专利名称：用于提高汉坦病毒融合蛋白g2s0.7表达的腺病毒高表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及分子生物学、免疫学及免疫应用等相关领域。本 发明涉及腺病毒重组转移载体的改建及其对肾综合征出血热(HFRS)致病原——汉坦病毒 (HV)的嵌合基因G2S0. 7的表达。
背景技术：
肾综合征出血热及其基因工程疫苗研究现状肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)是由汉坦病 毒(Hantavirus，HV)引起，由鼠类等传播的一种急性病毒性传染病，临床上以发热、出血和 急性肾功能损害为主要特征。中国是世界上HFRS疫情最严重的国家，具有流行范围广、发 病人数多、病死率高等特点，到目前为止临床上尚缺乏特异有效的治疗药物。为易感人群接种疫苗是预防传染性疾病大规模流行的最有效措施。因此，针对 HFRS疫苗的研究一直是该领域的热点。国内外近年来虽已研制出HFRS的灭活疫苗，但从 部分人群试用的情况来看，该类疫苗还存在明显不足，主要是其诱导机体产生中和抗体的 能力较弱，也不能有效地刺激细胞免疫应答。目前在HFRS基因工程疫苗基础研究中主要 使用的是病毒囊膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)，但GP免疫原性相对较弱，刺激机体产生的 抗体出现较晚，滴度亦不高。本发明人多年对HV中免疫原性最强的核蛋白(Nucleocapsid Protein, NP)的结构及功能，NP与GP不同片段嵌合基因(G1S0. 7、G2S0. 7)的构建及其表 达，以及不同融合基因(蛋白)刺激机体免疫应答的能力及其影响因素等进行了较为深入 的研究。一系列体内、外实验结果表明，上述嵌合基因在腺病毒表达系统中能有效地刺激机 体的体液免疫(包括中和抗体)应答以及细胞免疫应答，且其效果均高于非嵌合组。然而在研究中我们也发现了一些问题，如尽管利用各种系统均能表达出完整的融 合蛋白，但总的来说蛋白表达量还是偏低。此外，用融合蛋白免疫动物后虽然各表达系统均 能刺激机体产生体液及细胞免疫应答，且腺病毒表达系统的效果要优于其他系统，但是整 体的免疫水平还不十分理想。因此，进一步选择合适的表达载体、优化表达系统对目前HFRS 基因工程疫苗的研究有着重要的意义。表达载体的优化在HFRS基因工程疫苗研究领域里，如何提高外源基因的表达水平是亟待解决的难题之一。由于转录外源DNA序列的启动于和增强子是最基本的真核表达组件，因此，选 择合适的启动子或增强子并改进其活性是提高外源基因表达首先要考虑的问题。许多 来源于病毒的增强子元件，如SV40的早期基因增强子，Rous肉瘤病毒基因组长末端重复 序列(LTR)区和人类巨细胞病毒(CMV)早期启动子，在来自各种哺乳动物的多种型别细 胞中都有很强的活性。目前广泛应用的CMV启动子虽然是比较有效的表达系统启动子， 但实际应用中有些基因通常不能得到满意的表达效果。例如Garg S, et al. Thehybrid cytomegalovirus enhancer/chicken β -actin promoter along withwoodchuckhepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances theprotective efficacy of DNA vaccines. 2004 ;J Immunol. 173 :550 558 比较了 使用人 CMV 启动 子和CAG启动子/增强子(人CMV启动子和鸡β-actin启动子的杂合体)的流感病毒 血凝素(haemagglutinin，HA)DNA疫苗的免疫效果，使用CMV启动子几乎不能诱发任何 抗HA抗体，而使用CAG启动子/增强子可诱发较低水平的抗HA抗体。You LM, et al. A hybrid promoter-containing vectorfor direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs inmammalian cells. 2009 ；Sep 16. Mol Biol Rep.等的最新研究表 明他们设计的一个含CAG启动子/增强子的真核载体pCAGX能在更广泛的宿主细胞中提 高外源基因的蛋白表达水平。此外还有Yoshio Nitta, et al. A CMV-actin-globinhybrid promoter improves adeno—associated viral vector gene expression in thearterial wall in vivo.The Journal ofGene Medicine. 2005 ；7 (10) 1348 1355 和 Halbert CL, et al.High-efficiency promoter-dependent transduction by adeno—associated virus type 6vectors in mouse lung. Hum Gene Ther.2007Apr ； 18 (4) :344 354。多 项报道显示CAG启动子比CMV启动子诱生抗体的水平要高。因此本专利中腺病毒转移 载体的优化研究采用了 CAG启动子/增强子替换原有的CMV启动子。此外，国内外学者 的研究表明，选择不同的启动子并配合不同的转录调节元件有助于选择出适用于特定基 因的表达系统。如前文所述的Garg等的流感病毒血凝素DNA疫苗的免疫效果的研究， 如在HA基因后加上土拨鼠肝炎病毒稳定mRNA转录后调节元件(mRNA-stabiIizingpo st—transcriptional regulatory element from the woodchuck hepatitis virus, WPRE)后，均可提高CMV启动子和CAG启动子诱生抗HA抗体的水平，且CAG启动子比CMV 启动子诱生抗体的水平高一倍。在腺病毒表达系统中，也有Xu ZL, et al. Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional reguIationelement enhances transgene expression from adenovirus vectors. BiochimBiophys Acta. 2003 ； 1621 (3) :266 271 和Boulos S, et al. Assessment of CMV, RSV and SYNl promoters and the woodchuck post-transcriptional regulatoryelement in adenovirus vectors for transgene expression in cortical neuronalcultures. Brain Res. 2006 ；1102 (1) :27 38 多项石if 究显示WPRE可以增强不同启动子的活性，增强基因的表达。
发明内容
本发明的目的是将本申请人前期构建的含汉滩病毒76-118株的G2和SO. 7的嵌 合基因与腺病毒转移载体的重组质粒G2S0. 7-pShuttle进行改建，以获得用于提高汉坦病 毒融合蛋白G2S0. 7表达的腺病毒高表达载体。本发明目的是以下述方式实现的一种用于提高汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7表达 的腺病毒高表达载体，对含嵌合基因G2S0. 7的腺病毒转移载体G2S0. 7-pShuttle进行改 建，将其CMV启动子替换为CAG启动子/增强子，得到含CAG启动子/增强子的高表达汉坦 病毒融合蛋白G2S0. 7的腺病毒重组转移载体，命名为G2S0. 7-pCAG，其全基因序列为SEQ ID NO 1 所示。一种用于提高汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7表达的腺病毒高表达载体，对含嵌合基 因G2S0. 7的腺病毒转移载体G2S0. 7-pShuttle进行改建，在其3，端插入WPRE转录调控元件，得到含WPRE调控元件的高表达汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7的腺病毒重组转移载体，命名 为G2S0. 7-WPRE，其全基因序列为SEQ ID NO 2所示。一种用于提高汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7表达的腺病毒高表达载体，对含嵌合基 因G2S0. 7的腺病毒转移载体G2S0. 7-pShuttle进行改建，将其CMV启动子替换为CAG启动 子/增强子并在其3，端插入WPRE转录调控元件，得到含CAG启动子/增强子和WPRE调控元 件的高表达汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7的腺病毒重组转移载体，命名为G2S0. 7-pCAG-ffPRE, 其全基因序列为SEQ ID NO 3所示。本发明利用基因重组技术，将本申请人前期构建的含汉坦病毒76-118株的G2与 SO. 7的嵌合基因与腺病毒转移载体的重组质粒G2S0. 7-pShuttle进行改建。本发明包括 替换重组质粒G2S0. 7-pShuttle的启动子(CAG)或(和)插入转录后调控元件(WPRE)，以 提高融合蛋白G2S0. 7的表达水平。将本发明及未改建质粒G2S0. 7-pShuttle分别整合进 腺病毒DNA，在HEK293细胞中包装腺病毒，比较各组重组腺病毒外源蛋白G2S0. 7的表达水 平。结果显示本发明与原转移载体PShuttle相比，均能有效提高外源蛋白的表达，且以替 换启动子组效果最明显。
图 1. G2S0. 7-pCAG Nhe I+Not I 双酶切鉴定结果。其中Ll :G2S0. 7-pCAG ;M 500bp DNA Ladder Marker。图 2. G2S0. 7-WPRE Kpn I+Aft II 双酶切鉴定结果。其中L1 :G2S0. 7-ffPRE ；M :DL 2000Markero图3.改建重组转移载体G2S0. 7-pCAG-WPRE示意图。图 4. G2S0. 7-pCAG、G2S0. 7-WPRE、G2S0. 7-pCAG-ffPRE 重组转移载体 Nhe I+Not I 双酶切鉴定结果。其中L1 :G2S0. 7-pCAG ；L2 :G2S0. 7-ffPRE ；L3 :G2S0. 7-pCAG-ffPRE ；M Wide Range DNA Marker。图 5. Ad-G2S0. 7-pCAG、Ad_G2S0· 7-WPRE、Ad_G2S0· 7-pCAG-ffPRE 重组转移载体 I-Ceu I+PI-Sce I 双酶切鉴定结果。其中L1 :Ad_G2S0. 7-ffPRE ；L2 :Ad_G2S0. 7-pCAG ；L3 Ad-G2S0. 7-pCAG-ffPRE ；M =Wide Range DNA Marker。图6.融合蛋白G2S0. 7在不同重组腺病毒中表达的免疫荧光检测结果。其中A Ad-G2S0. 7 ；B :Ad_G2S0· 7-ffPRE ；C :Ad_G2S0· 7-pCAG ；D :Ad_G2S0· 7-pCAG-WPRE。E 正常 293 细胞对照。图7.融合蛋白G2S0.7在不同重组腺病毒中表达的Western Blot结果。其 中 A :293 细胞对照；B =Adenovirus-Lac-Z 对照 C :Ad_G2S0· 7 ；D :Ad_G2S0· 7-ffPRE ；E Ad-G2S0. 7-pCAG ；F :Ad-G2S0. 7-pCAG-WPRE。
具体实施例方式本发明所用的腺病毒表达系统购自CL0NTECH公司的Adeno-X 系统(货号 K1650-1)，其转移载体为pShuttle，含有CMV启动子。本发明中所采用的汉坦病毒为汉滩病毒76-118株。其基因组由L、M和S三个基因 片段组成。其中L片段编码RNA依赖的RNA聚合酶；M片段编码囊膜糖蛋白(GP)Gl和G2 ；S片段编码核衣壳蛋白(NP)。本专利中所涉及的嵌合基因由其M片段的G2部分及S片段 的0. 7部分分别PCR扩增获得，利用基因融合技术将其融合，并在其5’端设计Xba 1、3’端 设计NotI酶切位点，克隆入腺病毒转移载体pShuttle的相应酶切位点获得重组质粒，命名 为 G2S0. 7-pShuttle。 本发明中所替换的CAG启动子/增强子是人类巨细胞病毒 (humancytomegalovirus, CMV)早期启动子与鸡β-actin启动子的杂合体。其序列是综 合参考其他人文献，并根据本项目要求在其5’端设计Mfe 1,3'端设计Sfi I，Nhe I酶切 位点，其中Sfi I用于后续研究克隆位点，片段大小1747bp，交由Takara公司至pMD19-T Simple载体中合成。改建后的重组转移载体命名为G2S0. 7-pCAG。G2S0. 7-pCAG的全基因 序列为SEQ ID NO 1所示。本发明中所插入WPRE转录调控元件全名为土拨鼠肝炎病毒稳定mRNA转录后 i周节 7Π 件(mRNA-stabilizing post-transcriptional regulatory elementfrom the woodchuck hepatitis virus，WPRE)，其序列参考GENBANK序列编号 AX823860 的WPRE序列， 根据本发明要求在其5’端和3’端分别设计Kpn I和Afl II酶切位点，片段大小623bp， 交由Takara公司至pMD19-T Simple载体中合成。重组转移载体命名为G2S0. 7-WPRE。 G2S0. 7-WPRE的全基因序列为SEQ ID NO 2所示。本发明中所涉及的第三种重组转移载体在上述G2S0. 7-pCAG基础上改建获得。利 用WPRE序列上的Kpn I和Afl II酶切位点克隆入pCAG相应的位点。改建后的重组转移 载体命名为 G2S0. 7-pCAG-WPRE。G2S0. 7-pCAG-WPRE 的全基因序列为 SEQ ID NO :3 所示。本发明中所有重组质粒构建方法具体如下1)G2S0. 7-pCAG构建方法根据腺病毒转移载体pShuttle的酶切位点，设计各改 建片段的插入酶切位点，CAG序列5，端设计Mfe 1，3，端设计Sfi I,Nhe I，其中Sfi I用于 后续研究克隆位点。用Mfe I和Nhe I分别双酶切pShuttle和pMD19_T Simple-CAG质粒， 构建pCAG重组载体。Nhe I和Not I分别双酶切pCAG重组载体和G2S0. 7-pShuttle质粒， 胶回收目的片段(G2S0. 7)和载体(pCAG)，T4连接酶14°C连接过夜，连接产物转化(JM109 感受态)后涂布含卡那抗性的2 X YT固体培养基，37°C孵箱培养12 14小时，挑选单菌落 摇菌提质粒后酶切鉴定，获得阳性克隆。附图1.为G2S0. 7-pCAG阳性克隆Nhe I+Not I双 酶切鉴定结果。2)G2S0. 7-WPRE构建方法根据腺病毒转移载体pShuttle的酶切位点，为WPRE序 列的5’端和3’端分别设计Kpn I和Afl II酶切位点。用Kpn I和Afl II分别双酶切 PMD19-T Simple-WPRE和G2S0. 7-pShuttle质粒，胶回收目的片段和载体，T4连接酶14°C 连接过夜，连接产物转化(JM109感受态)后涂布含卡那抗性的2XYT固体培养基，37°C 孵箱培养12 14小时，挑选单菌落摇菌提质粒后酶切鉴定，获得阳性克隆。附图2.为 G2S0. 7-WPRE阳性克隆Kpn I+Afl II双酶切鉴定结果。3)G2S0. 7-pCAG-ffPRE构建方法Kpn I和Afl II双酶切重组转移载体 G2S0. 7-pCAG，并同样双酶切pMD19_T Simple-ffPRE,胶回收载体和目的片段，T4连接酶 14°C连接过夜，连接产物转化(JM109感受态)后涂布含卡那抗性的2XYT固体培养基， 37°C孵箱培养12 14小时，挑选单菌落摇菌提质粒后酶切鉴定，获得阳性克隆。附图3.为 G2S0. 7-pCAG-ffPRE重组转移载体示意图。
4)含目的片段G2S0. 7转移载体的鉴定本发明所构建目的片段为汉滩病毒76-118株M片段G2部分和S片段0. 7部分的嵌合基因G2S0. 7，其大小约为2. 2kb。在完 成所有重组转移载体的改建后，用Nhe I和Not I双酶切鉴定含目的片段G2S0. 7的转移载 体。附图4.为G2S0. 7-pCAG、G2S0. 7-WPRE、G2S0. 7-pCAG-ffPRE重组转移载体酶切鉴定结
果 ο5)重组腺病毒DNA构建、鉴定及腺病毒包装将上述构建成功的转移载体和腺病 毒质粒分别用PI-Sce I和I-Ceu I双酶切，胶回收目的片段和载体，T4连接酶14°C连接过 夜，连接产物转化(JM109感受态)后涂布含氨苄抗性的2XYT固体培养基，37°C孵箱培养 12 14小时，挑选单菌落摇菌提质粒后酶切鉴定，获得阳性克隆。将重组腺病毒DNA用Pac I酶单切以线性化质粒，转染HEK293细胞，待出现明显CPE (Cytopathic Effect,细胞病变) 后收细胞，离心后将沉淀重悬于高压灭菌的PBS。反复冻融该沉淀3次后离心收集上清，即 为重组腺病毒。附图 5.为 Ad-G2S0. 7-pCAG、Ad-G2S0. 7-WPRE、Ad_G2S0. 7-pCAG-ffPRE 双酶 切鉴定结果。6)不同重组腺病毒融合蛋白表达水平的比较测定重组腺病毒滴度(具体方法参 ICLONTECH Adeno-x Rapid Titer Kit, Cat. No. 631028)。以 lOOpfu/cell 的 MOI 感染 293细胞，同时感染本申请人前期包装的Ad-G2S0. 7腺病毒作为对照，48小时后免疫荧光检 测目的蛋白的表达。可观察到细胞膜上的特异性荧光，其中改建转移载体重组腺病毒的荧 光显著，尤以 Ad-G2S0. 7-pCAG 组最为明显，Ad_G2S0. 7-pCAG-ffPRE 次之。Western blot 检 测目的蛋白的表达，以相同的MOI感染293细胞，48小时后收样并测定蛋白含量，确保每孔 上样量相同。可观察到目的蛋白的特异性表达，其中改建转移载体重组腺病毒的目的蛋白 特异条带比较显著，尤以Ad-G2S0. 7-pCAG组表达最为明显，Ad-G2S0. 7_pCAG_WPRE次之。利 用ELISA检测蛋白表达水平，包被本申请人制备针对融合蛋白的特异性单抗1A8，检测抗体 为出血热抗原免疫兔血清，得到结果与上述结果相符。附图6.为不同重组腺病毒融合蛋白 G2S0. 7表达水平的免疫荧光检测结果；附图7.为融合蛋白G2S0. 7在不同重组腺病毒中表 达的Western blot结果。序列表<110>中国人民解放军第四军医大学<120>用于提高汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7表达的腺病毒高表达载体<160>3<210>1<211>7456<212>DNA<213>Artificial<400>1taactataac ggtcctaagg tagcgaaagc tcagatctgg atctcccgat cccctatggt 60cgactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtatctg ctccctgctt 120gtgtgttgga ggtcgctgag tagtgcgcga gcaaaattta agctacaaca aggcaaggct 180tgaccgacaa ttgtcgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt 240cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 300
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权利要求
一种用于提高汉坦病毒融合蛋白G2S0.7表达的腺病毒高表达载体，对含嵌合基因G2S0.7的腺病毒转移载体G2S0.7-pShuttle进行改建，将其CMV启动子替换为CAG启动子/增强子，得到含CAG启动子/增强子的高表达汉坦病毒融合蛋白G2S0.7的腺病毒重组转移载体，命名为G2S0.7-pCAG，其全基因序列为SEQ ID NO1所示。
2.一种用于提高汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7表达的腺病毒高表达载体，对含嵌合基因 G2S0. 7的腺病毒转移载体G2S0. 7-pShuttle进行改建，在其3，端插入WPRE转录调控元件， 得到含WPRE调控元件的高表达汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7的腺病毒重组转移载体，命名为 G2S0. 7-WPRE，其全基因序列为SEQ ID NO 2所示。
3.一种用于提高汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7表达的腺病毒高表达载体，对含嵌合基因 G2S0. 7的腺病毒转移载体G2S0. 7-pShuttle进行改建，将其CMV启动子替换为CAG启动子 /增强子，并在其3，端插入WPRE转录调控元件，得到含CAG启动子/增强子和WPRE调控元 件的高表达汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7的腺病毒重组转移载体，命名为G2S0. 7-pCAG-ffPRE, 其全基因序列为SEQ ID NO 3所示。
全文摘要
本发明涉及腺病毒转移载体的改建，特别是对含肾综合征出血热(HFRS)致病原——汉坦病毒(HV)的嵌合基因G2S0.7的pShuttle转移载体进行改建，用于提高融合蛋白G2S0.7的表达。利用基因重组技术，将含嵌合基因G2S0.7的腺病毒转移载体G2S0.7-pShuttle进行改建，包括将其CMV启动子替换为CAG启动子/增强子；或在其3’端插入WPRE转录调控元件；或替换启动子并插入WPRE调控元件。用本发明分别表达汉坦病毒融合蛋白G2S0.7，比较各组重组腺病毒中外源蛋白的表达水平。结果显示本发明与原转移载体pShuttle相比，均能有效提高融合蛋白G2S0.7的表达，且以替换启动子组效果最明显。
文档编号C12N15/861GK101812479SQ20091025456
公开日2010年8月25日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者吴兴安, 张芳琳, 徐志凯, 李凯, 李璞媛, 白文涛, 胡刚 申请人:中国人民解放军第四军医大学