一种实现细胞间振荡子同步的电路结构的制作方法

专利名称：一种实现细胞间振荡子同步的电路结构的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种同步的电路结构，尤其涉及一种实现细胞间振荡子
(repressilator)同步的电路设计，该电路基于耦合机制和外部控制手段，用 于实现细胞间r印ressilator电路同步，属于合成生物学技术领域。
(二)
背景技术：
过去的几个世纪，分子生物学和细胞生物学方面的发展呈现了爆发式的增 长，对于生命的理解也趋向于统一，就是人类可以完整认识生命过程并加以预 测，甚至精确控制细胞活动。随着分子生物学技术的累积，基因工程的发展以 及生物学与工程技术的大量结合，合成生物学开始出现并快速发展起来。基因 电路作为合成生物学研究的领域之一，通过设计和构建生命体中不存在的生物 组件和系统，有助于解决能源、材料、健康和环保等问题。
基因电路将复杂的生物学功能抽象成分子浓度的变化，把注意力集中于系 统的输入输出，并由此合成了多种单元电路。随着基因调控网络复杂度的不断 提高，如何协调各单元电路的时间、空间特性，使其完成特定的生物学功能， 成为限制基因电路发展的重要问题，repressilator电路的同步更是近年来基因电 路研究的热点。而且对基因电路同步性的研究，有助于理解生物体体现出的各 种自然节律现象，比如心脏在窦房结处的搏动、上视束交叉核处的昼夜节律时钟等。
在基因电路的同步性方面，国外的学者的研究大多集中在时钟电路原型的建 立和性能分析上。Elowitz最先构建了一个由三个抑制子构成的振荡基因网络， 称为repressilator。它不属于生物体内的自然振荡网络，如果动力学参数合理匹 配的话，系统会以规律的周期和幅度振荡，并随细胞的分裂向外传播。Basu构 建了一个人工多细胞系统，接收细胞内含有沖激信号产生电路，周围的发送细 胞产生信号分子之后，接收细胞可以对此信号产生短暂的响应。冲激信号的幅 度和响应时间不仅取决于诱导物最后的浓度，同样取决于诱导物增加的速率， 这样就赋予了系统独特的时空特性。Vilar等人也利用生物体内以24小时为周期的自然时钟网络构造了细胞间的振荡系统。之后的研究对于振荡电路的模型改 进、性能提升、噪声抑制方面都有很大改进。目前，实现细胞间基因电路的同
步的常用方法有耦合机制和外部控制两种。Garcia-Ojalvo借鉴革兰氏阴性菌中 的群体感应机制，利用耦合机制实现了细胞间repressilator的同步。外部控制手 段可以是周期变化的光照、温度或者周期注入的抑制蛋白，前两者虽然是自然 界中普遍存在的时钟同步的方式，但是无论是模型还是可操作性都存在许多未 知的方面。Wang在Garcia-Ojalvo同步电路的勤出上，通过周期注入的自体诱导 分子，限制多细胞网络动力特性趋向一致，对周期和幅度变化范围大的系统同 样适用。但是，这种系统的缺点就是它以转录因子作为各振荡子之间的时钟信 号，这就要求网络内所有门控的启动子都对同一个转录因子敏感，限制了振荡 子的数目；由于自然界中转录因子的抑制子是比较少的，因此效率也不是很高。 或者时钟也可以是由实验者由外部提供的控制信号。以终止基因表达为基础的 开关电路就是这样一种系统。网络中的转录因子和其他信号蛋白均由外加的位 于启动子和基因之间的终止子控制。这种系统很好的满足了系统对于时钟全局 性、易操作性、灵活性的要求，然而终止子和反终止子分别作用于系统内不同 电路时它们之间的相互影响也是不可避免的。
此外，基因电路是与电子电路相对而言的，由于分子生物固有的复杂性和 我们对于基因电路动力学参数依然存在许多不了解的方面，在对基因电路分析 的过程中可以借鉴电子电路中许多成熟的理论和方法。Alexandre在他的论文中 建立了一个类似于基因电路中振荡器的模拟电路，通过比较全局匹配和全局外 部控制的效果，分析多个振荡子之间的同步性。

发明内容
1、 目的本实用新型的目的是提供一种实现细胞间振荡子同步的电路结构， 该电路克服了现有技术的不足，它是基于耦合机制和外部控制两种方法，扬长 避短，优化组合设计而成。其仿真结果显示，相同条件下同步效果更好，可操 作性更强。
2、 技术方案本实用新型一种实现细胞间振荡子同步的电路结构，该电路 由repressilator电路模块、同步信号生成模块以及连接repressilator模块与同步信 号生成模块的细胞间通讯模块三部分组成；所述repressilator电路模块，由 PLteto广d、入Pn-lacI 、 Puaco广tetR三个反相器构成，cl基因取自入喧菌体，lacl基因取自大肠杆菌，tetR基因取自四环素可抑制转位子Tn10, PUet()1、 XPR 、 PLiacoi分别是cI基因、lacl基因、tetR基因可抑制的启动子，PLtet()1-cI的输出接 入PR- lacl的输入，X PR- lacl的输出接PLlac01-tetR的输入，PUac01-tetR的输出接 Puetoi-cl的输入，首尾相接构成回路，其中APR- lacl反相器同时与细胞间通讯 模块的AHL-LuxR连接；所述同步信号生成模块，由PBAD启动子和n基因构成，
n基因取自X嗟菌体，PBAD启动子来自阿拉伯糖操纵子，外部周期注入的L-阿
拉伯糖作为该模块的输入，该模块的输出信号N蛋白作用于细胞间通讯模块的 化3终止子；所述细胞间通讯模块，由P时-luxI反相器及两者之间的tu终止子、 高斯氨酸内酯(AHL)、 LuxR蛋白构成，AHL是一种可自由出入细胞膜的小分 子物质，P冲-luxI反相器的输出信号LuxI蛋白是AHL生成所必需的酶，AHL生 成后与LuxR蛋白的复合物AHL-LuxR是该模块的输出信号，对repressilator电 路模块中的A PR- lacl反相器起诱导作用。
各模块之间的连接是同步信号生成模块的输入为外部控制，即L-阿拉伯
糖浓度，它作为终止信号生成电路的输入，诱导PBAD启动子启动n基因的表达，
输出的N蛋白浓度作用于细胞间通讯模块的tu终止子，发挥反终止作用，控制 各细胞之间耦合的有无及耦合力的大小，细胞间通讯模块的输出信号AHL-LuxR 复合物，可以诱导repressilator模块中lacl基因的表达，由此三个模块构成了完 整的细月包间repressilator同步电路。
工作原理是本实用新型涉及的细胞间repressilator同步电路，通过控制外 部周期注入的L-阿拉伯糖，从而控制N蛋白的产生与否，而在N蛋白浓度为 低时，由于tu的终止作用，Luxl蛋白的表达几乎全被终止，因此各细胞内 repressilator之间几乎没有影响，它们以各自的周期和幅度振荡。当细胞内N蛋 白浓度为高时，Luxl蛋白的表达迅速增加，在Luxl酶的催化作用下，细胞内 产生高斯氨酸内酯(AHL)的小分子物质，这种物质可以通过扩散的方式自由 出入细胞膜，从而通过AHL的浓度变化在细胞之间建立起一种通信机制。而 AHL与LuxR蛋白结合之后对于Lacl蛋白的表达具有诱导作用，当细胞内 AHL浓度发生变化时，相应的会改变LacI蛋白的浓度，也就改变了 repressilator 振荡的周期和相位。仿真结果证实，改变外部注入的周期、幅度、占空比等参 数均会对同步性能的好坏产生一定影响，也就可以得到同步性能较好时，各参 数的范围。
从以上细胞间repressilator同步电路的工作原理中可以看出，不仅利用了细 胞间耦合机制在实现同步时的高效性，同时也借鉴了外部控制手段在实现同步时的灵活、可操作性，综合两种方法，弥补了耦合机制在repressilator周期、相 位差别较大时的耦合不足，減弱了单纯外部控制时，对噪声的敏感。
图1是细胞间repressilator同步电路的示意图。通过控制外部周期注入的L-阿拉伯糖，从而控制N蛋白的产生与否，而在N蛋白浓度为低时，Luxl蛋白 的表达几乎全被终止，因此各细胞内repressilator之间几乎没有影响，它们以各 自的周期和幅度振荡。当细胞内N蛋白浓度为高时，LuxI蛋白的表达迅速增加， 在LuxI酶的催化作用下，细胞内产生高斯氨酸内酯(AHL)的小分子物质，这 种物质可以通过扩散的方式自由出入细胞膜，从而通过AHL的浓度变化在细胞 之间建立起一种通信机制。而AHL与LuxR蛋白结合之后对于CI蛋白的表达 具有诱导作用，当细胞内AHL浓度发生变化时，相应的会改变CI蛋白的浓度， 也就改变了 repressilator }展荡的周期和相位。
图2是repressilator电路的示意图。第一个抑制蛋白lacl,抑制第二个基因 tetR的转录，它的蛋白产物可以抑制第三个基因cl的表达，而CI蛋白又抑制 lacl基因的表达，从而构成一个回环。Repressilator中的三个基因来自于不同的 物种，说明这个基因网络并不是自然界中存在的时钟网络，而是人工合成的， 是人工基因电路的典型代表。
图3是细胞间通讯模块示意图，此模块是附加在repressilator电路上的，目 的是在大量包含repressilator的电路之间建立耦合机制，这里采用的方法就是群 体感应。由革兰氏阴性菌中的群体感应可知，该种群细胞释放出一种信号分子， 可自由出入细胞膜，当环境中该信号分子的浓度累积到一定程度，此信号分子 便于受体蛋白结合形成复合物。该复合物的生成促进了一种酶基因的表达，而 这种酶是后续基因的表达所必须的。
图4是同步信号生成电路模块，由一个可诱导启动子和n基因构成。启动 子Pbad可以被L-阿拉伯糖诱导，同时也受AraC转录因子和环腺苷酸(cAMP ) 调控。当细胞内葡萄糖水平为低时，可满足后两个条件，此时，控制L-阿拉伯 糖的浓度即可以控制N蛋白的表达与否。N蛋白浓度高时，RNA聚合酶通过反 终止蛋白特异性地识別RNA的结构，或与终止子位点的相互作用后，无法识别 终止子，从而继续转录。这个过程类似于门控机制，细胞内不存在反终止蛋白 时，RNA聚合酶转录到终止子处，停止转录，即"开关，，打开，基因无法表达； 反之，细胞内反终止蛋白浓度达到一定范围后，终止子的功能几乎全部被抑制， RNA聚合酶通读终止子，即"开关"关闭，基因得以顺利表达。
3、优点及功效(1 )本实用新型所涉及的利用耦合机制和外部控制手段实现细胞间repressil电 路同步的结构i殳计，克服了耦合机制无法控制同步起始的问题；
(2) 本实用新型所涉及的同步电路，改善了外部控制手段鲁棒性差的缺点，相 同条件下同步效果更好；
(3) 本实用新型所涉及的同步电路，从同步性能参数RX).9时，外部注入的周 期、幅度、占空比等参数的范围，可知该电路具有较好的抗干扰能力；
(4 )本实用新型所涉及的同步电路，各模块均来自与相对研究比较深入的领域, 对模型的仿真基本可以准确反映电路的性能。


图1细胞间repressilator同步电路示意图 图2细胞间通讯模块示意图 图3反终止作用机制示意图 图4 repressilator结构示意图 图中符号说明如下
PLtetoi、入Pr、 PLiacoi、 Ptrp、 Pi3AD代表各启动子；cl、 lacl、 tetR、 luxl、 n 4< 表各基因；luxR是一种群体感应调控蛋白；AHL是高丝氨酸内酯。
具体实施方式
见图1、图2、图3、图4所示， 一种实现细胞间振荡子(repressilator) 同步的电路结构，具体实施如下
本发明一种实现细胞间振荡子同步的电路结构，其设计的电路结构如下 该电路由repressilator电路模块、同步信号生成模块以及连接repressilator模块与 同步信号生成模块的细胞间通讯模块三部分组成；所述repressilator电路模块， 由PLtetoi^cI、人Pr- lacl 、 Puac(h-tetR三个反相器构成，cl基因取自A噬菌体， lacl基因取自大肠杆菌，tetR基因取自四环素可抑制转位子TnlO,Puetcu、 APR 、 Puac。i分别是cl基因、lacl基因、tetR基因可抑制的启动子，PLtet01-cI的输出接 入PR- lacl的输入，入PR- lacl的输出接PUac0i-tetR的输入，PUac014etR的输出接 Plmoi-cl的输入，首尾相接构成回路，其中入Pr- lacl反相器同时与细胞间通讯 模块的AHL-LuxR连接；所述同步信号生成模块，由PBAD启动子和n基因构成， n基因取自入噬菌体，pbad启动子来自阿拉伯糖操纵子，外部周期注入的L-阿拉伯糖作为该模块的输入，该模块的输出信号N蛋白作用于细胞间通讯模块的 tu终止子；所述细胞间通讯模块，由Ptrp-luxl反相器及两者之间的tu终止子、 高斯氨酸内酯(AHL)、 LuxR蛋白构成，AHL是一种可自由出入细胞膜的小分 子物质,P冲-luxI反相器的输出信号Luxl蛋白是AHL生成所必需的酶，AHL生 成后与LuxR蛋白的复合物AHL-LuxR是该模块的输出信号，对repressilator电 路模块中的入PR- lacl反相器起诱导作用。
各模块之间的连接是同步信号生成模块的输入为外部控制，即L-阿拉伯
糖浓度，它作为终止信号生成电路的输入，诱导PBAD启动子启动n基因的表达，
输出的N蛋白浓度作用于细胞间通讯模块的tu终止子，发挥反终止作用，控制 各细胞之间耦合的有无及耦合力的大小，细胞间通讯模块的输出信号AHL-LuxR 复合物，可以诱导repressilator模块中lacl基因的表达，由此三个模块构成了完 整的细月包间repressilator同步电^各。
图1是细胞间repressilator同步电路的示意图。通过控制外部周期注入的L-阿拉伯糖，从而控制N蛋白的产生与否，而在N蛋白浓度为低时，Luxl蛋白 的表达几乎全被终止，因此各细胞内repressilator之间几乎没有影响，它们以各 自的周期和幅度振荡。当细胞内N蛋白浓度为高时，LuxI蛋白的表达迅速增力口， 在LuxI酶的催化作用下，细胞内产生高斯氨酸内酯(AHL)的小分子物质，这 种物质可以通过扩散的方式自由出入细胞膜，从而通过AHL的浓度变化在细胞 之间建立起一种通信才凡制。而AHL与LuxR蛋白结合之后对于CI蛋白的表达 具有诱导作用，当细胞内AHL浓度发生变化时，相应的会改变CI蛋白的浓度， 也就改变了 repressilator振荡的周期和相位。
图2是repressilator模块的示意图。R印ressilator是人工基因电路的典 型代表，它所涉及到的基因来自于不同的物种，包括PUet01-cI、 XPR- lacl 、 PLlacQ1-tetR三个反相器，入PR启动子启动lacl基因的表达，PLtet()i启动子启动cl 基因的表达，Pu禮启动子启动tetR基因的表达，同时，各基因的表达受到抑制 蛋白的抑制作用。入PirlacI的产物lacI蛋白，抑制Puac。广tetR的转录;PLlac01-tetR 的蛋白产物TetR可以抑制Puet(H"Cl的表达;PUetQ1-cI的产物CI蛋白抑制A PR- lacl 的表达，从而构成一个回环。当各反相器参数匹配得当，repressilator处于非稳 态时，Lacl蛋白、CI蛋白、TetR蛋白的浓度会以一定的周期和幅度振荡。
图3是细胞间通讯模块示意图，P^启动子启动luxl基因的表达，但是由于 tL3终止子的终止作用，无法经翻译生成LuxI蛋白，也就无法生成AHL，输出的 AHL-LuxR浓度也为低。当N反终止蛋白浓度大于75nM时，RNA聚合酶在转录的过程中忽略终止子，继续转录并翻译生成Luxl蛋白。Luxl蛋白对AHL的 生成有催化作用，生成AHL之后，由于扩散作用，AHL可自由出入细胞膜，细 胞内的AHL与LuxR蛋白结合后的复合物浓度随AHL浓度的升高随之增高，直 到饱和。
图4是同步信号生成^t块示意图，由PBAD启动子和n基因构成。启动子PBAD 可以被L-阿拉伯糖诱导，同时也受AraC转录因子和环腺苷酸(cAMP )调控。 当细胞内葡萄糖水平为低时，可满足后两个条件，此时，控制L-阿拉伯糖的浓 度即可以控制N蛋白的表达与否。外部控制手段，即L-阿拉伯糖浓度高时，诱 导n基因表达，细胞内N蛋白浓度为高，反之，则细胞内N蛋白浓度为低。
从以上细胞间repressilator同步电路可以看出，它不仅利用了细胞间耦合机 制在实现同步时的高效性，同时也借鉴了外部控制手段在实现同步时的灵活、 可操作性，综合两种方法，弥补了耦合机制在repressilator周期、相位差别较大 时的耦合不足，减弱了单纯外部控制时，对噪声的敏感。
权利要求1、一种实现细胞间振荡子同步的电路结构，其特征在于该电路由repressilator电路模块、同步信号生成模块以及连接repressilator模块与同步信号生成模块的细胞间通讯模块三部分组成；所述repressilator电路模块，由PLtet01-cI、λPR-lacI、PLlac01-tetR三个反相器构成，cI基因取自λ噬菌体，lacI基因取自大肠杆菌，tetR基因取自四环素可抑制转位子Tn10，PLtet01、λPR、PLlac01分别是cI基因、lacI基因、tetR基因可抑制的启动子，PLtet01-cI的输出接λPR-lacI的输入，λPR-lacI的输出接PLlac01-tetR的输入，PLlac01-tetR的输出接PLtet01-cI的输入，首尾相接构成回路，其中λPR-lacI反相器同时与细胞间通讯模块的AHL-LuxR连接；所述同步信号生成模块，由PBAD启动子和n基因构成，n基因取自λ噬菌体，PBAD启动子来自阿拉伯糖操纵子，外部周期注入的L-阿拉伯糖作为该模块的输入，该模块的输出信号N蛋白作用于细胞间通讯模块的tL3终止子；所述细胞间通讯模块，由Ptrp-luxI反相器及两者之间的tL3终止子、高斯氨酸内酯即AHL、LuxR蛋白构成，AHL是一种可自由出入细胞膜的小分子物质，Ptrp-luxI反相器的输出信号LuxI蛋白是AHL生成所必需的酶，AHL生成后与LuxR蛋白的复合物AHL-LuxR是该模块的输出信号；各模块之间的连接是同步信号生成模块的输入为外部控制，即L-阿拉伯糖浓度，它作为终止信号生成电路的输入，输出的N蛋白浓度作用于细胞间通讯模块的tL3终止子，细胞间通讯模块的输出信号是AHL-LuxR复合物。
专利摘要一种实现细胞间振荡子(repressilator)同步的电路结构，它由repressilator电路模块、同步信号生成模块以及细胞间通讯模块组成；所述repressilator电路模块，由P_Ltet01-cI、λP_R-lacI、P_Llac01-tetR三个反相器构成，P_Ltet01-cI的输出接λP_R-lacI的输入，λP_R-lacI的输出接P_Llac01-tetR的输入，P_Llac01-tetR的输出接P_Ltet01-cI的输入，首尾相接构成回路；所述同步信号生成模块，由P_BAD启动子和n基因构成，外部周期注入的L-阿拉伯糖作为该模块的输入，该模块的输出信号N蛋白作用于细胞间通讯模块的t_L3终止子；所述细胞间通讯模块，由P_trp-luxI反相器及两者之间的t_L3终止子、AHL、LuxR蛋白构成，P_trp-luxI反相器的输出信号LuxI蛋白是AHL生成所必需的酶，AHL生成后与LuxR蛋白的复合物AHL-LuxR是该模块的输出信号。其仿真结果显示，该电路在相同条件下同步效果更好，可操作性更强。
文档编号C12M1/42GK201362719SQ20092010508
公开日2009年12月16日 申请日期2009年1月15日 优先权日2009年1月15日
发明者刘志英, 翔 王 申请人:北京航空航天大学