专利名称：：一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化生产烟酸中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物化工领域，涉及一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化生产烟酸中的应用。
背景技术：
：烟酸又称作3-吡啶甲酸、吡啶-3-甲酸、尼可丁酸等，与烟酰胺同属B族维生素，统称维生素PP，分子式C6H5N02，耐热，能升华。该化合物是一种水溶性维生素，为人体必需的13种维生素之一；在人体内转化为烟酰胺，是辅酶I和辅酶II的组成部分，参与体内脂质代谢，组织呼吸的氧化过程和糖类无氧分解过程。可用于抗糙皮病、作血扩张药、食品饲料的添加剂等；亦可作为医药中间体，用于异烟肼、烟酰胺、尼可刹及烟酸肌醇酯等的生产。烟酸的生产可以分为化学法和生物法，目前工业生产上应用较多的仍然为化学法。如专利CN1296004A公开了以3-甲基吡啶为原料，在装有催化剂的管式反应器中与空气，水蒸气进行氧化反应得到烟酸粗产品，经过精制后可得到纯度为99.5%的烟酸。但该方法对活性催化剂的制备及设备提出较高要求，操作较繁琐。德国底古萨_胡尔斯股份公司的专利CN1247190A中，采用含钒的二氧化钛载体催化剂，在反应器内直接气相氧化制备得烟酸，然后在产率^90X时于235t:下凝华分离。瑞士隆萨股份公司的专利CN1272321C中中报道，将氨直接通入3-甲基吡啶催化氧化后含烟酸的粗水溶液中，后将反应得到的烟酸铵溶液进行喷雾干燥得烟酸。清华紫光公司的专利CN1141288A中报道了用硫酸与3-甲基吡啶反应制得甲基吡啶硫酸盐，然后用硝酸氧化，最后用碱中和制得烟酸，原料收率为90%左右。昆明理工大学蒋丽红等人的专利CN101289420A中公开了一种以二氧化硒作为氧化剂，在吡啶溶剂中直接液相氧化3-甲基吡啶合成烟酸的方法，选择性在98.5%以上，但产品收率只有4050%左右。以上专利中所公开的烟酸制备方法均以3-甲基吡啶为起始原料，经过气相或液相化学氧化后制得粗烟酸。该化学氧化过程必须具备特定的高温高压环境或者采用强酸或强氧化剂处理，反应选择性不高，副产物多，产品的收率不高，在工业生产中能耗高，环境污染大。此外，该类反应中需采用比较昂贵的催化剂，可再生性差。浙江大学的吕秀阳等人在专利CN101265230A中公开了一种在近临界水介质中直接高温水解3-氰基吡啶为烟酸的方法。该发明解决了烟酸制备中酸、碱催化水解的污染难题，过程简单，绿色，产物纯度高。该技术的不足之处在于该反应同样需要高温高压环境，对设备的安全性能和抗腐蚀性能提出较高要求。同时，近临界水介质中的化学反应目前尚处于研究探索阶段，离大工业化生产仍有相当大的距离。综上所言，化学氧化水解法或在近临界水介质中的水解法制烟酸皆存在诸多不足。相对而言，生物催化法具有底物选择性高，反应条件温和，环境友好等优点。此外，生物催化剂易放大制备，成本低，适合于大规模工业化生产应用，为烟酸的工业化生产提供了一条行之有效的新路径。而生物催化法的关键就在于找到酶活高、稳定性好、适应性强的菌种。
发明内容本发明的目的是克服上述现有技术的不足，提供一株新的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)。本发明的另一目的是提供该细菌在生物催化生产烟酸中的应用。本发明的技术方案是—株枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.3242，保藏日期2009年8月19日。枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)具有以下微生物学特征1.形态学特征在固体平板培养基上培养48小时后出现圆形光滑的单菌落，灰白色，不透明，边缘光滑，表面湿润，整个菌落凸起，易挑取；镜检成杆状，大小长为(0.50.8um)X(1.52.5um)，芽孢中生。2.培养学特征本菌株在以下3种培养基中3(TC下培养48小时后的培养特征见表1。表1.枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)在3种培养基上的培养特征培养基名称菌落颜色及形状营养琼脂菌落凸起，表面湿润，边缘光滑，不透明，呈乳白色至灰白色，无可溶性色素营养肉汤生长旺盛，灰黄色，浑浊蛋白胨査氏琼脂菌落平坦而厚，表面湿润，边缘光滑，不透明，灰黄色，无可溶性色素3.生理生化特征(见表2)表2.草芽孢杆菌KR2(CGMCCN0.3242)生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注表中"+"表示阳性，"-"表示阴性。枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)的培养方法如下(1)种子液制备先进行斜面种子制备，将菌种接种到灭过菌的斜面后在2035t:下培养37天，刮取35环菌种接种到装有已灭菌的液体培养基的三角瓶中，在温度为2035"，转速为100300rpm下振荡培养3072小时，即可作为一级种子。同样培养条件下，将一级种子按310%(%:v/v)的接种量转接到第二批装有同样培养基的三角瓶中，同样条件下培养3072小时后作为二级种子。(2)扩大培养将二级种子以310%(%:v/v)的接种量接种到7300L发酵罐中进行发酵培养，培养条件为装液量6080%(%:v/v)，通气量0.11(v/v.min)，罐压0.020.05MPa，温度2035。C，转速:100400rpm，发酵时间30120小时。所涉及的培养基成分如下斜面培养基(g/L):葡萄糖1030，酵母膏210，蛋白胨210，氯化钠15，磷酸二氢钾0.53，磷酸氢二钾0.53，硫酸镁0.22，琼脂1520，pH:59。—级、二级液体种子培养基(g/L):葡萄糖1030，酵母膏210，蛋白胨2IO，氯化钠15，磷酸二氢钾0.53，磷酸氢二钾0.53，硫酸镁0.22，己内酰胺0.5IO，异戊腈0.15，氯化钴550ppm，pH:59。发酵培养基(g/L):葡萄糖1050，酵母膏210，蛋白胨210，氯化钠15，磷酸二氢钾0.53，磷酸氢二钾0.53，硫酸镁0.22，己内酰胺0.510，异戊腈0.15，氯化钴550ppm，pH:59。枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)在生物催化生产烟酸中的应用。所述的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)在生物催化生产烟酸中应用的具体方法是以3-氰基吡啶为底物，以枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)为生物催化剂，于535°C，100300rpm反应1596小时得到烟酸。所述的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)制备成絮凝细胞液的形式后参与所述的生物催化反应，反应体系中絮凝细胞液的加入量为装液量的515%(%:v/v)。所述的生物催化反应在反应釜中进行，反应釜的装液体积为5070%(%:v/v)。3-氰基吡啶的起始浓度为装液量的0.55%(%:g/100mL)，优选15%，采用多次间隙补料方式使3-氰基吡啶的最终累积浓度不超过30%(%:g/100mL)。在温度为535。C，搅拌转速为100300rpm下催化水解1596小时。当底物浓度趋向于零时即可结束反应，过滤出絮凝菌团继续套用到下批反应釜中去，直到该催化剂活性下降为不到原来的1/3为止。反应结束后向转化液中重新添加装液量0.10.5%。(％。g/1000mL)的絮凝剂，搅匀，静置1030min后过滤。滤液再离心或采用0.20.5um膜超滤后取滤液浓縮，之后于04t:下冷冻结晶、308(TC下真空干燥得纯度在98%以上的烟酸。其中，絮凝细胞液的制备方法为将发酵罐内的发酵液于25003500rpm下离心10分钟，弃上清，所得沉淀用去离子水冲洗一遍，25003500rpm下再离心10分钟，弃上清，得沉淀湿菌体。将湿菌体用去离子水冲洗下来后搅匀制得细胞湿重浓度为1200g/L的菌悬液。在535。C，pH59的条件下向菌悬液中添加0.115%。(％。g/1000mL)比例的絮凝齐U，200rpm下搅拌10min制得絮凝细胞液。添加的絮凝剂可以为壳聚糖，甲壳素，聚谷氨酸，聚丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚乙烯亚胺等高分子絮凝剂，优选壳聚糖，添加量优选为0.55%0(%0:g/1000mL)。本发明中所涉及的过滤、浓縮、冷冻结晶等均为本领域技术人员所公知的普通技术。本发明的有益效果1、本发明所提供的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)作为3-氰基吡啶生产烟酸的生物催化剂，3-氰基吡啶的收率超过90%，并且催化性能稳定。2、本发明中采用枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)将3_氰基吡啶催化水解成烟酸，是一种新型烟酸生产方法，所得烟酸的纯度在98%以上。本发明工艺简单，选择性好，反应条件温和，能耗低，安全环保，具有极大的工业应用潜力。3、将湿菌体制成絮凝化细胞液后参与催化反应，后期分离过程简单，易于操作，产品纯度高，设备投资少，有效的提高了分离效率。同时，絮凝剂的使用有效的保护了细胞免受高浓度底物和产物的抑制作用，有利于工业化放大生产。反应后的絮凝菌团过滤后可套用到下一批反应中，进一步节约了成本。涉及的生物材料样品的保藏本发明所要求保护的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KR2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO.3242，保藏日期为2009年8月19日。具体实施例方式实施例1菌种筛选本发明所涉及的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)是本公司生物化工研究组成员从受腈类化合物污染达15年以上的农药厂土壤中筛选得到的，其筛选方法如下从南京第一农药厂污水池不同角度取污泥样100余批，分批富集培养后进行筛选和鉴定称取10克污泥，加无菌水50mL，用玻璃珠摇碎后取5mL悬浊液接种到45mL富集培养基中，放置3(TC摇床上，120rpm振荡培养3天。之后取该培养液进行梯度稀释，取10一6、10—7、10—8的梯度稀释液涂布到含初筛固体培养基的平板上，置3(TC恒温培养箱培养36天。挑取生长出的单菌落接种到新的初筛固体培养基上扩大培养，培养条件同上。待菌长出后刮去35环接种到液体复筛培养基中进行培养。在3(TC摇床上120rpm下振荡培养3天，取15mL培养液3000rpm下离心10min，倒去上清液后用等体积的生理盐水冲洗沉淀菌体，继续离心得菌体。将所得菌体添加到含1%(%:g/100mL)亚氨基二乙腈的PBS缓冲液中转化2小时，反应体系中菌体浓度为0.5g/L。取5mL转化液3000rpm下离心10min得上清液，HPLC法分析上清液。如果转化液含有亚氨基二乙酸则说明该菌对亚氨基二乙腈具有转化能力，选择其中亚氨基二乙酸转化率最高的一株，经按《简明伯杰细菌鉴定手册》第八版进行鉴定为枯草芽孢杆菌。将该株枯草芽孢杆菌命名为KR2，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCCNO.3242，保藏日期为2009年8月19日。本发明中的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCN0.3242)能同时在分别以烟腈、丙烯腈、乳腈、羟基乙腈，亚氨基二乙腈为唯一氮源的固体初筛培养基上生长，底物范围广，降解腈类化合物能力强，适合用作本发明中烟酸的生物催化合成。筛选方法中的所述的液体富集培养基、固体初筛培养基、液体复筛培养基分别如下液体富集培养基(g/100mL):葡萄糖3，酵母膏0.5，蛋白胨0.5，氯化钠0.1，磷酸二氢钾0.l，磷酸氢二钾0.l，硫酸镁0.05，pH:7。固体初筛培养基(g/100mL):葡萄糖3，亚氨基二乙腈(或丙烯腈、或烟腈、或乳腈、或羟基乙腈)l，氯化钠0.l，磷酸二氢钾0.l，磷酸氢二钾0.l，硫酸镁0.05，琼脂2，pH:7。液体复筛培养基(g/100mL):葡萄糖3，酵母膏0.5，蛋白胨0.5，氯化钠0.1，磷酸二氢钾0.l，磷酸氢二钾0.l，硫酸镁0.05，尿素0.5，pH:7。实施例2游离细胞的制备在无菌超净工作台内用接种环刮取枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)斜面菌种3环，接种到一级液体种子培养基中(葡萄糖15，酵母膏5，蛋白胨5，氯化钠2，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钾l，硫酸镁0.5，己内酰胺5，异戊腈1，氯化钴10卯m，pH:7.0，单位g/U。在温度为25t:，转速为150rpm下振荡培养48小时即可得一级枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)种子液，将该一级种子液按照10%的接种量转接到装有同样成分已灭菌的培养基中继续进行培养，48小时后可得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)二级种子液。将枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)二级种子液按照10%的接种量接种到35L已灭菌的液体发酵培养基中，(葡萄糖30，酵母膏10，蛋白胨10，氯化钠2，磷酸二氢钾l，磷酸氢二钾l，硫酸镁0.5，异戊腈1，己内酰胺5，氯化钴10卯m，pH:7，单位g/L)，发酵罐体积为50L，采用通空气与搅拌联用的方式控制溶氧不低于10%，通气量0.2v/v.min，罐压0.03MPa，温度25。C，起始转速100rpm，发酵过程中根据发酵液的溶氧水平自动调节，最大转速不超过400rpm，发酵72小时后即可制得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)细胞发酵液。实施例3酶活测定本实施例采用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242的发酵液进行酶活的测定。酶活的定义在25t:下，lmL发酵液与1微克3-氰基吡啶催化反应1小时后生成的烟酸的微克数，该微克数即为总酶活力单位数。烟酸采用液相色谱法进行检测，检测参数为色谱柱CLC-ODS柱，150mmX6.OmmI.D;流动相乙腈/水/庚烷磺酸钠/三乙胺(50/450/0.8g/2ml)(pH3);流速1.2mL/min;柱温室温；检测波长UV268nm。在本发明条件下，每毫升发酵液中生物量最高可达47mg湿菌体，总酶活最高可达1050U。实施例4絮凝细胞液的制备取3L枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)发酵液3000rpm离心10min得沉淀菌体，用3L去离子水冲洗一遍后继续3000rpm离心10min，弃上清得沉淀湿菌体。枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)沉淀湿菌体称重后用去离子水将其冲洗下来制得浓度为35g/L的菌悬液。30。C下调菌悬液pH为7，向菌悬液中添加2。；(％。:g/1000mL)比例的壳聚糖，200rpm下磁力搅拌10min即可制得枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)的絮凝细胞液。实施例5烟酸的制备在50L反应釜中，先添加30L去离子水，调pH到7.0，温度为3(TC。向反应釜中添加3L制备好的絮凝细胞液，150rpm下搅拌均匀，加入0.6kg3-氰基吡啶。其余3-氰基吡啶采取间隙补加的方式添加进反应釜中，每隔10小时补加一次，每次补加0.6kg，最终底物添加量共3kg，反应40小时后检测到反应液中3-氰基吡啶含量基本为零，终止反应。向催化反应结束后的釜中添加装液量1%。(％。g/1000mL)的壳聚糖，搅拌10min后静置半小时后下料。将反应液放出后压滤，所得菌团继续套用到下批反应中。滤液再经0.45um膜超滤后进行浓縮，4t:下冷冻结晶，得到纯度为98.3%的烟酸3.287kg，收率达91.1%。实施例6其他反应条件保持与实施例4一致，仅改变催化剂的加入量。将催化反应过程中絮凝菌团的添加量由3L调整为4.5L，其他反应条件及底物最终添加量等均与实施例4保持一致。反应36小时后检测到反应液中3-氰基吡啶的浓度接近于零，结束反应后最终得到纯度为98.8%的烟酸3.405kg，收率达94.8%。实施例7其他反应条件保持与实施例4一致，仅改变底物的添加量。将每次补加3-氰基吡啶0.6kg调整为1.2kg，分5次补加，每次之间间隔10小时，最终底物累积添加量为6kg。反应50小时后检测到反应液中3-氰基吡啶的浓度接近于零，结束反应后最终得到纯度为99.1%的烟酸6.506kg，收率达90.9%。实施例8其他反应条件保持与实施例4一致，仅改变催化反应温度。将搅拌釜中反应液的温度由实施例4中的3(TC调整为l(TC，其余条件不变。反应48小时后检测到反应液中3-氰基吡啶的浓度为基本为零，结束反应后最终得到纯度为98.3%的烟酸3.378kg，收率达93.6%。实施例9本实施例主要考查枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)的遗传稳定性。将4。C冰箱中保藏的该枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)放置3(TC恒温培养箱中活化20分钟后取出接种到新鲜的斜面培养基中，之后放置3(TC恒温培养箱培养3天，待斜面上长出新的划线菌落后即为该枯草芽孢杆菌的子一代，命名为KR2-1;之后以KR2-1为出发菌种，以同样的方式进行接种传代，培养出新划线菌落后命名为子二代KR2-2;再以KR2-2为出发菌种，以同样的方式转接新斜面培养基，得子三代KR2-3。以此方式连续传代30次，分别得到KR2-4、KR2-5......KR2-30。斜面培养基(g/L):葡萄糖15，酵母膏5，蛋白胨2，氯化钠l，磷酸二氢钾0.5，磷酸氢二钾0.5，硫酸镁0.5，琼脂20，pH:7。挑选以上传代培养中所得到KR2-10、KR2-20、KR2-30三株子代，以原始KR2(CGMCCN0.3242)为对照，同时进行一级液体种子、二级液体种子的制备，操作方法和培养基均与实施例1中相同。之后进行游离细胞的制备，将所得的二级液体种子以10%的接种量接种到装有已灭菌发酵培养基的摇瓶中，每500mL容量的摇瓶最终装液量为100mL，接完种之后放置温度为25t:的恒温摇床上振荡培养3天，转速为150rpm。所述的发酵培养基与实施例1中相同。将以上所得的液体发酵液于3000rpm下冷冻离心10分钟，弃上清液后用等体积的生理盐水冲洗沉淀菌体一遍后继续离心10分钟等菌体，转速不变。将所得的沉淀菌体用pH为7的磷酸盐缓冲液制成35g/L的菌悬液后进行转化试验。转化试验在恒温摇床上进行，转化液置于摇瓶内，每500mL摇瓶最终装转化液的体积为100mL。底物烟腈的浓度为4%(X:g/100mL)，菌悬液的添加量为5%，转化温度为25°C，摇床转速200rpm，转化时间为10分钟。转化结束后添加5mol/L的盐酸中止酶活，之后将转化液3000rpm离心10分钟后取上清液检测。KR2、KR2-10、KR2-20、KR2-30四株菌所对应的转化液中烟酸的浓度分别为3.51%、3.43%、3.42%、3.36%(%:g/100mL)。以上结果可见，该枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)在传代30次后仍然保持着与亲代KR2菌几乎相当的转化率，具有很好的遗传稳定性。实施例10本实施例主要进行絮凝细胞套用的考察，其游离细胞的制备、絮凝细胞的制备、烟酸的制备方法都分别与实施例1、实施例3和实施例4保持一致。不同之处在于将第一批转化反应结束后的絮凝细胞菌团过滤出来，用等量的去离子水冲洗两遍，过滤后向絮凝细胞团中添加去离子水，使絮凝细胞混合液的体积达到3L，将此3L絮凝细胞液套用到下一批转化试验中继续反应。反应结束后以同样的方式继续制备相同体积的絮凝细胞液，再连续套用6次。其中转化液中底物烟腈的添加量与添加方式均与实施例4中相同，最终数据如表3所示。结果显示，该絮凝细胞在循环套用到第4次时烟酸的收率和纯度都出现明显下降。套用3次时烟酸的收率达到91.3%，纯度仍然保持在98%以上。因此，本专利中所述的絮凝细胞菌团以套用3次为佳。表3絮凝细胞循环套用后的转化数据<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本实施例中未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。权利要求一株枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.3242，保藏日期2009年8月19日。2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)在生物催化法合成烟酸中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用的具体方法为以3-氰基吡啶为底物，以枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)为生物催化剂，于温度为535°C，搅拌转速为100300rpm下进行催化水合反应得到烟酸。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的反应体系中底物3-氰基吡啶的起始浓度为0.55%，反应过程中采用间隙补料或流加的方式添加3-氰基吡啶，使3-氰基吡啶的最终累积浓度不超过30%。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于将所述的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)的游离细胞制备成絮凝化细胞液参与所述的反应，反应体系中絮凝细胞液的加入量为515%。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于制备所述的枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)絮凝细胞液所用的絮凝剂是壳聚糖、甲壳素、聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺，优选壳聚糖，絮凝剂添加量为0.115%。。7.根据权利要求3、5或6所述的应用，其特征在于所述生物催化反应结束后向转化液中重新添加0.10.5%。的絮凝剂，搅匀后静置，过滤出菌团，滤液经离心或采用0.20.5um膜超滤后浓縮，之后04。C下冷冻结晶、308(TC下真空干燥得纯度在98%以上的烟酸。全文摘要本发明属于生物化工领域，公布了一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化生产烟酸中的应用。本发明以3-氰基吡啶为底物，以枯草芽孢杆菌KR2(CGMCCNO.3242)为生物催化剂，于5～35℃，100～300rpm反应15～96小时得到烟酸，烟酸的最终收率超过90％，所得烟酸的纯度在98％以上。本发明的方法操作简单，反应条件温和，工艺适合规模化工业生产应用。文档编号C12P17/12GK101709283SQ20091026430公开日2010年5月19日申请日期2009年12月18日优先权日2009年12月18日发明者唐旺全,孔国平,杨寿海,杨玉林,顾福海申请人:南京第一农药集团有限公司