专利名称：一种用于核酸扩增的环形引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及聚合酶链式反应(PCR)中所用的核酸扩增引物的设计与应用技术，特别是 涉及应用在实时PCR反应中，尤其是在突变检测和稀有突变检测中的应用。
背景技术：
聚合酶链式反应(PCR)技术是一种简单快捷、高灵敏、特异的基因扩增方法，其过程 通常包括20-50个由变性、退火和延伸三步反应构成的循环。可以在1.5-3小时内特异地扩增 靶核酸序列至几百万倍。近年来，由于实时PCR仪的出现使普通PCR不再需要凝胶电泳分析， 从而不必PCR后操作，杜绝了PCR污染。因此实时PCR技术在临床上应用越来越广泛。实时荧 光PCR检测技术最早使用荧光染料，例如SYBR GREEN， EVE-GREEN，以指示PCR反应。随后， 实时荧光PCR检测技术中开始应用标记荧光的核酸探针，例如5'-核酸外切酶技术中使用的 T叫man探针、分子信标、荧光能量转移探针(相邻探针)、蝎子引物、点亮探针等。染料法 尽管简单，然而其无法识别非特异扩增，尤其是由于引物二聚体引起的非特扩增，因此在实 际应用中受到很大限制。探针法对扩增产物具有第二识别步骤，从而避免了非特异扩增，结 果更加可靠。不过，探针普遍存在设计复杂，合成成本高等缺点。这两类方法缺点的根源都 在于它们不能有效防止非特异扩增。
稀有突变是指大量野生型基因背景下的极少的突变基因，特别是单碱基突变的基因。一 般突变基因与野生型基因的比率小于1/1000。例如孕妇外周循环血中含有的微量胎儿突变基 因，肿瘤病人血液中或肿瘤组织内含有的少量肿瘤体细胞突变。能否准确检测这类稀有突变 对现有检测技术提出了挑战。
PCR方法用于突变检测的关键是根据目标基因顺序设计一对具有高严谨性的、与目标基 因DNA或RNA互补的引物。扩增阻碍突变系统(Amplification Regractory Mutation System, ARMS)技术于1989年建立，又称等位基因特异性PCR (Allele-specif ic PCR， AS-PCR)，也叫序列特异性引物PCR (PCR with Sequence Specific Primers, PCR-SSP)。 在众多突变检测方法中应用最为广泛。其基本构思是设计2条ARMS上游引物，共用l条下游引 物构成PCR反应体系。等位基因特异性碱基置于引物3'末端，这是因为耐热T叫DNA聚合酶缺 乏3'-5'外切校正活性，在PCR反应进行时，位于引物3'末端的特异性碱基分别结合于野生型 和突变型等位基因的位点，若此碱基对形成错配，DNA链延伸反应就会因为3'-5'-磷酸二酯键形成障碍而受阻。但是ARMS引物3'末端碱基对不同错配区分能力不同，因此对有些突变的 区分能力有限。 发明概要
本发明涉及使用一种用于核酸PC財广增的新式引物。该引物在设计思路上与前述的当前 引物根本不同，通过巧妙的设计将引物的特异性大大提高。此引物特异性高、不形成引物二 聚体、设计简单、易于合成，适合基因表达量的检测、SNP检测以及稀有突变检测。
本发明的引物包括两种， 一种是单扩增环形引物，可以用于基因的普通扩增；另一种是 具有双扩增功能的环形引物，特别适合突变检测系统，尤其是稀有突变检测体系。
本发明中涉及的单扩增环形引物技术是基于对靶核酸的直接杂交，该引物由于5端具有 与引物3端互补的序列，可以形成一个环形结构，环形结构易于打开，因此对耙序列的扩增 效率不受影响。针对突变序列的碱基可以是在引物3末端也可以在引物内部，成环序列的多 少可以根据序列不同而进行调整，从而可以调整引物对突变序列识别的特异性。
本发明中的双扩增环形引物在引物内部引入一端通用标签序列，标签序列和环形引物按 一定比例(标签序列一般为环形引物用量的10倍以上)，同时加入PC財广增体系，在PCR循环 的前2个循环，环形引物高特异地识别突变靶序列并进行初期扩增，从第3个循环开始，由于 大量存在标签引物，标签引物大量扩增把初期积累的特异PCR产物急速扩增和放大，从而保 持对稀有突变靶序列的极高特异性和极高灵敏度。
根据此，本发明的环形引物可以被用于实时PCR中耙核酸的检测。
本发明的探针所使用的核苷酸可以是DNA， RNA， LNA，或PNA，或任何非自然核苷组成。 本发明还涉及到环形引物技术的应用。
本发明涉及使用一种对核酸进行PC財广增的新式引物。该引物为一条寡核苷酸，寡核苷 酸的5端和3端分别存在3-20个互补碱基，在一定条件下可以相互结合为双链，使引物形成一 个环状结构，对突变的识别可以放在3端第1个碱基也可以放在引物内部。在一定条件下，引 物的3端形成双链，引物内部形成一个环形结构，当引物与靶序列识别并杂交时，双链结构 被打开，环形结构消失，引物从自身双链变为与靶序列结合的双链而获得DNA延伸能力。没 有耙序列存在时，引物可以在退火时自行形成环形结构，在3'末端形成双链，将引物的3' 端的DNA延伸能力封堵，因此不会产生非特异扩增尤其是产生引物二聚体。见图la和图lb。
根据图la所示，单扩增环形引物发明体系中含有两条引物，分别为单扩增环形上游引物 F、单扩增环形下游引物R。本例中单扩增环形上游引物F有三个不同功能区域31、 32、 33组 成，其中31区域命名为靶序列识别区，32区域命名为突变识别区，突变识别区可以设计在3'端或离3'端较远的位置，可根据稀有突变的类型不同而定，33区域命名为互补序列。本例 中单扩增环形下游引物R有两个不同功能区域34、 35组成，其中34区域命名为靶序列识别区 ，35区域命名为互补序列。
根据图lb显示的是利用本发明设计的引物单扩增突变的靶序列，从而有效解决普通SNP 检测、普通PCR检测以及多重PCR检测带来的引物二聚体困扰。 一般情况下上下游引物都以成 环形状，从而避免形成引物二聚体，只有在高温变性时，成环打开，退火时与靶序列结合， 如图单扩增环形上游引物退火时能与带突变的靶序列41结合，单扩增环形下游引物与靶序列 42结合，延伸得到产物43、 44。产物序列43成为单扩增环形下游引物的靶序列，单扩增环形 下游引物与产物序列43结合延伸得到目标产物45。
本发明涉及使用一种对基因突变，尤其是稀有突变进行PCR检测及实时PCR检测的新式引 物。该引物为一条寡核苷酸，寡核苷酸的5端和3端分别存在3-20个碱基，在一定条件下可以 相互结合为双链，使引物形成一个环状结构，并且在引物内部带有一个通用标签序列，对突 变的识别可以放在3端第1个碱基也可以放在引物内部。在一定条件下，引物的3端形成双链 ，引物内部形成一个环形结构，当引物与靶序列识别并杂交时，双链结构被打开，环形结构 消失，引物从自身双链变为与靶序列结合的双链而获得DNA延伸能力；标签序列和环形引物 按一定比例(标签序列一般为环形引物用量的10倍以上)，同时存在于PC財广增体系，在 PCR循环的前2个循环，环形引物高特异地识别突变靶序列并进行初期扩增，从第3个循环开 始，由于大量存在标签引物，标签引物大量扩增把初期积累的特异PCR产物急速扩增和放大 ，从而保持对稀有突变靶序列的极高特异性和极高灵敏度。没有靶序列存在时，引物可以在 退火时自行形成环形结构，在3'末端形成双链，将引物的3'端的DNA延伸能力封堵，因此 不会产生非特异扩增尤其是产生引物二聚体；对突变点序列的识别可以根据靶序列特点，将 识别位点放发在3'末端也可以放在引物内部。引物特异性的强弱可以通过引物自身3'端双 链区域的长度进行调整，当靶序列存在一个或多个与引物不匹配的碱基，引物自身的环形结 构不能打开，引物3'末端双链结构依然形成，仍将引物3'端的DNA延伸能力封堵，因此不 会扩增。见图2a和图2b。
环形引物构成
本发明的环形引物包括两种引物设计，分别针对不同的需要， 一种是单扩增环形引物， 用于普通的基因扩增，可以消除引物二聚体；另一种是双扩增环形引物，用于高特异地检测 稀有突变。单扩增环形引物。该引物为一条寡核苷酸，寡核苷酸的5端和3端分别存在3-20个碱基， 在一定条件下可以相互结合为双链，使引物形成一个环状结构，在一定条件下，引物的3端 形成双链，引物内部形成一个环形结构，当引物与靶序列识别并杂交时，双链结构被打开， 环形结构消失，引物从自身双链变为与靶序列结合的双链而获得DNA延伸能力。没有靶序列 存在时，引物可以在退火时自行形成环形结构，在3'末端形成双链，将引物的3'端的DNA 延伸能力封堵，因此不会产生非特异扩增尤其是产生引物二聚体。见图la和图lb。
双扩增环形引物。该引物为一条寡核苷酸，寡核苷酸的5端和3端分别存在3-20个碱基， 在一定条件下可以相互结合为双链，使引物形成一个环状结构，并且在引物内部带有一个通 用标签序列，在一定条件下，引物的3端形成双链，引物内部形成一个环形结构，当引物与 靶序列识别并杂交时，双链结构被打开，环形结构消失，引物从自身双链变为与靶序列结合 的双链而获得DNA延伸能力；标签序列和环形引物按一定比例(标签序列一般为环形引物用 量的10倍以上)，同时存在于PC財广增体系，在PCR循环的前2个循环，环形引物高特异地识 别突变靶序列并进行初期扩增，从第3个循环开始，由于大量存在标签引物，标签引物大量 扩增把初期积累的特异PCR产物急速扩增和放大，从而保持对稀有突变靶序列的极高特异性 和极高灵敏度。没有靶序列存在时，引物可以在退火时自行形成环形结构，在3'末端形成 双链，将引物的3'端的DNA延伸能力封堵，因此不会产生非特异扩增尤其是产生引物二聚体 ;对突变点序列的识别可以根据靶序列特点，将识别位点放发在3'末端也可以放在引物内 部。引物特异性的强弱可以通过引物自身3'端双链区域的长度进行调整，当靶序列存在一 个或多个与引物不匹配的碱基，引物自身的环形结构不能打开，引物3'末端双链结构依然 形成，仍将引物3'端的DNA延伸能力封堵，因此不会扩增。见图2a和图2b。
根据图2a，鉴于传统针对稀有突变检测而设计引物的不足，本发明创造性的提出一种针 对稀有突变设计引物的方法。根据图1所示，本发明体系中含有三条引物，分别为双扩增环 形上游引物F、双扩增环形下游引物R、通用引物T。本例中双扩增环形上游引物F有4个不同 功能区域ll、 12、 13、 14组成，其中ll区域命名为靶序列识别区，12区域命名为突变识别区 ，突变识别区可以设计在3'端或离3'端较远的位置，可根据稀有突变的类型不同而定，13区 域命名为标签序列，14区域命名为互补序列。本例中双扩增环形下游引物R有3个不同功能区 域13、 15、 16组成，其中13区域命名为标签序列，与双扩增环形上游引物中的13区序列相同 ，15区域命名为靶序列识别区，16区域命名为互补序列。本例中通用引物T是与双扩增环形 上下游引物F、 R中的13区域标签序列完全匹配。
图2b显示的是利用本发明设计的引物双扩增稀有突变的靶序列。扩增包含两个阶段，第一阶段扩增中初始含稀有突变的靶序列在双扩增环形上下游引物F、 R存在下，在较高的退火温度下，该阶段的最佳退火温度为60 66度。在此温度下，通用引物T由于TM值较低，因此无法发生匹配，而双扩增环形上下游引物F、 R可以高特异性的和耙序列21、 22匹配。延伸得到序列23、 24，而序列23在较高的退火温度下被双扩增环形下游引物R匹配，延伸得到序列25，从而实现对稀有突变序列的积累。由于在较高的退火温度下，引物与靶序列的结合效率降低，此阶段的积累并不能实现高效的指数级积累。
本发明在第二阶段的扩增中使用了通用引物T，第一阶段中积累的稀有突变序列25的3'端带有与通用引物T匹配的序列，在较低的退火温度下，该阶段的最佳退火温度为54 58度。在该退火温度下通用引物T能高效的与稀有突变序列25结合，延伸得到带有稀有突变的序列26，序列25、 26同时都能被通用引物T匹配，从而实现指数级扩增，最终获得大量带有突变的序列27，实现对稀有突变序列的扩增。
环形引物的设计方法
与耙序列结合区Tm值引物中与耙序列特异结合的区域Tm值维持普通引物的Tm值即可，可以根据耙序列的GC含量而确定， 一般Tm值约为55-65'C。扩增时的退火温度可以和引物Tm值一致也可以低于引物TM值3-5'C 。
内部双链结合区域Tm值在大多数情况下，引物的互补碱基为3-20bp，其Tm值与扩增引物Tm值相当或高于退火温度2-5'C。根据本发明的一部分具体实施方案的实验结果，如用于单碱基突变区分检测的实时PCR的环形引物互补区Tm值可以高于退火温度3-5'C 。对于作为检测稀有突变的引物，双链结合部分的Tm值，可以高于退火温度5-12'C。
突变识别碱基的位置对普通点突变等靶序列，突变识别位点可以位于引物3'末端第一个碱基；对于缺失和插入突变，可以是3'末端的连续性的几个碱基；对于耙基因突变点近距离可能出现多种其他近似突变的，突变识别碱基一般放在引物内部，而不是引物3'末端第一个碱基。
引物的长度 一般情况，引物总长度为20-80bp，靶序列结合区16-40bp，引物内部互补区即双链结合区5端和3端分别为3-20bp，环形区域长度约5-60bp，通用标签序列约16-30bp
非自然核苷酸的使用任何非自然核苷酸，如LNA、 PNA，均可以在引物的任何位置使用
环形引物的最适检测结构环形引物可以用于实时PCR中特异耙序列的扩增检测。目前环形引物适用的实时PCR仪器包括Applied Biosystems (ABI)公司的7300、 7500、 7700，Bio-Rad公司的IQ Cycler, Roche公司的LightCycler2. 0、 LightCycler480， CorbettResearch公司的Rotor-Gene 3000、 6000， Strategene公司的MX3000P和MX3005P等等。
环形引物的积极效果
设计简单环形引物设计时没有太多要求，引物3端序列为扩增靶序列的一部分，5端有几个碱基与引物3端序列互补，标签序列可以加或不加入引物内部，突变识别碱基可以在3末端第一碱基也可以在引物内部，只要引物的双链结合区的Tm值与相应的PCR反应体系中使用的退火温度保持一致或高出。任何设计过PCR引物的人员都可以设计。
无引物二聚体产生在PCR预变性温度升高到变性温度前，由于引物自身的双链结合封堵了引物DNA延伸的能力；在后续PCR的循环中，保持一定的退火温度条件下，未能与靶序列结合的引物由于自身双链结合的趋势而更优先自身形成双链，而不会与另一条引物形成双链，因此就不会扩增出引物二聚体。
特异性高由于本引物存在一个自身的反向互补双链结构，只有当靶序列与引物靶序列结合区的结合力大与反向互补双链结合的能量，引物才可以与靶序列发生杂交，环形结构才能打开，引物才会获得DNA延伸能力。如果靶序列中存在与引物不匹配碱基，如单碱基的不匹配，不匹配位置无论位于3'末端还是引物内部，该引物都优先保持自身环形结构的稳定，引物DNA延伸能力就会被封堵。另外，由于自身存在一个反向互补双链结构，设计时可以调节互补区域的长短，来调整引物的特异性。对稀有突变，如面对大量野生型DNA背景的体细胞突变，该引物更进一步保证了其特异性，除了来自引物3'末端的序列特异性同时受到互补序列的竞争。
灵敏度高双扩增环形引物由于带有通用标签序列，对耙序列可以有两次放大。对于模板中稀有突变DNA本身含量较低，再加上特异引物面对大量野生背景因此对它的扩增效率不高，而只要扩增出一个拷贝，体系中高浓度存在的标签引物能够高效地将此靶序列快速扩增放大。
适合多重PCR体系由于引物自身能够保证极高的特异性，无引物二聚体产生，并带有标签序列，在经过2轮初期扩增以后，所有扩增产物全部由同样的标签序列扩增，不存在各个引物扩增效率存在差异和引物将相互影响的问题，因此非常适合多重PCR体系，适合一些多基因表达相对定量的检测体系。
适合密集突变区单一突变的准确扩增能够发生研究者感兴趣突变的基因区域，往往同
时会密集发生一些与研究无关的突变类型，而这类突变 研究者感兴趣的突变极其相似，普通的将特异碱基放在引物3'末端的ARMS引物法容易产生交叉反应，而双扩增环形引物可以将特异碱基放在引物内部并可涵盖更多的靶序列区域，从而保证扩增的准确性。见图6。合成简单无需任何特别的仪器，只需普通的DNA合成仪即可完成合成。适用范围广其对于AT富集区和GC富集区的困难模板，以及点突变、缺失突变、插入突变都有着很好的应用性。
图la、单扩增环形引物示意图
图lb、单扩增环形引物在PCR循环检测时的反应原理示意2a、双扩增环形引物示意图
图2b、双扩增环形引物在PCR循环检测时的反应原理示意图
图3、环形引物用于染料法实时PCR检测体系(实施例l)
图4、环形引物结合探针用于实时PCR检测。模板连续10倍稀释(实施例2)
图5、环形引物对SNP区分能力(实施例3)
图6、双扩增环形引物用于密集突变区单一稀有突变的准确扩增(实施例4)
具体实施例方式
实施例一环形引物用于染料法实时PCR检测拟南芥SUC2基因
为考察环形引物应用在实时PCR体系中引物二聚体产生情况，设计一对针对拟南芥SUC2基因的引物，扩增片段长度为100bp。 PCR模板为拟南芥叶片组织提取的DNA。反应体系总体积为50yl，包括5y 110Xbuffer (160mM[NH4]2S04， 670mM Tris-HC1 pH8. 8， and 0. 1% w/vTween 20)， 1.5 yl 25 mM MgCl2，每禾中dNTP 400 y M，上下游引物0.4ym， Eve Green0.5yl， l.OU Taq DNA聚合酶，5yl模板DNA。实时PCR反应在RotorGene3000实时PCR仪上进行。反应条件为96 。C预变性3min， 94。C3min; 94。C15s， 55°C 20s (检测FAM荧光信号)，72°C15 s，共35个循环；然后做熔解曲线分析。&0作为阴性对照
。环形引物包括一段与扩增产物互补的核酸序列。上游引物为
5 ■ -AACCAGCTC ATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3 ■ r&口irf^- -，下游引物为
5 ■-虹CAGCTTGC GGC GGTTT GTCAAGCTGAT-3'
，引物5'端和3'端带有下划线标示的碱基为参与形成探针内双链结合区的碱基。在PC財广增时荧光实时检测测量了35个循环，并作熔解曲线分析，其结果如图3所示。根据图3所示，其中a是依据本发明方法设计的引物与依据传统方法设计的引物用染料进行荧光PC財广增的NTC (空白对照)结果。线51是依据传统方法设计的引物扩增NTC结果，可明显看出形成较多的引物二聚体。线52是依据本发明方法设计的引物扩增NTC结果，显然依据本发明方法设计的引物能有效的减少引物二聚体的形成，避免不必要的扩增。
图3 b显示的是依据本发明方法设计的引物用染料进行荧光PC財广增后的融解曲线分析结果。传统方法设计的引物由于会形成引物二聚体，在融解曲线分析时会形成两个峰，分别是引物二聚体峰和产物峰。而依据本发明设计的弓1物扩增时只形成一个产物峰。
实施例二环形引物结合探针用于实时PCR定量乙肝病毒检测
为考察环形引物应用在实时PCR检测的有效性，PCR模板为一系列稀释的标准DNA样品。反应体系总体积为50y 1，包括5 yl 10Xbuffer (160 mM [NH4]2S04， 670 mM Tris-HC1 pH8. 8， and 0.1 % w/v Tween 20)， 1.5 yl 25 mM MgCl2，每种dNTP 400线上下游引物0.4uM，探针O.lyM， l.OUTaq DNA聚合酶，5yl模板DNA。实时PCR反应在RotorGene 3000实时PCR仪上进行。反应条件为94 。C预变性5min，随后94s， 58°C 25 s， 72 。C延伸15s，IO个循环；94°C15s， 58°C20s (检测FAM、荧光信号)，72°C15s，共35个循环。标准DNA连续10倍梯度稀释，H20作为阴性对照。环形引物包括一段与扩增产物互补的核酸序列。上下游引物扩增乙肝病毒的S区基因(NC-003977)，扩增174bp。其上游引物为5'-GGTCCTACAACATCAGGATTCCTAGGACC-3■，下游引物为，
5'-CAACCTCGGTGAGTG腊GG腦TTG-3'，探针的耙序列靠近上游引物，序列为FAM-5'-CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTC-3'-BHQ。引物5'端和3端带有下划线标示
的碱基为参与形成引物内双链结合区的碱基。
在PC財广增时荧光实时检测测量了35个循环，其结果如图4所示。初始的靶浓度在稀释物最浓时的线81，线82、 83、 84分别表示当模板被连续10倍稀释3个梯度后的荧光曲线。
实施例三实时PCR中用环形引物检测SNP
选择人类血小板同禾中异型抗原(human platelet alloantigen， HPA)的HPA-4基因，由于该基因内存在一个G〉A的突变，而导致产生HPA-4a和HPA-4b两个血小板抗原，HPA-4a为野生型，HPA-4b为突变型。针对两个抗原的基因序列分别设计双环探针，两个探针只相差l个碱基，并选择已知基因型的3个典型样品进行试验。l个为纯和HPA-4a样品，l个为纯和HPA-4b样品，l个为杂合样品，同时含有HPA-4a和HPA-4b。试验时同时做一个无(阴性)样品即H20对照。野生型HPA-4a引物序列为
f - CGCATCTGACCAAGCTGGCCACCCAGATGCG - ^—t如…"
1-— ，突变型HPA-4b引物序列为
CGC虹CTGACCAAGCTGGCCACCCAGATGCA - 3; 冊*卞4^处納7^甘^力旅必/^7^甘1-^ - ，市有下划线的碱基为关变发生碱基
，带有外框的碱基为成环结合区碱基。通用下游引物为5'-TGCCCCGAAGCCAATCC -3'。
反应由2个PCR构成， 一个含有野生型引物， 一个含有突变型引物。反应总体系为25靈，包括2.5 yl 10Xbuffer (160 mM [NH4]2S04， 670 mM Tris-HC1 pH 8.8， and 0.1 % w/vTween 20)， 1.5 yl 25mM MgCl2，每禾中dNTP400 y M，各种引物0.4yM， Eve Green
0. 5yl， 1. OUTaqDNA聚合酶，20ng模板DNA。实时PCR反应在RotorGene 3000实时PCR仪上进行。反应条件为96。C预变性2min，随后96。C变性15 s， 68°C-59°C (每循环一次温度下降1。C) 15s， 72。C延伸15s， IO个循环；94。C3min; 94。C15s， 58°C20 s (检测FAM荧光信号)，72°C 15 s，共35个循环。
图5显示了实时荧光PCR进行SNP分析循环数据的结果，由两个PCR组成， 一个针对野生型， 一个针对突变型。相对于野生型靶的引物扩增结果被正方实心表示，相对于突变异种靶的弓1物扩增结果被实心圆环表示。
相对于阴性样本，野生型引物(曲线61)及突变型引物(曲线62)，均没有扩增产物。结果显示仅当模板包括在反应中，才发生相应的扩增。当两个靶序列均在样本中时，野生型引物(曲线67)及突变型引物(曲线68)，扩增产物显著增加。但是，对于野生型靶，扩增产物的显著增强来自于野生型引物扩增(曲线63)，而不是突变型引物扩增(曲线64)。相反，对于突变型靶，扩增产物显著增强来自于突变型引物的扩增(曲线65)，而不是野生型引物扩增(曲线66)。结果显示仅仅是完全匹配的引物可以产生扩增。野生模板与突变模板的100%完全检测。这证明了根据本发明的引物通过一个或几个核苷区分了靶。当无模板时无扩增信号被发现，当有两个模板时，两个PCR反应的扩增信号均被发现。
实施例四
双扩增环形引物用于K-ras基因12密码子密集突变区单一稀有突变的准确扩增K-ras基因在调节细胞生长和分化方面具有重要作用，大约70 %的肿瘤在不同程度上都与12 、 13位密码子突变有关，其它密码子突变在59、 61位上。
12 、 13位密码子中3个碱基都可能发生突变，大多为密码子第1和2碱基发生突变，可以突变为除自身外其他任何3种碱基的一种，也可以为第1和2碱基同时突变。如12密码子的第1碱基突变为A，即^DIGT (Cosmic ID:480)，此突变为热点突变，与大肠癌治疗药物爱必妥的耐药性相关；而12密码子的第1和第2碱基同时突变，如^I>I^(COSmicID:513)，^T>HT(CosmicID:512)，^T>IAT(Cosmic ID:25081)，此三个突变为普通突变，尚不明确是否与大肠癌治疗药物爱必妥的耐药性相关。常用的ARMS引物很容易将类突变误检为>>IGT 。
以本发明的双扩增环形引物根据Cosmic数据公布的K-ras基因12密码子的野生型基因序列和GGT〉TGT突变基因序列(Cosmic ID:480)比较分析，设计一对引物和探针分别为K-ras-Ml-F、 K-ras-Ml-R、 K-ras-P。根据Cosmic数据公布的HGH基因的野生型基因序列分析，设计一对引物和探针分别为HGH-F、 HGH-R、 HGH-P。
利用上述荧光PCR体系检测临床采集的石蜡组织样本K-ras基因GGT〉TGT突变的方法包括以下步骤
(1) 样品处理和模板提取接收来自临床的石蜡组织样品，样品切成5-10 ym，加入lml二甲苯脱蜡，离心收集沉淀，加入l ml无水乙醇到沉淀中，室温或37。C晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL， 56。C消化裂解l小时，9CTC孵化lh，加入200ml Buffer
AL混匀再加入200y l无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA 2ml离心柱中，6000Xg (8000rpm)离lmin，加入500 y 1Buffer AW1， 6000Xg (8000rpm)离lmin，小心打开盖子加入500y 1BufferAW2， 6000Xg (8000rpm)离l min，空管离心20000Xg (14000rpm)离3min，加入IOO y 1Buffer—ATE于膜中央，温育5分钟，20000Xg (14000rpm)离l min。取3uU则0D值，将提取的样品DNA稀释到2ng/y 1，取5 y 1进行PCR反应。
(2) 荧光PC財广增，其反应体系为PCR缓冲液
MgCl2 7.Ommol
dNTP各 l.Ommol各类引物 0. 5 1.0ymo1
标签序列T 5 10ymo1各类探针 0. 5 1.0ymo1
Taq酶 1.0U模板 5 y 1
总体积 25 yl
引物探针序列K昏M1-F :
其中带有下划线的碱基为标签序列，5'端带有边框的碱基为与3'端碱基互补的序列，加粗的碱基为突变识别碱基；
K-fas-Ml-R: GCAAGGGGTCAGTAAAGC GTC GTCCACAAAATGATTCTG ，其中带有下划线的碱基为标签序列；标签序列T为GCAAGGaGTC扁AAAGCa 。 K—ras—p: FM—5'TGCCTTGACGATACAGCT3' -BHQ。内控HGH体系
HGH-F: 5'-GCAAGGGGTCAGTAAAGCGGCAGTGCCTTCCCAACC虹T-3'HGH-R: 5'-GCAAGGGGTCAGTAAAGCGCATTCCCCAAGAGCTTACAAACTC-y 其
中带有下划线的碱基为标签序列，HGH-P: HEX-5' TTGACAACGCTATGCTCCGC3' -BHQ。
实时PCR反应条件是96。C预变性3分钟，15个循环95 。C变性15秒，64 。C退火25秒，72。C延伸10秒，35个循环，95。C变性15秒，58。C退火25秒，72 。C延伸10秒，35个循环，后35个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。
(3) 检观U:采用MX3000P实时PC財广增仪(SRATGENE公司)退火阶段检测荧光，将含反应液的PCR管逐一放到荧光PC財广增仪进行检测。
结果判断根据荧光PC財广增仪显示的Ct值判断结果检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct>18)时表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM信号是否升起作为阴阳性判断的标准，有正常"S〃形PC財广增曲线阳性。
(4) 特异性分析
特异性检测以SW48细胞的DNA作为对照，对收集的样品进行K-ras基因H。ET
突变检测，特异性分析结果表明，只有含有K-ras基因H。I^突变的样品有荧光信号，作为对照的SW48细胞DNA无荧光信号，同时采集血站100例血液样品，进一步证明荧光PCR的特异性。结果表明血站采集的血液样品DNA进行荧光PCR检测无荧光信号。
(5) 灵敏度分析
以合成的含有K-ras基因&^>1(^突变的质粒0魁进行定量分析，取经定量后浓度为IOOO个拷贝数的样品DNA，进行10倍稀释，共做3个稀释度，然后依次取4个稀释度的5y 1，8个平行组进行荧光PCR反应。本发明的荧光PCR方法灵敏度高，1-10 copys/y l即可检出。
(6) 选择性试验
以合成的含有K-ras基因^。IGT突变的质粒DNA的5个拷贝数在lng、 5ng、 10ng、 50ng、100ng、 200ng的背景下进行荧光PCR检测。见图6。
图6所示的是依据本发明设计的稀有突变双扩增环形引物对不同浓度背景下的稀有突变模板进行扩增的检测结果。检测5个拷贝的突变模板分别在lng、 5ng、 10ng、 50ng、 100ng、200ng背景下，线71为5个拷贝在lng背景，线72为5个拷贝在5ng背景，线73为5个拷贝在10ng背景，线74为5个拷贝在50ng背景，线75为5个拷贝在100ng背景，线76为5个拷贝在200ng背景。依据本发明设计的双扩增环形引物选择性强。序列表
〈110〉厦门艾德生物医药科技有限公司
〈120〉一种用于核酸扩增的环形引物及其应用
〈160>15
〈210>1〈211>28〈212>DNA〈213>人工序列
〈400>1
aaccagctca tcgtcgctgg agctggtt 28
〈210>2〈211>29〈212>DNA〈213>人工序列
〈400>2
atcagcttgc ggcggtttgt caagctgat 29
〈210>3〈211>29〈212>DNA〈213>人工序列
〈400>3ggtcctacaa catcaggatt cctaggacc 29
〈210>4〈211>26〈212>DNA〈213>人工序列
〈400>4
caacctcggt gagtgattgg aggttg 加
〈210>5〈211>26〈212>DNA〈213>人工序列
〈400>5
cagagtctag actcgtggtg gacttc 26
〈210>6〈211>31〈212>DNA〈213>人工序列
〈400>6
cgcatctgac caagctggcc acccagatgc g 31〈210>7〈211>31〈212>DNA〈213>人工序列
〈400>7
cgcatctgac caagctggcc acccagatgc a 31
〈210>8〈211>17〈212>DNA〈213>人工序列
〈400>8
tgccccgaag ccaatcc 17
〈210>9〈211>52〈212>DNA〈213>人工序列
〈400>9
acaagctccg caaggggtca gtaaagcgaa acttgtggta gttggagctt gt 52
〈210>10〈211>39〈212>DNA〈213>人工序列
〈400>10
gcaaggggtc agtaaagcgt cgtccacaaa atgattctg 39
〈210>11〈211>19〈212>DNA〈213>人工序列
〈400>11
gcaaggggtc agtaaagcg 19
〈210>12〈211>18
〈212>DNA
〈213>人工序列
〈400>12
tgccttgacg atacagct 18
〈210>13〈211>39〈212>DNA
〈213>人工序列
〈400>13gcaaggggtc agtaaagcgg cagtgccttc ccaaccatt 39
〈210>14〈211>43〈212>DNA〈213>人工序列
〈400>14
gcaaggggtc agtaaagcgc attccccaag agcttacaaa etc 43
〈210>15〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列
〈400>15
ttgacaacgc tatgctccgc 20
权利要求
1.一种用于核酸扩增的环形引物，该引物为一条寡核苷酸，其特征在于该寡核苷酸的3’端为与靶序列互补的靶序列识别区，5’端为与靶序列识别区互补的3-20个碱基，在合适条件下，5’端和3’端可以相互结合为双链，使引物形成一个环状结构；当引物与靶序列识别并杂交时，双链结构被打开，环形结构消失，引物从自身双链变为与靶序列结合的双链而获得DNA延伸能力。
2.如权利要求l所述的一种用于核酸扩增的环形引物，其特征在于 所述的环形引物进一步包括一个突变识别区。
3.如权利要求2所述的一种用于核酸扩增的环形引物，其特征在于 所述的突变识别区位于靶序列识别区的3'末端或靶序列识别区内部。
4.如权利要求l所述的一种用于核酸扩增的环形引物，其特征在于所述的引物序列中，至少有一个非自然的核苷。
5. 一种扩增核酸的方法，采用上游引物F及下游引物R，其特征在于 :其中至少有一条引物为环形引物，该环形引物的3'端为与靶序列互补的靶序列识别区， 5'端为与靶序列识别区互补的3-20个碱基，在合适条件下，5'端和3'端可以相互结合为双链 ，使引物形成一个环状结构；当环形引物与靶序列识别并杂交时，双链结构被打开，环形结 构消失，引物从自身双链变为与靶序列结合的双链而获得DNA延伸能力。
6.如权利要求5所述的一种扩增核酸的方法，其特征在于所述的环 形引物进一步含有一个突变识别区。
7.如权利要求6所述的一种扩增核酸的方法，其特征在于所述的突 变识别区位于靶序列识别区的3'末端或靶序列识别区内部。
8.如权利要求5所述的一种扩增核酸的方法，其特征在于其特征在 于所述的引物序列中，至少有一个非自然的核苷。
9. 一种用于核酸扩增的环形引物，该引物为一条寡核苷酸，其特征 在于该寡核苷酸的3'端为与靶序列互补的靶序列识别区，5'端为与靶序列识别区互补的3-20个碱基，在 合适条件下，5'端和3'端可以相互结合为双链，使引物形成一个环状结构；引物内部带有一个通用标签序列，在合适条件下，引物的3'端形成双链，引物内部形 成一个环形结构，当引物与靶序列识别并杂交时，双链结构被打开，环形结构消失，引物从 自身双链变为与靶序列结合的双链而获得DNA延伸能力。
10.如权利要求9所述的一种用于核酸扩增的环形引物，其特征在于 :所述的环形引物的进一步包括一个突变识别区。
11.如权利要求10所述的一种用于核酸扩增的环形引物，其特征在于 :所述的突变识别区位于靶序列识别区的3'末端或靶序列识别区内部。
12.如权利要求9所述的一种用于核酸扩增的环形引物，其特征在于 :所述的引物序列中，至少有一个非自然的核苷。
13.如权利要求9所述的一种用于核酸扩增的环形引物，其特征在于 :引物总长度为35-80bp，靶序列结合区16-40bp，通用标签序列16-30bp。
14.一种采用环形引物扩增的方法，其特征在于体系中含有三条引 物，分别为上游引物F、下游引物R、通用引物T，其中上游引物F和下游引物R中至少有一条为环形引物，该环形引物的3'端为与靶序列互补 的靶序列识别区，5'端为与靶序列识别区互补的3-20个碱基，在合适条件下，5'端和3'端可 以相互结合为双链，使引物形成一个环状结构；上游弓1物F和下游引物R内部各带有一个相同的通用标签序列；在合适条件下，环形引物的3'端与自身的互补序列形成双链，引物内部形成一个环形 结构，当引物与靶序列识别并杂交时，双链结构被打开，环形结构消失，引物从自身双链变 为与靶序列结合的双链而获得DNA延伸能力；通用引物T的序列与上下游引物F、 R中的标签序列完全相同。
15.如权利要求14所述的一种采用环形引物扩增的方法，其特征在于 :所述的环形引物中进一步包括一个突变识别区。
16.如权利要求15所述的一种采用环形引物扩增的方法，其特征在于 :所述的突变识别区位于靶序列识别区的3'末端或靶序列识别区内部。
17.如权利要求14所述的一种采用环形引物扩增的方法，其特征在于 :环形引物总长度为35-80bp，靶序列结合区16-40bp，通用标签序列16-30bp。
18.如权利要求14所述的一种采用环形引物扩增的方法，其特征在于 :标签序列T的添加量为引物F及R总添加量的10倍以上。
19.如权利要求14所述的一种采用环形引物扩增的方法，其特征在于 :扩增包含以下几个部分1)预变性；2)包括变性、引物退火和引物延伸循环的第一部分PC財广增；3)包括变性、引物退火和引物延伸循环的第二部分PC財广增，其中步骤2)扩增的退火温度为60 66度； 步骤3)扩增的退火温度为54 58度。
全文摘要
一种用于核酸扩增的环形引物及其应用，属于生物技术领域。该引物为一条寡核苷酸，其5’端和3’端分别存在3-20个碱基，在合适条件下可以相互结合为双链，使引物形成一个环状结构；当引物与靶序列识别并杂交时，双链结构被打开，环形结构消失；没有靶序列存在时，引物可以在退火时自行形成环形结构。引物内部可以带有一个通用标签序列，也可以不带有通用标签序列，带有通用标签序列的引物可以和通用标签序列引物一起用来二次扩增，放大信号。本发明的引物特异性高，不形成引物二聚体，设计简单，适合基因表达量的检测，SNP检测以及稀有突变检测。
文档编号C12P19/00GK101671674SQ200910301170
公开日2010年3月17日 申请日期2009年3月27日 优先权日2009年3月27日
发明者何东华, 郑立谋, 力 阮, 琰 陈 申请人:厦门艾德生物医药科技有限公司