专利名称：：一种发酵制备丁二酸的方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及一种利用混合碱调节pH发酵制备丁二酸的方法。
背景技术：
：丁二酸，又名琥珀酸，是一种二元羧酸，作为重要的C4平台化合物，广泛应用于食品、医药、香料、洗涤剂、精细化工产品、表面活性剂生物可降解材料等方面。丁二酸传统的生产方法是以石油为原料用化学法进行炼制合成。而随着石油资源日益枯竭，微生物发酵法生产丁二酸以其环境友好性、可利用废弃的生物质资源、能够固定温室气体(A等优点，成为研究的热门课题，正在美国、日本等国家深入地进行着。C02和pH值是影响微生物菌体生长和其丁二酸产量的关键因素。C02在菌体的生长代谢过程中作为碳源被菌体利用，合成目的产物丁二酸。而环境pH值的改变会引起菌体内外部化学环境和酶活力的变化，从而对细胞代谢产生影响。pH值还可以影响C02的溶解水平，以及HC(V、C032—的解离平衡，进而影响丁二酸的合成。所以在微生物发酵产丁二酸的过程中，调节适宜的PH水平并且选择合适的调节方式对提高菌体的代谢活性和产酸能力具有重要作用。此外，在发酵过程中，有机酸的积累会导致pH下降，也需要添加pH调节剂来维持环境的中性水平。对于产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)而言，其发酵产丁二酸的最适pH在6.67.0之间。US5573931报道，MgC03是较好的中和剂，能呈现出较好的调节能力，比如在发酵培养基中添加MgC03固体，能够将发酵体系的pH值维持在适宜的水平，使菌体在发酵过程中表现出较高的代谢活性；但是，MgC03成本较高，消耗量较大，还会进一步增加了下游产品分离提取的难度，其实际上不利于丁二酸生物法的工业生产。
发明内容本发明的技术目的在于提供一种利用发酵制备丁二酸的新方法，使得该方法可以通过选择合适的PH调节剂、制定合理的调节策略来优化生产工艺，降低生物制备丁二酸的生产成本。本发明的技术目的是通过下面的技术方案实现的—种发酵制备丁二酸的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵产酸三步骤，其特征在于在厌氧发酵产酸的步骤中添加两种碱性中和剂的混合物，并调节发酵体系的pH值为6.67.0。其中，所述的两种碱性中和剂的混合物是氨水、NaOH、Na2C03、NaHC03、Ca(0H)2、CaC03、Mg(OH)2中的任意两两组合的混合物；进一步，这些组合中最佳组合是(1)氨水、Mg(0H)2;(2)Na0H、Mg(OH)2;(3)Na2C03、Mg(0H)2;(4)NaHC03、Mg(0H)2;(5)Ca(0H)2、Mg(0H)2;(6)CaC03、Mg(0H)2。其中，组合的两种碱性中和剂的质量配比为i:33:i。本发明的有益效果在于1、本发明利用现有技术的多种单一的碱性中和剂调节pH值发酵制备丁二酸，从而筛选出碱性较强并有利于发酵的碱性中和剂；将筛选到的碱性中和剂进行了组合用于调节pH值发酵制备丁二酸，并确定了混合碱的最佳比例，使得生产的丁二酸在一个较高的水平；2、本发明不仅利用一些了相对廉价的碱性中和剂，而且可以基本达到利用碱式MgC03作为唯一碱式化合物调节pH时的丁二酸生产水平。因此，利用混合碱调节pH值的方法来优化生产工艺，降低了生物制备丁二酸的生产成本，减小了下游产品分离提取的难度，提高了经济效益，有利于丁二酸生物法的工业制备；3、因Mg2+对产琥珀酸放线杆菌代谢途径中的关键酶有促进作用，虽然利用碱式MgC03作为唯一碱性中和剂调节pH时丁二酸的生产水平最高，但是由于使用碱式MgC03的成本较高，而Mg(0H)2能提供Mg"，但是其碱性较差，因此本发明确定混合碱中成分之一为Mg(OH^，再选择其他一种碱性较强的中和剂与之混合，实现了同样优秀的技术效果。图1为采用氨水调节pH发酵制备丁二酸的过程图图2为分别采用(a)Ca(0H)2和(b)CaC03调节pH发酵制备丁二酸的过程图图3为分别采用(a)NaOH(b)Na2C03和(c)NaHC03调节pH发酵制备丁二酸的过程图图4为采用Mg(OH)2调节pH发酵制备丁二酸的过程图图5为利用不同比例的Na2C03和Mg(OH)2混合调节pH对发酵制备丁二酸结果的影响图6为利用不同比例的NaOH和Mg(OH)2混合调节pH对发酵制备丁二酸结果的影响图7为采用MgC03调节pH发酵制备丁二酸的过程图具体实施例方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。实施例1本发明所述的制备丁二酸的方法可以使用现有技术中任何厌氧发酵产丁二酸的微生物菌种。本实施例所采用的产丁二酸的微生物菌种为产琥珀酸放线杆菌NJ113(ActinobacillussuccinogenesNJ113)，该菌已申请专利并获得授权，专利授权公告号为CN100537744C。本发明所述的发酵培养基可以使用现有技术中任何厌氧发酵产丁二酸的发酵培养基。本实施例所采用的培养基为每升体积培养基含葡萄糖(分开灭菌)50100g，酵母粉15g，玉米浆15mL，无水乙酸钠1.36g，NaCllg，K2HP043g，MgCl20.2g，CaCl20.2g。本发明所述的发酵微生物菌种制备丁二酸的方法可以是现有技术中任意的厌氧发酵制备方法，而这些方法一般都包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵产酸三步骤。本实施的制备步骤为(1)菌种活化菌种活化的斜面培养基为pH6.08.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的固体斜面培养基，斜面培养时将菌株在斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，培养箱含有N2、C02和H2的混合气体，温度为3040°C，活化培养2448h，用于种子培养基接种和菌株保存；(2)种子培养向100mL血清瓶中加入种子培养基为2080mL，通入含有N2和C02混合气，11512rC灭菌1530min，冷却后接入斜面培养菌株，培养温度为3040°C，摇床转速100200r/min，培养时间为1016h，用于发酵培养基接种；(3)5L发酵罐发酵培养5L发酵罐中发酵培养基体积为24L，接种量为37%(v/v)，温度为354(TC，发酵罐通入含有N2和C02混合气，以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速在100300rpm，发酵过程分别采用碱性中和剂包括氨水、NaOH、Na2C03、NaHC03、Ca(OH)2、CaC03、Mg(OH)2控制pH在6.67.0，发酵时间为3048h，分离提取丁二酸。分析方法HPLC系统高效液相色谱仪WatersHPLC2010工作站；色谱柱Prevailorganicacidcol醫250mmX4.6mm;紫外检测波长215nm;流速lmL/min，进量20iiL，流动相25mmol/LKH2P04，pH2.5;柱温室温。重蒸水配制不同浓度的有机酸(丁二酸(Fluka)、乙酸(Sigma)、甲酸(Fluka)、乳酸(Fluka))标准溶液，根据峰面积与有机酸标准溶液的浓度关系制作标准曲线。发酵样品经离心稀释后根据峰面积计算各有机酸含量。本实施例中，在产丁二酸的步骤中单独添加碱性中和剂的方法为添加氨水作为碱性中和剂调节pH值的方法。在发酵罐发酵过程中通过补加氨水，调节发酵体系的pH在6.67.0之间，发酵结果如图1所示。发酵液中NH/对细胞生长的抑制作用较为强烈，菌体对糖的利用能力较低，导致大量的葡萄糖剩余。至发酵结束，丁二酸质量浓度仅23.5g/L。细胞膜对NH/有较高的通透性，NH/的渗入会造成胞内pH水平发生变化，细胞需要更多的能量将NH/泵出，可见，环境中较高NH/浓度会降低细胞对能量的利用效率。当能量供给不足时，受胞内NH/的影响，胞内的pH发生较大变化，影响细胞无法正常的生长代谢，最终导致死亡。实施例2本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，仅改变产丁二酸步骤中的单独添加碱性中和剂的方法为分别添加Ca(OH)2和CaC03作为碱性中和剂调节pH值的方法。在发酵罐中分别采用Ca(0H)2、CaC03分别调节pH进行发酵，结果见图2所示。采用Ca(OH)2调节，菌体几乎不生长，丁二酸质量浓度小于5g/L(图2-a)。采用事先添加CaC03固体调节pH发酵，菌体的生长比Ca(0H)2调节发酵时稍好，但仍受到明显的抑制。CaC(^的溶解能力较差，不能将PH维持在适合菌体生长的水平，发酵过程中pH不断降低，至发酵结束，pH为5.6(图2-b)，丁二酸产量仅为17.5g/L。较高浓度的Ca2+可以改变细胞膜正常的流动性和通透性，导致菌体不能进行正常的胞内外物质能量传递，以致无法正常生长代谢。实施例3本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，仅改变产丁二酸步骤中的单独添加碱性中和剂的方法为分别添加NaOH、Na2C03、NaHC03作为碱性中和剂调节pH值的方法。在发酵罐中分别采用流加NaOH、Na2C03、NaHC03的方式调节pH，发酵结果如图3所示。随着Na+在发酵液中的不断积累，发酵中后期菌体絮凝现象严重，菌体0D66。呈明显下降趋势，耗糖速率也逐渐变缓。NaOH与Na2C03、NaHC03相比，至发酵结束，葡萄糖剩余量较多，丁二酸质量浓度为43.5g/L(图3-a)。Na2C03、NaHC03能够提供额外的C032—、HC03—，有利于菌体合成丁二酸，但是溶解性和碱性较低，流加过程对发酵液的稀释作用较大，以NaHC03尤为严重，虽然无葡萄糖剩余，但是丁二酸质量浓度只有37.8g/L(图3-b)。采用Na2C03调节，有少量残糖，丁二酸质量浓度为39.9g/L(图3-c)。在细胞的代谢过程中，Na+有十分重要的作用，它能够影响跨膜pH梯度、细胞渗透压以及胞内pH调控水平。采用NaOH、Na2C03调节，发酵液中累积的Na+浓度分别达2.lmo1/L、l.9mol/L，采用NaHC03调节，Na+为1.5mol/L。Na+过度积累造成高渗环境，对菌体有较大的负面作用，菌体不能正常的代谢产酸，产酸能力骤降。发酵中后期，Na+的大量积累可能是造成菌体0D66。急剧下降、产酸能力降低的主要原因。实施例4本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，仅改变产丁二酸步骤中的单独添加碱性中和剂的方法为分别添加Mg(OH)2、MgC03作为碱性中和剂调节pH值的方法。Mg2+是许多酶的激活剂，在丁二酸合成途径中关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶就需要Mg2+作为辅助因子。图4和图7是分别采用Mg(0H)2、MgC03调节pH的发酵结果。Mg2+在发酵液中的积累对菌体生长没有明显的抑制作用，发酵中后期，0D66。下降缓慢，菌体仍有较高的代谢活性。至发酵结束，葡萄糖能够充分被菌体利用，丁二酸浓度高达57.4g/L(图7)，发酵效果最好。采用Mg(OH)2调节时，由于Mg(OH)2对发酵液稀释作用明显，丁二酸质量浓度仅有42.9g/L(图4)。实施例5本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，仅改变产丁二酸步骤中的添加混合碱性中和剂的方法为利用氨水和Mg(0H)2作为混合碱性中和齐U，并以不同的混合比例调节pH值。采用氨水和Mg(0H)2以不同质量比例混合(3:i、2:i、i:i、i:2、i:3)调节pH，控制混合碱中0H—浓度为6mol/L(按lmol氨水提供lmol0H—计)。发酵结果如表1所示。表1不同比例的氨水和Mg(OH)2混合调节pH发酵结果对比氨水:Mg(OH)2(质量比)细胞干重(g/L)丁二酸(g/L)甲酸(g/L)乙酸(g/L)3:12.926.22.26.52:13.628.53.17.11:13.831.33.37.31:24.333.53.67.81:34.738.63.98.2当混合碱中氨水比例越高，由于微生物耐NH/能力较差，因此发酵效果也越差。随着Mg(OH^添加量的不断增加，残糖量逐渐减少，丁二酸质量浓度逐渐增大。但是由于Mg(0H)2溶解度不高，因此调节pH补进去的体积较大，使得丁二酸的浓度有所下降。实施例6本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，仅改变产丁二酸步骤中的添加混合碱性中和剂的方法为利用NaHC03和Mg(OH)2作为混合碱性中和齐U，并以不同的混合比例调节pH值。采用NaHC03和Mg(0H)2以不同质量比例混合(3:1、2:1、1:1、1:2、1:3)调节pH，控制混合碱中OH—浓度为6mol/L(按lmolNaHC03提供2molOH—计)。发酵结果如表2所示。表2不同比例的NaHC03和Mg(OH)2混合调节pH发酵结果对比NaHC03:Mg(OH)2(质量比)细胞干重(g/L)丁二酸(g/L)甲酸(g/L)乙酸(g/L)3:13.538.53.27.82:13.740.13.57.91:13.941.64.08.31:24.844.94.58.81:35.549.74.69.2虽然利用NaHC03调节微生物发酵制备丁二酸时效果较好，但是由于NaHC03溶解度不高且易结晶，因此调节pH时补进去的体积较大，使得丁二酸的浓度有所下降。实施例7本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，仅改变产丁二酸步骤中的添加混合碱性中和剂的方法为利用Na2C03和Mg(0H)2作为混合碱性中和齐U，并以不同的混合比例调节pH值。采用Na2CO^PMg(OH)2以不同质量比例混合(3:1、2:1、1:1、1:2、1:3)调节pH，控制混合碱中OH—浓度为6mol/L(按lmolNa2C03提供2molOH—计)。发酵结果如图5所示。随着Mg(OH、添加量的不断增加，残糖量逐渐减少，丁二酸质量浓度逐渐增大。当Na^03和Mg(0H、质量比达到1:1时，葡萄糖无剩余，丁二酸质量浓度最高，为55.4g/L，发酵液中Na+浓度0.95mol/L，比采用NaHC03调节的Na+浓度降低了36.7%。继续增加混合碱中Mg(0H)2添加量，葡萄糖仍然能够消耗完全，但是丁二酸的浓度有所下降。实施例8本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，仅改变产丁二酸步骤中的添加混合碱性中和剂的方法为利用NaOH和Mg(OH)2作为混合碱性中和齐U，并以不同的混合比例调节pH值。采用NaOH和Mg(OH)2混合溶液作为中和剂调节发酵过程中pH，NaOH和Mg(OH)2质量比分别为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，控制混合碱中OH—浓度为6mol/L(按lmolMg(OH)2提供2molOH—计)，结果如图6所示。随着混合碱液中NaOH添加比例降低，葡萄糖的剩余量逐渐减少。当NaOH和Mg(OHh的质量比为1:1时，无葡萄糖剩余，丁二酸的质量浓度可达69.8g/L，发酵液中Na+浓度0.86mol/L，与采用NaHC03调节的Na+浓度相比，降低了42.6%。继续减少混合碱中NaOH的添加比例，菌体仍然能够将葡萄糖全部耗完，但是丁二酸的浓度呈现下降趋势。含Na+碱性调节剂与含Mg2+碱性调节剂混合至适当比例，可以缓解Na+的过量积累，也可以降低Mg(OH)2对发酵液的稀释程度。与Na2C03和Mg(OH)2混合调节pH发酵的最佳结果相比，采用NaOH和Mg(OH)2以1:1混合调节pH发酵的效果更好。实施例9本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，仅改变产丁二酸步骤中的添加混合碱性中和剂的方法为利用Ca(OH)2和Mg(OH)2作为混合碱性中和齐U，并以不同的混合比例调节pH值。采用Ca(0H)2和Mg(0H)2以不同质量比例混合(3:1、2:1、1:1、1:2、1:3)调节pH，控制混合碱中OH—浓度为6mol/L(按lmolCa(OH)2提供2molOH—计)。发酵结果如表3所示。表3不同比例的Ca(OH)2和Mg(OH)2混合调节pH发酵结果对比<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由于Ca(OH)2溶解度很低，且较高浓度的Ca2+可以改变细胞膜正常的流动性和通透性，导致菌体不能进行正常的胞内外物质能量传递，以致无法正常生长代谢。因此利用Ca(OH)2和Mg(OH)2作为混合碱性中和剂调节pH值时，丁二酸的浓度很低。实施例10本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，仅改变产丁二酸步骤中的添加混合碱性中和剂的方法为利用CaC03和Mg(OH)2作为混合碱性中和齐U，并以不同的混合比例调节pH值。采用CaC03和Mg(0H)2以不同质量比例混合(3:1、2:1、1:1、1:2、1:3)调节pH，控制混合碱中OH—浓度为6mol/L(按lmolCaC03提供2molOH—计)。发酵结果如表4所示。表4不同比例的CaC03和Mg(OH)2混合调节pH发酵结果对比<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由于CaC03溶解度很低，且较高浓度的C^+可以改变细胞膜正常的流动性和通透性，导致菌体不能进行正常的胞内外物质能量传递，以致无法正常生长代谢。因此利用CaC03和Mg(OH)2作为混合碱性中和剂调节pH值时，丁二酸的浓度较低。实施例11本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，发酵培养基中初始葡萄糖浓度均为100g/L，分别以实施例510的碱性中和剂最佳混合比例调节pH值，并与单独使用碳酸镁调节PH发酵结果进行对比，如表5所示。表5利用两种碱性中和剂混合调节pH与单独使用碳酸镁调节pH发酵结果对比<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表5可以得到，只有采用NaOH和Mg(OH)2混合溶液作为中和剂并且质量比为1:1时，调节发酵过程中pH，基本无葡萄糖剩余，丁二酸的质量浓度可达69.8g/L，与单独使用碳酸镁调节PH发酵时丁二酸的生产水平相当，因此利用廉价的NaOH和Mg(OH)2混合中和剂可以完全替代昂贵的碳酸镁中和剂，从而降低丁二酸的生产成本。权利要求一种发酵制备丁二酸的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵产酸三步骤，其特征在于在微生物发酵生产丁二酸的步骤中外源添加两种碱性中和剂的混合物，并调节发酵体系的pH值为6.6～7.0。2.根据权利要求1所述的发酵制备丁二酸的方法，其特征在于所述的两种碱性中和剂的混合物是氨水、NaOH、Na2C03、NaHC03、Ca(0H)2、CaC03、Mg(0H)2中的任意两两组合的混合物。3.根据权利要求2所述的发酵制备丁二酸的方法，其特征在于所述的两种碱性中和剂的混合物是氨水和Mg(0H)2的混合物。4.根据权利要求2所述的发酵制备丁二酸的方法，其特征在于所述的两种碱性中和剂的混合物是NaOH和Mg(OH)2的混合物。5.根据权利要求2所述的发酵制备丁二酸的方法，其特征在于所述的两种碱性中和剂的混合物是Na2C03和Mg(OH)2的混合物。6.根据权利要求2所述的发酵制备丁二酸的方法，其特征在于所述的两种碱性中和剂的混合物是NaHC03和Mg(OH)2的混合物。7.根据权利要求2所述的发酵制备丁二酸的方法，其特征在于所述的两种碱性中和剂的混合物是Ca(OH)2和Mg(OH)2的混合物。8.根据权利要求2所述的发酵制备丁二酸的方法，其特征在于所述的两种碱性中和剂的混合物是CaC03和Mg(0H)2的混合物。9.根据权利要求1至8之一所述的发酵制备丁二酸的方法，其特征在于所述的两种碱性中和剂的质量配比为l:33:1。全文摘要本发明涉及一种发酵制备丁二酸的新方法，主要通过在微生物发酵生产丁二酸的过程中添加两种混合的碱性化合物来替代单一的碱性化合物维持发酵体系在一个合适的pH值；调节混合碱的比例使得生产的丁二酸在一个较高的水平。这不仅可以利用一些廉价的碱性化合物，而且可以基本达到利用碱式碳酸镁作为唯一碱式化合物调节pH时的丁二酸生产水平。因此，利用混合碱调节pH策略来优化生产工艺，降低了生物制备丁二酸的生产成本，减小了下游产品分离提取的难度，提高了经济效益，有利于丁二酸生物法的工业制备。文档编号C12P7/46GK101712970SQ20091026405公开日2010年5月26日申请日期2009年12月29日优先权日2009年12月29日发明者姜岷,李建,杨卓娜,欧阳平凯,郑晓宇,陈可泉,韦萍申请人:南京工业大学