专利名称：一种快速miRNAs Poly(A)聚合酶化试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种快速miRNAs Poly(A)聚合酶化试剂盒。
背景技术：
miRNAs是一类非编码、内源性的小RNA，生物体内源长度约20 23个核苷酸(nucleotides, nt) ， miRNAs由基因组DNA编码，在细 胞核内由RNA聚合酶II转录为几百个核苷酸(nt)的初级转录本 (pri-miRNA)。该茎-环结构的pri-miRNA被RNase III家族成员 Drosha剪切成约70 nt的发夹结构前体pre-miRNA。随后pre-miRNA 被转运出细胞核，并进一步由胞浆的RNase III家族成员Dicer加工 成miRNAs。植物中miRNAs的作用策略与siRNA类似，即通过碱基精 确配对方式结合于耙mRNA的3' -UTR或开放阅读框，导致耙mRNA转 录沉默。但绝大多数哺乳动物miRNAs则通过部分碱基配对结合于靶 mRNA的3' -UTR，导致耙mRNA的特异性剪切或转录阻遏。miRNAs对 转录后水平的基因调控广泛存在于真核生物的发育和代谢过程，包括 细胞凋亡、细胞增殖、细胞分化、脂肪代谢、胰岛素分泌、免疫调节、 应激反应等，并呈现时空表达特异性。miRNAs在人类基因组中miRNAs 基因占据大约1%的数量，虽然在不同的时空发育阶段，它们的表达 量不同，但是多种miRNAs在同一个细胞中的表达使得细胞处在一种 内在的miRNAs环境中，这个环境控制着成千上万的编码基因的 miRNAs水平，使得各种蛋白的表达处在一个适合的水平。miRNAs为 非编码基因，无poly(A)尾，在进化上保守，并广泛存在于动物、植 物、真菌及病毒基因组中。目前在人类中己发现695条miRNAs分子， 但科学家预测人类基因组可能含有约lOOO条特异的miRNAs，它们调 控近30%的基因表达。最近，研究发现许多miRNAs基因定位于与疾 病相关的基因位点附近，并在肿瘤发生过程中有差异表达，而有的 miRNAs可以作为早期癌症检测的生物标记。目前对这种miRNAs可检 测的种类较少，而且后续操作较为复杂、缓慢。发明内容
本实用新型的目的是提供一种快速miRNAs Poly(A)聚合酶化试 剂盒，使得可检测的miRNAs种类更多，后续操作更简化、更迅速。 本实用新型的目的通过以下技术方案来实现。 一种快速miRNAs Poly(A)聚合酶化试剂盒，包括外盒体、内盒 体，内盒体上设有承载孔，内盒体置于外盒体内，其特征在于所述 内盒体上的承载孔上放置有装有用于配制miRNAs Poly(A)聚合酶化 体系的试剂的试剂瓶组，该装有用于配制miRNAs Poly(A)聚合酶化 体系的试剂的试剂瓶组包括装有聚合酶PAP试剂的试剂瓶、装有rATP 试剂的试剂瓶、装有PAP Buffer试剂的试剂瓶和装有DEPC水的试剂 瓶。
所述装有rATP试剂的试剂瓶中的rATP的体积规格为10 ul、装 有聚合酶PAP试剂的试剂瓶中的聚合酶PAP体积规格为20 u 1、装有 DEPC水的试剂瓶中的DEPC水体积规格为200 u 1，装有聚合酶PAP Buffer试剂的试剂瓶中的聚合酶PAP Buffer IOX聚合酶PAP Buffer 体积规格为20u 1，盛纳各试剂的试剂瓶均为统一规格大小。
所述装有用于配制miRNAs Poly(A)聚合酶化体系的试剂的试剂 瓶组还包括装有非编码的总RNA的试剂瓶，其中总RNA的0D26。/ 0D28。 值在1. 6 2. 0之间，总RNA为将植物组织、叶片或动物组织或贴壁 细胞或悬浮动物细胞、酵母或细菌进行研磨、匀浆、裂解后再提纯的 腿。
所述外盒体通过薄膜封装。
本实用新型与现有技术相比具有以下优点
本实用新型由于在试剂瓶内装有用于配制miRNAs Poly(A)聚合 酶化体系的试剂，该用于配制miRNAs Poly(A)聚合酶化体系的试剂 包括聚合酶poly(A) polymerase (PAP)试齐廿、rATP试剂、PAP Buffer 试剂和DEPC水，因此本实用新型便可以以rATP为底物，通过poly (A) polymerase (PAP)在miRNAs的3，端添加poly(A)尾，使得poly(A) 化的miRNAs成为逆转录的模板，从而提供了为不同来源样品中 miRNAs快速加poly (A)尾的方法，使得可检测的miRNAs种类多，后
续操作更简化、迅速。本实用新型具有以下特点1)起始材料需要量少，低至10 ng 的总RNA样本便能用于本试剂盒检测；2)更高效的PAP酶活性，PAP 酶经过严格质量控制，37° C条件下，10分钟可催化1 nmol的ATP 掺入RNA; 3)更快速的检测系统，优化后检测实验流程可大大縮短。
图1为本实用新型快速miRNAs Poly(A)聚合酶化试剂盒结构示 意图。
具体实施方式
以下结合附图对本实用新型快速miRNAs Poly(A)聚合酶化试剂 盒作进一步详细描述。
如图l所示，本实用新型快速miRNAs Poly(A)聚合酶化试剂盒，
包括外盒体l、内盒体2、用于配制miRNAs Poly(A)聚合酶化体系的 试剂3，内盒体2上设有承载孔21，该用于配制miRNAs Poly(A)聚 合酶化体系的试剂3包括聚合酶poly(A) polymerase (PAP)试剂、 rATP试剂、PAP Buffer试剂和DEPC水，DEPC水与其余各试剂分别 装于对应的单个试剂瓶内，各试剂瓶分别放置在内盒体2上的承载孔 21内，内盒体置于外盒体内，外盒体通过薄膜封装。 操作方法
还需要的其他材料是
1) 样品质量好纯度高的总RNA 10ng 10Pg或纯化的小分 子■ 10 ng 2. 5 u g。
2) 试剂抽提RNA需要使用Trizol， Tris饱和酚(pH 4.5)， 氯仿，异丙醇，或RNA抽提试剂盒。
3) 仪器PCR仪或恒温仪、离心机、定量PCR仪。
4) 耗材无RNase、 DNase的枪头、离心管，移液器等。 miRNAs加poly(A)尾处理
miRNAs是非编码的RNA，没有poly(A)。本试剂盒采用poly(A) 聚合酶(PAP)在miRNAs 3， 端逐个添加rATP，形成poly(A)尾。
① 冰上融解rATP和PAP试剂，轻弹混匀，短暂离心后置于冰上待用；
② 按下表配制poly(A)化体系试剂体积/用量终浓度
总薩x u 1 (2 ii g)0.1 u g/ u 1
rATP (10 mM)1 wl0. 5 mM
10X PAP Buffer2 u 1IX
PAP2 nl1 U
DEPC水(16. 8 - x ) u 1
总计20 ul
③加poly (A)尾反应
轻弹混匀反应混合物，短暂离心后置于37。C反应30min,并95 。C加热5min终止反应。所得产物可立即进行cDNA第一链合成，也于 -2(TC保存。其中进行RNA相关操作，需要严格防止污染，所有用于 实验操作的离心管和枪头都应去除DNase、 RNase并进行高温灭菌处 理；实验操作人员需戴口罩和一次性橡胶手套；所有反应液的配制等 都需在冰上完成。总RNA起始用量在10ng 10Pg之间，可根据样 品的miRNAs丰度进行调整。最佳的总RNA用量在100 ng到2. 5 Pg 之间。总RNA纯度用0D26。/0D28Q (lOmMTris, pH7. 5)值衡量。用于 miRNAs检测的总RNA 0D26。/ OD，值在1. 6 2. 0之间为宜。
总RNA抽提及纯化
①研磨/匀浆/裂解样品。
不同来源样品的使用量和操作方法建议如下
样品来源用量Trizol用量
植物组织、叶片50 100 mg1 ml
动物组织10 30 mg1 ml
贴壁细胞10 cm31 ml
悬浮动物细胞、 酵母5Xl(f个1 ml
细菌1X10'个1 ml
研磨的操作取植物叶片或组织于研钵，加入适量液氮，迅速研 磨成粉末，加入l ml Trizol。待液氮挥发完全，将Trizol组织裂解液转移到离心管中进行下一步操作。
匀浆的操作取剪碎的组织样品于加有lml Trizol的匀浆器中 充分匀浆10 15 min，或用电动匀浆器匀浆1 2 min。将Trizol 组织裂解液转移到离心管中进行下一步操作。
裂解样品的操作适用于血液、培养的细胞、真菌或细菌的RNA 提取。适量细胞中加入l ml Trizol，用枪头吹打裂解细胞，室温下 放置5min。
进行RNA相关操作，需要严格防止污染。所有用于实验操作的离 心管和枪头都应去除DNase、 RNase并进行高温灭菌处理；实验用的 研钵和匀浆器可在180'C烘烤3 h去除DNase、 RNase;实验操作人员 需戴口罩和一次性橡胶手套。
② 每l ml Trizol加入200 tU氯仿，盖紧离心管管盖，手动 上下振荡15 s。此时裂解液变为粉红色浑浊液，并且无分层现象。 室温静置15 min，然后14,000 g， 4"C离心15 min;振荡时请勿涡 漩激烈振荡；可适当缩短静置和离心时间。
③ 小心取出离心管，此时样品分为三层无色的上清水相、中 间的白色层及粉红色的下层有机相。小心吸取无色上清水相移至另一 无RNA酶的离心管中；
④向步骤③得到的上清水相加入异丙醇剧烈混匀，冰上静置15 min，然后14,000 g， 4。C离心15 min;异丙醇与Trizol的体积比为 1:2;可适当縮短静置和离心时间。
⑤ 小心去除上清，缓慢沿管壁加入700 Pl 75%的乙醇，轻混 匀，冰上静置15 min，然后14， 000 g， 4。C离心15 min; 75%的乙 醇需用DEPC处理过的水配制；可适当縮短静置和离心时间。
⑥ 重复步骤 —次；
⑦ 小心吸尽上清，室温干燥沉淀2 5 min,加入30 50 u L的 无RNase水溶解RNA沉淀。不可干燥时间过长，否则RNA将会很难溶 解；提取的RNA可用1. 0%琼脂糖凝胶电泳确定产物完整性；总RNA纯 度用0D26。/ 0D， (10 mM Tris， pH 7.5)值衡量。用于miRNAs检测 的总RNA 0D26。/ 0D娜值在1. 6 2. 0之间为宜。
权利要求1、一种快速miRNAs Poly(A)聚合酶化试剂盒，包括外盒体、内盒体，内盒体上设有承载孔，内盒体置于外盒体内，其特征在于所述内盒体上的承载孔上放置有装有用于配制miRNAs Poly(A)聚合酶化体系的试剂的试剂瓶组，该装有用于配制miRNAs Poly(A)聚合酶化体系的试剂的试剂瓶组包括装有聚合酶PAP试剂的试剂瓶、装有rATP试剂的试剂瓶、装有PAP Buffer试剂的试剂瓶和装有DEPC水的试剂瓶。
2. 根据权利要求l所述快速miRNAs Poly (A)聚合酶化试剂盒，其特 征在于所述装有rATP试剂的试剂瓶中的rATP的体积规格为10 u 1、装 有聚合酶PAP试剂的试剂瓶中的聚合酶PAP体积规格为20 u 1、装有DEPC 水的试剂瓶中的DEPC水体积规格为200 u 1，装有聚合酶PAP Buffer试 剂的试剂瓶中的聚合酶PAP Buffer IOX聚合酶PAP Buffer体积规格为 20ul，盛纳各试剂的试剂瓶均为统一规格大小。
3. 根据权利要求1所述快速miRNAs Poly (A)聚合酶化试剂盒，其特 征在于所述装有用于配制miRNAs Poly(A)聚合酶化体系的试剂的试剂 瓶组还包括装有非编码的总RNA的试剂瓶，其中总RNA的0D26。/ 0028。值在 1. 6 2. 0之间，总RNA是将植物组织、叶片或动物组织或贴壁细胞或悬 浮动物细胞、酵母或细菌进行研磨、匀浆、裂解后再提纯的RNA。
4. 根据权利要求2或3所述快速miRNAs Poly (A)聚合酶化试剂盒， 其特征在于所述外盒体通过薄膜封装。
专利摘要本实用新型公开了一种快速miRNAs Poly(A)聚合酶化试剂盒，包括外盒体、内盒体，内盒体上设有承载孔，内盒体置于外盒体内，其特征在于所述内盒体上的承载孔上放置有装有用于配制miRNAs Poly(A)聚合酶化体系的试剂的试剂瓶组，该装有用于配制miRNAs Poly(A)聚合酶化体系的试剂的试剂瓶组包括装有聚合酶PAP试剂的试剂瓶、装有rATP试剂的试剂瓶、装有PAP Buffer试剂的试剂瓶和装有DEPC水的试剂瓶。本实用新型提供了为不同来源样品中miRNAs快速加poly(A)尾的方法，使得可检测的miRNAs种类多，后续操作更简化、迅速，具有起始材料需要量少，更高效PAP酶活性，检测实验流程可大大缩短的优点。
文档编号C12Q1/68GK201381323SQ20092005258
公开日2010年1月13日 申请日期2009年3月13日 优先权日2009年3月13日
发明者孙奋勇 申请人:广州华灿医药科技有限公司