同时为研究单子叶植物中目的基因表达提供了一种新的工具和选择。
发明内容
本发明的一个方面，提供了一种具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的单子叶植物 启动子。在本发明中，所述启动子的具体碱基序列长度为590个碱基，如SEQ ID N0:1所 示TGCGTTTTCACCAGCCTACTTCTTTCCATCGATATCCTTGTGCTGGCACCGCGGCCGTCAAGTCATTGG TGAACAACCCCGAAGAATCTGTCTTGAGAAAAGAACACCATCAAATGCATACTCGTTGCTTTATAACTGAATCGTTC AAATCTGCAGCTTAATGTTGAAGCAAGCTAGCCATGGTCACTCACAAATGATTGATAGAAATTTCTAGAAGCTAGAA TCGACATCAGCAAATCACCGGCATGACCCACCTCGGCCGTCCATCCTCAACCATCCCGCACACAGATCAACGAGTAA AAGATGGCGCCTGTAGGAGACGTGGACAGGGCCCCGCCTCCACGTGTCCCTCACGCGAGCCACGACGTGGCGGACCC GCTCCAGAGCATTCTCGCGGCCGCGTCCCAACGGCCCAGATCGACCCGCACCCCTCGCATCGGACGGCCGTGCGGAG CTCCTCGTCGCCTATATACCCACCTCCTCCCGATCCTTCCGTTTCCTCCCCGCTTGAAGGGAAAGTAAGAAAGAAAG AAAAGAAAAAAAAAAGGAAAATCGTGTCTCGTCTCGTCTCGTCTTCGTCTCCCCCGATT(SEQ ID NO 1)在本发明中，将SEQ ID NO :1所示的启动子序列称为启动子BgIosP586，或简称为 P586启动子。该启动子为组成型启动子，带有该启动子和GUS的水稻愈伤组织经GUS染色实验 后，所述水稻愈伤组织变为蓝色。本发明的又一方面，涉及具有与SEQ ID NO :1所示核苷酸序列互补的序列的启动子。本发明的又一方面，还涉及SEQ ID NO :1所示单子叶植物启动子的具有启动子功 能的选自如下的变体1)在高等严紧条件下与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，2)对SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修 饰的核苷酸序列，和3)与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性 程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典
4型地发生在约Tm-5°C (低于探针Tm 5°C )；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10°C;“中等 严紧性”发生在探针Tm以下约10-20°C ；“低严紧性”发生在Tm以下约20_25°C。作为替 代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗 涤为依据。例如，6XSSC =极低严紧性；3XSSC =低至中等严紧性；IXSSC =中等严紧性； 0. 5XSSC =高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一 或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80%或更多序列同 一性的核酸序列。对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如， 选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，实验 室手册，Cold Spring HarborPress, Plainview, N. Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧 性在内的杂交条件。为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧 条件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液预洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中 杂交过夜；随后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗涤两次20分钟。 本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂 交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在 于杂交温度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本发明中，所述在高等严紧条件下与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列杂交的核 苷酸序列，其具有与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。在本发明中，所述对SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、 缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超 过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取 代、缺失、添加修饰。在本发明中，所述对SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基 的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的 启动子活性。通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQ IDNO 1的参考 核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ ID NO :1的参考核苷酸序列之每100个 核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核 苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95%相 同的多核苷酸，参考序列中多达5%的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些 核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5% ；或在一些核 苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5%。参 考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间 的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参 考序列中。在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它们分别描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389_3402 和
5Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST 和BLAST 2. O可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可 以通过国立生物技术信息中心(NCBI)为公众所获得。在本发明中，所述与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO :1所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本 文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本发明中，所述与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列具有与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。本发明中，所述的启动子来源于单子叶植物，具体地，所述单子叶植物为水稻，例 如所述水禾S为日本睛(Oryza sativa L. ssp. japonicacv. Nipponbare) 0本发明的又一方面，还涉及一种含有本发明所述单子叶植物启动子的重组载体。 所述重组载体可以通过将上述启动子插入到克隆载体或表达载体而得到。适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19_T Simple Vecter 等。适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。在本发明的一个实施方案中，所述重组载体为P8+P586重组载体。本发明的又一方面，还涉及含有本发明所述单子叶植物启动子的所述重组载体的 重组细胞。所述重组细胞可以通过将含有本发明所述单子叶植物启动子的所述重组载体转 化至宿主细胞而得到。适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如根癌农杆菌细胞 LBA4404、EHA105、GV3101 等。在本发明的一个实施方案中，所述重组细胞为重组根癌农杆菌(Agrobacteriumt umefaciens)EHA105-P586。本发明的又一方面，还涉及一种单子叶植物愈伤组织，所述愈伤组织转化有本发 明所述的启动子。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物为水稻。所述水稻包括但 不限于，例如中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰 优22，黔优88、11优416、11优107、11优128、11优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖 稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、 皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水 稻品种均可购自安徽徽商农家福有限公司)等。在本发明的又一实施方案中，所述水稻为 日本晴。本发明的又一方面，还涉及一种制备本发明所述启动子的方法，包括如下步骤1)根据SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，2)以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用步骤1)中所设计的PCR扩增引物对进行 PCR扩增。本领域技术人员周知，可以根据待扩增的目的核苷酸序列按照碱基互补原则设计 相应的PCR扩增引物对。在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增引物对如SEQ ID NO2 和 SEQ ID NO 3 所示。本发明的又一方面，还涉及一种调控单子叶植物中目的基因表达的方法，所述方 法包括用本发明所述单子叶植物启动子转化单子叶植物的愈伤组织的步骤。在本发明的一 个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化利用了含有本发明所述单子叶植物启动子 的重组细胞。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了 前述的重组农杆菌EHA105-P586。在本发明的一个具体实施方案中，所述单子叶植物的愈伤 组织为水稻愈伤组织，具体地，所述水稻为日本晴。在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农 杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周 知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其它转化技 术也可用于本发明所述单子叶植物的基因转化。当然，适于本发明的转化单子叶植物的另 一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外， 还可以采用的转化单子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后，采用通用的方法来筛 选和再生整合有表达单元的植株。本发明中，可利用所述单子叶植物启动子调控目的基因表达的所述单子叶植物包 括但不限于，例如水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦等。本发明的又一方面，还涉及本发明所述单子叶植物启动子在单子叶植物中调控目 的基因表达的应用。在本发明的一个实施方案中，利用本发明所述启动子调控的目的基因 是GUS。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物为水稻，具体地，所述水稻为日本晴。为实现上述调控目的基因表达的目的，本发明所述启动子可以以单拷贝和/或多 拷贝的形式应用，也可以与现有技术中已知的启动子联用。本发明的又一方面，涉及本发明所述启动子在水稻育种中的用途。所述水稻为日 本睛、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔 优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、 皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻 195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101。在本发明的 一个实施方案中，所述水稻为日本晴。本发明的启动子可成为一种新的启动子作为单子叶植物、尤其是水稻转基因的工 具启动子，为开展低表达基因转化苗筛选、植物花器官败育等分子育种研究提供便利，从而 极大的缩短优良品种的选育时间。本发明的启动子可广泛用于培育水稻、小麦、玉米、小米、 甘蔗、高粱、大麦等单子叶植物。发明的有益效果为了寻找新的单子叶植物启动子，用于调控单子叶植物目的基因表达，同时为研 究单子叶植物基因表达提供新的工具和选择，本发明人通过生物信息学研究获得，并采用 生物学实验验证了所述启动子BgIosP586的功能。具体地，所述启动子能够在水稻中调控 ⑶S基因表达。
图1是启动子BgIosP586的PCR扩增检测结果，其中，泳道1 IkbDNA LadderMarker,泳道2 =PCR扩增产物，泳道3 IOObp DNA LadderMarker,其右侧的数字500和600 表示所指向的Ladder Marker的条带的大小，单位都是bp。图2是用于构建p8质粒的pCAMBIA-1301质粒示意图。图3是p8质粒示意图中多克隆位点和GUS序列部分的示意图。图4是p8质粒示意图。图5是经转化的水稻愈伤组织的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子 P586序列的重组根癌农杆菌P8+P586转化的水稻愈伤组织(左)经⑶S染色后呈现蓝色； 不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8质粒的水稻愈伤组织(对照，右)经⑶S染 色后颜色未发生变化。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用 试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1P586启动子片段的PCR扩增和pMD18_T+P586重组载体的构建PCR 扩增使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录 号DP320-02)提取水稻日本晴(2009年12月18日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉 大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC-P200910)的基因 组DNA，根据该启动子在水稻日本睛gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增 引物(上游引物F1，加限制性酶切位点Kpn I和保护碱基，下游引物R1，加限制性酶切位点 Sbf I和保护碱基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA为模板，使用高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表1所示。表1基因启动子扩增的PCR体系
权利要求
一种具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列的启动子，或其具有启动子功能的选自如下的变体1)在高等严紧条件下与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，2)对SEQ ID NO1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和3)与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。
2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的启动子，优选地， 所述重组载体为P8+P586重组载体。
3.一种含有权利要求2所述重组载体的重组细胞。
4.权利要求3所述的重组细胞，其为重组农杆菌EHA105-P586。
5.一种单子叶植物愈伤组织，其特征在于，所述愈伤组织转化有权利要求1所述的启 动子，优选地，所述愈伤组织为水稻愈伤组织，更优选地，所述水稻为日本晴、中花9、中花 10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、 II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、 皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖 稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，特别优选地，所述水稻为日本 晴。
6.一种制备权利要求1中所述的启动子的方法，包括如下步骤1)根据SEQID NO :1所示的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，具体地，所述PCR扩增 引物对为 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :3。2)以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用步骤1)中所设计的PCR扩增引物对进行PCR 扩增。
7.—种调控单子叶植物中基因表达的方法，所述方法包括用权利要求1所述的启动子 转化单子叶植物的愈伤组织的步骤，优选地，所述愈伤组织为水稻愈伤组织，特别优选地， 所述水稻为日本晴。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述单子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了权 利要求4所述的重组农杆菌EHA105-P586。
9.权利要求1所述的启动子在调控单子叶植物中目的基因表达的用途，其中所述目的 基因为GUS，所述单子叶植物为水稻，优选的，所述水稻为日本晴。
10.权利要求1所述的启动子在水稻育种中的用途，优选地，所述水稻为日本晴、中花 9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II 优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、 皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻 197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，特别优选地，所述水稻 为日本晴。
全文摘要
本发明涉及一种启动子，特别是一种单子叶植物例如水稻的启动子，以及所述启动子的制备方法及用途。本发明所述启动子具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列，或其具有启动子功能的选自如下的变体1)在高等严紧条件下与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，2)对SEQ ID NO1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和3)与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。本发明还涉及所述启动子的制备方法以及所述启动子在调控单子叶植物中目的基因表达和水稻育种中的用途。
文档编号C12N15/82GK101955936SQ200910249578
公开日2011年1月26日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者曹颖, 杨爽, 章成, 蔡晶, 顾锐 申请人:深圳华大基因科技有限公司