专利名称：农杆菌介导小麦遗传转化体系的完善及转基因研究的制作方法
技术领域：
农杆菌介导小麦遗传转化体系的完善及转基因研究，属于植物基因工程技术领 域。
背景技术：
小麦是禾本科(Gramineae)小麦属(Triticum) —年生或多年生草本植物，是世界 上重要的粮食作物之一。利用植物基因工程技术进行小麦遗传改良，以提高小麦产量、改善 品质、增强抗病虫和抗逆能力，是小麦遗传育种的一个新的方向。自1983年获得第一株转基因作物以来，作物转基因技术得到了迅猛发展，转基因 作物育种已成为常规育种的有效补充。目前，几乎所有的作物都开展了转基因研究，育种目 标涉及到高产、优质、高效、兼抗性及多用途等诸多方面，一批抗逆性(如抗病、抗虫、抗除 草剂)转基因作物已进入商品化生产阶段。由于受到转基因技术的限制，小麦转基因研究 滞后于其它作物，直到1992年Vasil等将⑶S/Bar基因导入小麦品种Pavon，并获得了抗除 草剂Basta的再生植株，才宣告世界上首例转基因小麦问世。在国内，小麦遗传转化发展也 很迅速，Cheng等在1997年成功获得可育的转基因植株，1999年Xia等在中国首次报道获 得了稳定胚性组织的转基因小麦植株。实验的成功，表明小麦育种已经从传统的育种方法 过度到了“分子育种”的阶段。近年来对转基因小麦的研究发展很快，并取得了一定的成就，但与双子叶植物 相比，甚至与其他禾谷类作物(如水稻和玉米)相比，仍然存在较大的差距(肖兴国等， 2000)。目前，小麦转基因技术仍处于建立和优化阶段。这主要是由以下几个方面的原因造 成的第一、缺乏有效的离体再生体系。小麦组织培养中植株再生率低和基因型依赖性强 的问题一直是限制转基因成功及大幅度提高转基因小麦数量的主要因素；第二、用于基因 转化的外植体材料比较少。幼胚是进行小麦遗传转化的主要外植体，但往往受到取材季节 的限制；第三、过分依赖基因枪法。目前转基因小麦90%以上是用基因枪法获得的，而基因 枪法则存在许多缺点，限制了小麦转基因的发展；第四、对农杆菌转化单子叶植物特别是转 化小麦的机理缺乏系统和深入的研究；第五、小麦本身是异源六倍体，其基因组较大并且复 杂，导入的外源基因沉默与修饰现象很严重。尽管以上许多因素延缓了小麦转基因技术的发展，但是随着多种转基因体系的建 立，小麦转基因研究的发展速度将会加快。研究方向将会由以基因枪法为主而逐渐转向以 农杆菌介导法为主，同时各种辅助农杆菌介导的技术也将走向成熟，这将有助于优化和完 善农杆菌介导的小麦转基因技术体系。
发明内容
1、小麦遗传转化的主要方法基因枪转化是小麦遗传转化中最常用的方法，其转化体系已基本建立。农杆菌介 导的小麦遗传转化获得了突破，并将以其诸多优点替代基因枪转化而成为今后研究的热点。花粉管通道转化取得了实用性成果，以其简便易行被更多的育种家所接受。(1)基因枪法基因枪转化是将外源基因在Ca2+或亚精胺等作用下吸附在重金属金或钨粒子表 面(直径1 μ m左右)，制成DNA微弹，利用基因枪将微弹高速射入植物受体细胞，释放出的 DNA分子随机整合到植物基因组中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，从而实现 遗传转化。现在基因枪法的转化体系已相对比较成熟，早在1995年就提出了完整的转化体 系。因此由基因枪介导的小麦遗传转化作为改良小麦性状、提高小麦抗性的主要手段之一 被广为应用。在国内，张晓东等人用基因枪法将除草剂抗性基因与小麦1Dx5和IDylO亚基 克隆重组质粒导入到小麦幼胚和幼穗中，获得转基因植株。梁静静等利用基因枪法将重组 质粒pCAMBIA1301-Sub5+10导入小麦幼胚，获得了经PCR检测证明的转基因植株，Rooke等 获得了 1Dx5亚基超量表达的小麦品系(约为自然表达量的4倍)。影响基因枪介导小麦遗传转化效率的因素有很多，比如受体材料的类型、生理状 态、接受和整合外源DNA的能力、金粒制备和轰击参数(如微弹速度、射程、金粉用量、轰击 次数、真空度、质粒DNA用量)等。虽然不同材料有所差异，但轰击时的金粒用量应该在细 胞承受损伤的范围之内，并且保证达到有效轰击。另有些研究表明，受体材料轰击前的预培 养也可以提高基因枪转化效率。在进行基因枪轰击后，小麦幼胚能否长出胚性愈伤组织是转基因小麦成苗的关键 因素之一。因为小麦幼胚在经过基因枪轰击后，组织会受到一定损伤，再生能力会大大下 降，随着基因型的不同，小麦自身的修复和抵御伤害的能力也有所不同。所以，选择良好基 因型的小麦幼胚作为轰击对象是进行基因枪遗传转化的首要条件。只有具有优良基因型的 转基因小麦品种才具有广阔的研究价值和生产价值。同时金粒制备质量的好坏也直接影响 到小麦幼胚在轰击后的成活及转化率。经过充分混勻金粒悬浮液可以减少幼胚损伤和提高 转化频率，而且研究发现对子弹涡旋振荡后再进行超声波振荡的效果会更好。利用甘露醇 进行渗透处理可以增强瞬间表达效果！稳定转化频率及提高植株再生率。但不同受体基因 型要求的处理的时间与浓度也不尽相同。(2)农杆菌介导法农杆菌是一种革兰氏阴性土壤病原菌，主要有根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobaterium rhizogenis)。根癌农杆菌的Ti质粒是根癌农 杆菌核外的一种环状双链DNA分子，大约长2001Λ，包括毒性区(Vir区)、接合转移区(Con 区)、复制起始区(Ori区)和T-DNA区四部分。其中一半左右的序列参与质粒复制，冠瘦碱 代谢和接合功能，对致瘤不起作用。另外一半序列包括T-DNA区和毒性区(Vir region), T-DNA长约231Λ左右，其两端边界处各有一个25bp的正向重复序列，在不同农杆菌Ti质 粒上高度保守，在农杆菌的Ti质粒的T-DNA和Vir能侵染植物的受伤部位T-DNA和Vir能 侵染植物的受伤部位，导致受伤部位长瘤或长根。农杆菌转化植物细胞是通过将其体内的 一段T-DNA转移到被侵染的植物细胞而实现的。农杆菌附着到植物伤口组织上后，通过二 者间的相互作用，农杆菌可形成纤维素小纤丝将其固定在植物细胞壁上，同时诱导受伤的 植物组织释放一些酚类化合物，如乙酰丁香酮(AQ，羟基乙酰丁香酮(AS-OH)等，这些酚类 化合物就作为信号分子，从而激活其它Vir基因的转录，并激活根癌带有目的基因片段的T-DNA插入愈伤组织的染色体中。由于农杆菌侵染植物是一个互相作用的过程，在对农杆菌 感染植物过程本身因子的转录与调控有一定认识的时候，一些研究也注意了被感染植物细 胞中有关的分子过程。发现了与T-DNA转入、Vir区激活有关的植物蛋白分子，如VirCl促 进VirD2的酶解作用；边界特异性内切酶T-链的核定位；T-DNA转移引导蛋白保护T-链免 遭外切酶攻击等。
权利要求
1.农杆菌转化植物细胞是通过将其体内的一段T-DNA转移到被侵染的植物细胞而实 现的。农杆菌附着到植物伤口组织上后，通过二者间的相互作用，农杆菌可形成纤维素小纤 丝将其固定在植物细胞壁上，同时诱导受伤的植物组织释放一些酚类化合物，如乙酰丁香 酮(AS)，羟基乙酰丁香酮(AS-OH)等，这些酚类化合物就作为信号分子，从而激活其它Vir 基因的转录，并激活根癌带有目的基因片段的T-DNA插入愈伤组织的染色体中。由于农杆 菌侵染植物是一个互相作用的过程，在对农杆菌感染植物过程本身因子的转录与调控有一 定认识的时候，一些研究也注意了被感染植物细胞中有关的分子过程。
全文摘要
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，小麦品种的遗传改良工作始终受到科学家的广泛关注。农杆菌介导的小麦遗传转化是最具潜力的一种转基因方法，多年来人们一直致力于影响转化率各个因素的研究。本实验以22个小麦成熟胚及6个小麦幼胚为材料，进行外植体愈伤组织诱导及分化再生的研究，优化小麦外植体再生体系。在此基础上采用农杆菌介导的方法对小麦外植体愈伤组织进行遗传转化，并对影响遗传转化效率的因素进行研究，完善农杆菌介导的小麦遗传转化体系。结果表明，基因型是影响小麦外植体愈伤组织形成和分化再生的重要因素；接种菌液浓度及侵染时间、共培养条件等因素，对小麦外植体愈伤组织遗传转化效率有较大影响；获得的转基因小麦再生植株，为小麦遗传转化研究及转基因后代的遗传分析奠定坚实的基础。
文档编号C12N15/82GK102094041SQ20091024966
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者陈红余 申请人:陈红余