专利名称：具有改进的稳定性的脂肪分解酶变体及编码该变体的多核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有改善的洗涤剂中稳定性的脂肪分解酶变体及制备它们的方法。本 发明特别涉及细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶的脂肪分解酶变体。
背景技术：
已知使用真菌脂肪分解酶，例如，来自细毛嗜热霉(Thermomyceslanuginosus) (同物异名疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa))的脂肪酶，用于多种产业上的目的， 例如，改善洗涤剂的功效。因此，来源于细毛嗜热霉(同物异名疏棉状腐质霉，EP258068 和EP305216)的脂肪酶以商品名Lipolase (Novozyme A/S的产品)出售用作洗涤剂用 途。W0 0060063描述了在洗涤剂溶液中具有特别好的初次洗涤(first-wash)性能的细 毛嗜热霉脂肪酶的变体。除了将脂肪酶用作洗涤剂酶从衣物或其它纺织品去除脂质或脂 肪污迹之外，它们亦用作供面包和其它烘焙产品用的生面团的添加剂，并用于消除在纸浆 和纸生产中的树脂(pitch)问题。在一些应用中，期望具有改善的热稳定性的脂肪分解酶 (EP 374700, W0 9213130)，而在其他应用中期望其在洗涤剂中的稳定性。W0 92/05249, W0 92/19726和W0 97/07202公开了细毛嗜热霉(疏棉状腐质霉)脂肪酶的变体。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及亲本脂肪分解酶的变体，其中所述变体(a)具有与亲 本脂肪分解酶比较包含对如下氨基酸残基的取代的氨基酸序列，所述氨基酸残基对应于 SEQ ID而2的氨基酸27、216、227、231、233和256中的任一；和(b)与亲本脂肪分解酶比 较在洗涤剂中更加稳定。在进一步的方面，本发明涉及编码所述变体的分离的多核苷酸，包含该多核苷酸 的核酸构建体，包含该核酸构建体的重组表达载体，以及包含该核酸构建体或该重组表达 载体的转化的宿主细胞。在进一步的方面，本发明涉及制备权利要求1-9任一所述的脂肪分解酶的方法， 包括下述步骤(a)将包含所述核酸构建体的转化宿主细胞或包含所述重组表达载体的转 化宿主细胞在有益于产生所述变体的条件下进行培养，其中所述核酸构建体或重组表达载 体包含所述多肽；和(b)回收所得变体。在进一步的方面，本发明涉及所述脂肪分解酶变体在羧酸酯的水解，或酯的水解、合成或酯交换中的用途。在进一步的方面，本发明涉及包含所述脂肪分解酶变体的配制物。在进一步的方面，本发明涉及所述脂肪分解酶变体用于生产在洗涤剂中稳定的配 制物的用途。附图简述
图1显示脂肪酶的比对。
序列列表
SEQIDNO1显示编码来自细毛嗜热霉的脂肪酶的DNA序列。
SEQIDNO2显示来自细毛嗜热霉的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:3显示来自反射犁头霉(Absidia reflexa)的脂肪酶的氨基酸序列。
石ilSEQIDNO:4显示来自伞枝犁头霉(Absidia corymb if era)的脂肪酶的氨基酸序夕U °
SEQIDNO:5显示来自曼赫根毛霉(Rhizmucor miehei)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:6显示来自米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:7显示来自黑曲霉(Aspergillus niger)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:8显示来自塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:9显示来自尖镰孢(Fusarium oxysporum)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:10显示来自异孢镰孢(Fusarium heterosporum)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:11显示来自米曲霉(Aspergillus oryzea)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO12显示来自沙门柏干酪青霉(Penicilium camembertii)的脂肪酶的氨基画g序列。
SEQIDNO13显示来自臭曲霉(Aspergillus foetidus)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO14显示来自黑曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO15显示来自米曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO16显示来自Landerinapenisapora的脂肪酶的氨基酸序列。
发明详述
氨基酸修饰的命名法
为了易于参考，在描述本发明的脂肪酶变体时，采用以下命名法
原始氨基酸位置取代氨基酸
根据这种命名法，例如，在位置195中用谷氨酸取代甘氨酸表示为G195E。在相同
的位置缺失甘氨酸表示为G195*，而插入额外的氨基酸残基例如赖氨酸表示为G195GK。与 其它脂肪酶相比，当特定脂肪酶含有“缺失”并且在该位置进行插入的情况，就在位置36插 入天冬氨酸而言，将这种情况表示为*36D。用加号分隔多个突变，即R170Y+G195E，分别表示在位置170用酪氨酸取代精氨 酸，和在位置195用谷氨酸取代甘氨酸。当应用所述排列方法时，X231表示在亲本脂肪分解酶中对应于位置231的氨基 酸。X231R表示用R置换所述氨基酸。就SEQ ID NO :2而言，X是T，因此X231R表示用R 取代位置231的T。当某个位置(例如231)中的氨基酸可以由选自一组氨基酸的另一个氨 基酸取代的情况，例如由R和P和Y组成的组，将这种情况表示为X231R/P/Y。在所有的情况下，采用公认的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。同一性如本文所使用的的术语“同一性”指两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序 列之间的相关性，由参数“同一性”来描述。就本发明而言，通过使用来自EMBOSS软件包(http//emboss, org)版本2. 8. 0的Needle程序来测定两个氨基酸序列之间的比对。Needle程序执行总体比对算法，其在 Needleman，S. B. and ffunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453 中描述。使用的取 代矩阵是BL0SUM62，缺口开启罚分(gap openingpenalty)是10，并且缺口延伸罚分(gap extension penalty)是0.5。本发明的氨基酸序列(“发明序列”；例如SEQ ID NO 2的氨基酸1至269)和不 同氨基酸序列(“外源序列”)之间的同一性程度如下计算用两个序列比对中精确匹配的 数目除以“发明序列”的长度或“外源序列”的长度中最短的一个。将结果表示为百分比同一性。当“发明序列”和“外源序列”在重叠的相同位置中具有同一氨基酸残基时，发生 精确匹配。序列的长度是序列中氨基酸残基的数目(例如SEQ ID NO :2的长度是269)。可以使用上述方法计算同一性和同源性，并用于比对。在本发明的上下文中，同源 性和比对如下所述计算。同源性和比对就本发明而言，可以通过本领域已知的计算机程序的方法适当地测定同源性的程 度，所述程序例如GCG程序包中提供的GAP (Program Manual for theffisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group,575Science Drive, Madison, Wisconsin,USA 53711) (Needleman,S. B. and ffunsch,C. D. , (1970),Journal ofMolecular Biology，48，443-45)，按照以下用于多肽序列比较的设定来使用GAP :GAP产生罚分(GAP creation penalty)为 3.0，和 GAP 延伸罚分(GAP extension penalty)为 0. 1。在本发明中，通过图1中所示的比对来限定反射犁头酶、伞枝犁头酶、曼赫根毛 霉、德氏根霉、黑曲霉、塔宾曲霉、尖镰孢、异孢镰孢、米曲霉、沙门柏干酪青霉、臭曲霉、黑曲 霉、细毛嗜热霉(同物异名疏棉状腐质霉)和Landerinapenisapora的脂肪酶序列中对应 的(或同源的)位置。为了查找比对中没有显示的脂肪酶序列中的同源位置，将目标序列与图1中所述 序列进行比对。通过使用GAP比对将新序列与GAP程序发现的最同源的序列进行比对，将所 述新序列排入图1中的现有比对。GAP在GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group,575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S. B. and ffunsch, C. D. , (1970), Journal of Molecular Biology, 48,443-45)中提供。对于多肽序列比较使用以下设定GAP产生罚分 为3.0且GAP延伸罚分为0. 1。亲本脂肪酶任何合适的脂肪分解酶可用作亲本脂肪分解酶，又称亲本脂肪酶。在一些实施方 案中，所述脂肪分解酶可以是真菌脂肪分解酶。所述脂肪分解酶可以是起源于下述属的酵母脂肪分解酶，例如念珠菌 属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属 (Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)；或 更优选是起源于下述属的丝状真菌脂肪分解酶，例如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属 (Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filobasidium、 镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霄属(Myceliophthora)、新考玛月旨霄属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora) > 拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂褶菌 属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢 壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、嗜热霉属(Thermomyces)或木霉属 (Trichoderma)。所述脂肪分解酶还可以是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏
(Saccharomyces douglasii)、胃 弗 _ fij (Saccharomyces kluyveri)、i若 jftf^ fij (Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)的月旨肪分角军醇。或者，所述脂肪分解酶是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲 霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉、曰本曲霉 (Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉、塔宾 曲霉、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰 抱(Fusarium crookwellense)、大刀键抱(Fusarium culmorum)、禾本禾斗键抱(Fusarium graminearum)、禾赤键抱(Fusarium graminum)、异抱键抱、合欢木键抱(Fusarium negundi)、尖键抱、多枝键抱(Fusarium reticulatum)、粉红键抱(Fusarium roseum)、 接骨木键抱(Fusarium sambucinum)、肤色键抱(Fusariumsarcochroum)、拟分枝抱键 抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色键抱(Fusariumsulphureum)、圆键抱(Fusarium torulosum)、拟丝抱键抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片键抱(Fusarium venenatum)、 特异腐质霉(Humicolainsolens)、细毛嗜热霉(同物异名疏棉状腐质霉)、米赫毛霉 (Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、严紫胄 (Penicillium purpurogenum)、哈H (Trichoderma harzianum) > 宁(Trichoderma koningii)、长枝(Trichoderma longibrachiatum) >M15 (Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)月旨肪分角军酶。在一些实施方案中，本发明涉及是嗜热霉属脂肪酶或细毛嗜热霉脂肪酶的脂肪分 解酶变体。在一些实施方案中，本发明涉及脂肪分解酶变体，其中所述变体与SEQID N0 2至 少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少91%，至少92 %，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%相同。具有改善的洗涤剂中稳定性的脂肪分解酶变体中的改变下面提及的位置是SEQ ID NO :2中氨基酸残基的位置。在段落“同源性和比对” 中，描述了如何在不同脂肪酶中寻找对应或同源位置的氨基酸残基的步骤。所述脂肪分解酶变体，分解脂肪的变体或简称变体，根据本发明，令人惊讶的发现 其与亲本脂肪分解酶相比在洗涤剂中更加稳定。洗涤剂中的稳定性定义为在洗涤剂存在下 保留脂肪分解/脂肪酶活性的品质(quality)。所述脂肪酶活性可以全部或部分保留。因 此本发明的变体在洗涤剂存在下，与其来源的亲本脂肪酶相比，显示了改善的或者全部或 者部分保留其脂肪酶活性的能力。本文所使用的术语“脂肪酶活性”指催化三酰基甘油水解形成二酰基甘油和羧酸 的羧酸酯水解酶活性。就本发明而言，脂肪酶活性根据下述步骤确定脂肪酶的底物通过使用阿拉伯胶作为乳化剂对三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯)进行乳化来制备。随后在30°C下 在pH7或9在pH恒定的滴定实验中水解三丁酸甘油酯。一个单位的脂肪酶活性(1LU)定 义为能够在30°C，pH7下每分钟释出1微摩尔的丁酸的酶量。在一些实施方案中，将根据本发明的变体与参照酶相比。除非另行指出，本文所使 用的术语“参照酶”或“参照脂肪酶”指具有T231R+N233R的取代的SEQ ID NO :2的成熟部 分。在一些实施方案中，本发明涉及亲本脂肪分解酶的变体，其中所述变体(a)具有 与亲本脂肪分解酶相比包含对如下氨基酸残基的取代的氨基酸序列，所述氨基酸残基对应 于SEQ ID NO :2的氨基酸27、216、227、231、233和256中的任一；并(b)与所述亲本脂肪分 解酶相比在洗涤剂中更加稳定。在一些实施方案中，本发明涉及亲本脂肪分解酶的变体，其中所述变体(a)包含 氨基酸残基231和233，并具有与亲本脂肪分解酶相比包含对至少一个对应于SEQ ID NO 2的氨基酸27、216、227和256中任一的氨基酸残基的取代的氨基酸序列；并(b)与所述亲 本脂肪分解酶相比在洗涤剂中更加稳定。在一些实施方案中，本发明涉及亲本脂肪分解酶的变体，其中所述变体具有在位 置231+233和下述之一处的氨基酸改变(a) 27 ； (b) 216 ；或(c) 256 ；任选地所述变体进一 步包含227 ；其位置对应于SEQ ID NO :2。在一些实施方案中，本发明涉及下述变体，其中氨基酸残基的取代是SEQID N0:2 的 27R，216P, 227G, 231R, 233R 或 256K 之一。在一些实施方案中，本发明涉及下述变体，其中氨基酸残基的取代是SEQID N0:2 的 D27R, S216P, L227G, T231R, N233R 或 P256K 之一。在一些实施方案中，本发明涉及下述变体，该变体包含选自下组的取代a) T231R+N233R+P256K ；(b)L227G+T231R+N233R ； (c)L227G+T231R+N233R+P256K ； (d) D27R+T231R+N233R ； (e) D27R+L227G+T231R+N233R ；和(f) S216P+T231R+N233R。在一些实施方案中，本发明涉及下述变体，其中亲本脂肪分解酶与SEQID NO 2至 少50 %，至少60 %，至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少91%，至少 92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100% 相同。在一些实施方案中，本发明涉及下述变体，其中亲本脂肪分解酶是由细毛嗜热霉 DSM4109产生，并具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的脂肪酶。在一些实施方案中，本发明涉及下述变体，其中所述洗涤剂是液体洗涤剂。表1 可能包含于脂肪分解酶变体中的变化
权利要求
一种亲本脂肪分解酶的变体，其中所述变体a)具有与亲本脂肪分解酶相比包含对如下氨基酸残基的取代的氨基酸序列，所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO2的氨基酸27、216、227、231、233和256中的任一；和b)与所述亲本脂肪分解酶相比在洗涤剂中更加稳定。
2.一种亲本脂肪分解酶的变体，其中所述变体a)包含氨基酸残基231和233，并具有与亲本脂肪分解酶相比包含对至少一个如下氨 基酸残基的取代的氨基酸序列，所述氨基酸残基对应于SEQ IDNO 2的氨基酸27、216、227 和256中的任一；和b)与所述亲本脂肪分解酶相比在洗涤剂中更加稳定。
3.一种亲本脂肪分解酶的变体，其中所述变体在位置231+233和下述之一处具有氨基 酸改变a)27 ；b)216；或c)256；任选地所述变体进一步包含227 ；这些位置对应于SEQ ID NO :2。
4 权利要求1-4所述的变体，其中所述氨基酸残基的取代是SEQID N0:2&27R，216P， 227G, 231R, 233R 或 256K 之一。
5.权利要求1-5所述的变体，其中所述氨基酸残基的取代是SEQID NO 2的D27R， S216P, L227G, T231R, N233R 或 P256K 之一。
6.权利要求1-6所述的变体，其中所述变体包含选自下组的取代a)T231R+N233R+P256K；b)L227G+T231R+N233R；c)L227G+T231R+N233R+P256K；d)D27R+T231R+N233R；e)D27R+L227G+T231R+N233R；和f)S216P+T231R+N233R0
7.权利要求1-6所述的变体，其中所述亲本脂肪分解酶与SEQID NO :2至少50%，至 少60%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少 97%，至少98%，至少99%或100%相同。
8.权利要求1-6所述的变体，其中其亲本脂肪分解酶是由细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)DSM4109产生并具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的脂肪酶。
9.权利要求1-8所述的变体，其中所述洗涤剂是液体洗涤剂。
10.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-9任一所述的变体。
11.一种包含权利要求10的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可操作地连 接于至少一个指导该变体在表达宿主中产生的调控序列。
12.—种重组表达载体，其包含权利要求11的核酸构建体。
13.一种转化的宿主细胞，其包含权利要求11的核酸构建体或权利要求12的重组表达 载体。
14.一种制备权利要求1-9任一所述的脂肪分解酶变体的方法，包括下述步骤a)在有益于所述变体产生的条件下培养转化的宿主细胞，所述宿主细胞包含含有所述多肽的重组表达载体或核酸构建体；和b)回收所述变体。
15.一种产生权利要求1-9任一所述的脂肪分解酶变体的方法，包括下述步骤a)选择亲本脂肪分解酶，b)在所述亲本脂肪分解酶中取代至少一个对应于SEQID N0:2的27、216、227、231、 233和256中任一的氨基酸残基，c)任选地改变除了(b)中提及的之外的一个或多个氨基酸，d)制备由步骤(a)-(c)所得的变体，e)测试洗涤剂中所述变体的稳定性，f)选择具有增加的洗涤剂中稳定性的变体，和g)产生选择的变体。
16.权利要求1-9任一所述的脂肪分解酶变体在羧酸酯水解中的用途。
17.权利要求1-9任一所述的脂肪分解酶变体在酯的水解、合成或酯交换中的用途。
18.—种配制物，其包含权利要求1-9任一所述的脂肪分解酶变体。
19.权利要求18的配制物，其中所述配制物可为液体配制物。
20.权利要求1-9任一所述的脂肪分解酶变体用于制备在洗涤剂中稳定的配制物的用
全文摘要
本发明提供了具有改进的洗涤剂中稳定性的脂肪分解酶变体和对其进行编码的多核苷酸。具有改进的洗涤剂中稳定性的脂肪分解酶变体通过在亲本脂肪分解酶中取代某些指定氨基酸残基来获取。
文档编号C12N9/20GK101990573SQ200980107002
公开日2011年3月23日 申请日期2009年2月26日 优先权日2008年2月29日
发明者克里斯琴·I·乔尔根森, 利斯·M·米克尔森, 杰斯珀·文德, 沙姆坎特·A·帕特卡, 罗伯特·范德兰斯, 金·博施, 阿伦·斯文德森 申请人:诺维信公司