制备活性高度磷酸化人溶酶体硫酸酯酶及其应用的制作方法

专利名称：制备活性高度磷酸化人溶酶体硫酸酯酶及其应用的制作方法
制备活性高度磷酸化人溶酶体硫酸酯酶及其应用
本申请要求以前申请的优先权2008你那1月18日提交的美国临时专利申请号 61/022,179 ； 2008年9月23日提交的美国临时专利申请号61/099,373和2008年10月31 日提交的美国临时专利申请号61/110,M6，它们的说明书通过引用纳入本文。发明领域
本发明涉及细胞和分子生物学及医学的技术领域，特别是涉及制备制备活性高 度磷酸化人溶酶体硫酸酯酶及其在控制溶酶体硫酸酯酶缺乏相关的溶酶体贮积症中的应 用。具体地说，本发明涉及制备活性高度磷酸化重组人N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶 (GALNS)及其在控制粘多糖贮积病IVa型(MPS IVa或莫尔基奥A综合征)和GALNS缺 乏相关的其它溶酶体贮积症中的应用。
发明领域
细胞内对于溶酶体中细胞废物降解至关重要的特定溶酶体酶的缺乏导致溶酶体 贮积症(LSD)。此类溶酶体酶的缺乏导致未降解的“储存物质”在溶酶体内累积，从而 导致溶酶体肿胀和功能失调，最终导致细胞和组织破坏。大量溶酶体酶现已得到鉴定并 与它们相关疾病有关。一旦鉴定到缺失的酶，则治疗可简化为将替代酶有效递送至患者 的受影响组织的单一问题。
治疗溶酶体贮积症的一种方法是静脉内酶替代治疗(ERT) (Kakkis，ExpertOpin. Investig.Drags 11(5) 675-685，2002)。ERT利用脉管系统将酶从单一的给药部位携带至 大多数组织。一旦该酶广泛分布，其必须被摄取入细胞。溶酶体酶的独特特征是摄取入 细胞的基础。溶酶体酶构成由末端甘露糖残基6-位的磷酸确定的单独一类糖蛋白。大多 数细胞表面上发现的受体与甘露糖-6-磷酸高亲和力和特异性结合(Munier-Lehmarai等， Biochem.Soc.Trans.24(l) 133-136，1996 ； Marnell 等，J.Cell.Biol.99 (6) 1907-1916， 1984)。甘露糖-6-磷酸受体(MPR)的每条多肽链具有两个甘露糖_6_磷酸结合位点 (Tong等，J.Biol.Chem.264 7962-7969，1989)，该受体指导从血液中摄取酶至组织，然 后介导胞内定向于溶酶体。
大规模生产溶酶体酶涉及在哺乳动物细胞系中表达。其目标是使得重组酶主要 分泌入周围的生长环境以便收集和下游加工。在大规模生产溶酶体酶的理想系统中，酶 会被有效磷酸化，然后主要导向细胞表面(即，分泌)，而不是主要导向溶酶体。如上 所述，磷酸化溶酶体酶的这种分配与正常细胞中发生的正好相反。制备用于溶酶体酶生 产的细胞系致力于最大程度提高酶摩尔酶中甘露糖-6-磷酸的水平，但其特征在于单位 生产率(specific productivity)低。在产生含有高水平甘露糖_6_磷酸部分的溶酶体酶的体 外努力获得矛盾的成功(Canfield等，美国专利号6,537,78 。体外酶显示高水平的甘露 糖-6-磷酸以及高水平的未修饰末端甘露糖。甘露糖-6-磷酸和甘露糖受体之间对于溶 酶体酶的竞争导致需要高剂量的酶以产生效力，还导致更高的免疫原性从而对所治疗对 象有害。
硫酸酯酶构成溶酶体酶的独特亚类。硫酸酯酶从各种底物，包括例如类固醇、碳水化合物、蛋白聚糖和糖脂上切割硫酸酯。所有已知的真核硫酸酯酶在其催化位点含 有半胱氨酸残基。硫酸酯酶活性需要将该半胱氨酸残基翻译后修饰成Ca-甲酰甘氨酸 (FGly)。半胱氨酸到FGly的翻译后酶活化发生在内质网内，在翻译后立即进行，而在将 硫酸酯酶靶向溶酶体之前(Dierks 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94 11963-11968，1997)。 催化该反应的甲酰甘氨酸产生酶是硫酸酯酶修饰因子1 6UMF1)。突出该独特的翻译后 修饰的重要性是因为SUMFl中的突变导致溶酶体硫酸酯酶中FGly形成受损，从而在人 中导致多发性硫酸酯酶缺乏症(MSD) (Diez-Ruiz 等，Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.6 355-379, 2005)。
因此，溶酶体硫酸酯酶制品的疗效取决于甘露糖-6-磷酸的水平以及该制品中 是否存在活性酶。
因此，本领域需要有效的生产系统以便大规模制备治疗有效的、活性的高度磷 酸化溶酶体硫酸酯酶，从而能控制此类溶酶体硫酸酯酶缺乏所致或与之相关的溶酶体贮 积症。
发明概述
本发明涉及以下发现，当内含体酸化缺陷型CHO-Kl细胞系衍生物(指定为 G71)经工程改造表达重组人硫酸酯酶修饰因子1 6UMF1)时，该修饰的G71细胞部分通 过防止生产细胞系的溶酶体区室的物质丧失而产生大量活性的高度磷酸化重组溶酶体硫 酸酯酶。在一个实施方式中，本发明提供的END3互补组细胞系共同表达重组人SUMF 1和重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，从而导致高产量的活性高度磷酸化 酶。示范性细胞系是G71、G71S及其保留了 G71所需特性，S卩，产生大量活性高度磷 酸化重组溶酶体硫酸酯酶的能力的衍生物。共同表达重组人SUMFl和重组溶酶体硫酸酯 酶的END3互补组修饰CHO-Kl细胞系的此类应用对于制备通过酶替代治疗(ERT)而用 于控制溶酶体贮积症的活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶尤其有用。
在第一方面，本发明的特征在于在END3互补组CHO细胞系或其衍生物中产生 活性高度磷酸化重组人溶酶体硫酸酯酶或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物的 新型方法，它们的产生量能用于其治疗性应用。在广泛的实施方式中，该方法包括以下 步骤(a)培养CHO-衍生的END3互补组细胞或其衍生物；(b)制备能在CHO-衍生的 END3互补组细胞或其衍生物中表达活性高度磷酸化重组人溶酶体硫酸酯酶或其生物学活 性片段、突变体、变体或其衍生物的第一哺乳动物表达载体；(c)制备能在CHO-衍生的 END3互补组细胞或其衍生物中表达重组人硫酸酯酶修饰因子1 6UMF1)或其生物学活性 片段、突变体、变体或衍生物的第二哺乳动物表达载体；(d)用所述第一和第二表达载 体转染所述CHO-衍生的END3互补组细胞或其衍生物；(e)选择和克隆表达活性高度磷 酸化重组人溶酶体硫酸酯酶或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物的CHO-衍生 的END3互补组细胞或其衍生物的转染子；和(f)优化细胞培养方法以便产生高度磷酸化 的重组人溶酶体硫酸酯酶或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物。重组人溶酶体 硫酸酯酶选自芳基硫酸酯酶A (ARSA)、芳基硫酸酯酶B (ARSB)、艾杜糖醛酸_2_硫 酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶6GSH)、N-乙酰葡萄糖胺-硫酸酯酶 (G6S)和N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。
该方法包括以下步骤将编码所有或部分溶酶体硫酸酯酶的CDNA和编码所有或部分人SUMFl的cDNA转染入CHO-衍生的END3互补组细胞或其衍生物。在一些 实施方式中，将能分别表达所编码的活性高度磷酸化重组人溶酶体硫酸酯酶和人SUMFl 的所述第一和第二表达载体同时转染入CHO-衍生的END3互补组细胞或其衍生物。在 一些实施方式中，所述第一和第二表达载体顺序转染入CHO-衍生的END3互补组细胞或 其衍生物。在一些实施方式中，利用编码全长人溶酶体硫酸酯酶的cDNA，而在其它实施 方式中，利用编码其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物的cDNA。在一些实施方 式中，利用编码全长人SUMFl的cDNA，而在其它实施方式中，利用编码其生物学活性 片段、突变体、变体或衍生物的cDNA。在一些实施方式中，利用多个表达载体将人溶 酶体硫酸酯酶和人SUMFlcDNA同时或顺次递送入CHO-衍生的END3互补组细胞或其 衍生物。在一些实施方式中，利用单个表达载体将人溶酶体硫酸酯酶和人SUMFlcDNA 同时或顺次递送入CHO-衍生的END3互补组细胞或其衍生物。在优选的实施方式中， CHO-衍生的END3互补组细胞或其衍生物是G71细胞系、G71S细胞系或G71或G71S 衍生物。
在优选的实施方式中，该方法包括从END3互补组CHO细胞系或其衍生物产 生活性高度磷酸化重组人溶酶体硫酸酯酶，例如芳基硫酸酯酶A(ARSA)、芳基硫酸酯酶 B (ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素_N_硫酸酯酶6GSH)、 N-乙酰葡萄糖胺-硫酸酯酶(G6S)或N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在特别 优选的实施方式中，该方法包括从END3互补组CHO细胞系或其衍生物产生活性高度磷 酸化重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。END3互补组细胞系是保留END3 互补组细胞系的特性，例如内含体酸化缺陷的任何修饰CHO细胞系。在优选的实施方式 中，CHO-衍生的END3互补组细胞或其衍生物是G71细胞系、G71S细胞系或G71或 G7IS衍生物。
在第二方面，本发明提供特征在于产生活性高度磷酸化重组人溶酶体硫酸酯酶 能力的内含体酸化缺陷型哺乳动物细胞系，它们的产生量能治疗性利用溶酶体硫酸酯 酶。在优选的实施方式中，本发明提供指定为G71、G71S或其衍生物的CHO-Kl-衍 生的END3互补组细胞系，这些细胞系能产生大量活性高度磷酸化重组人溶酶体硫酸酯 酶，从而能大规模生产此类治疗性溶酶体硫酸酯酶。在更优选的实施方式中，该细胞系 表达和分泌至少约0.5、优选至少约0.75、更优选至少约1.0、甚至更优选至少约1.25皮克 /细胞/天的重组人溶酶体硫酸酯酶。
END3互补组细胞系是保留END3互补组细胞系的特性，例如内含体酸化缺陷的 任何修饰CHO细胞系。在一个实施方式中，END3互补组CHO细胞系衍生自G71或其 衍生物，包含(a)重组人硫酸酯酶修饰因子KSUMF1)的表达载体和(b)重组人溶酶体 硫酸酯酶的表达载体，其中所述重组人溶酶体硫酸酯酶选自芳基硫酸酯酶A(ARSA)、 芳基硫酸酯酶B (ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素_N_硫酸 酯酶6GSH)、N-乙酰葡萄糖胺-硫酸酯酶(G6S)和N-乙酰半乳糖胺_6_硫酸酯酶 (GALNS)。在优选的实施方式中，END3互补组CHO细胞系包含重组人N-乙酰半乳糖 胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的表达载体。在更优选的实施方式中，END3互补组CHO细 胞系表达和分泌重组人GALNS。在另一优选的实施方式中，END3互补组CHO细胞系 选自克隆4、克隆5、克隆C6、克隆C2、克隆C5、克隆C7、克隆C10、克隆Cll和克隆C30。在更优选的实施方式中，END3互补组CHO细胞系是克隆C2。在另一优选 的实施方式中，END3互补组CHO细胞系选自适合于悬浮生长。
在第三方面，本发明提供按照本发明方法产生的重组人溶酶体硫酸酯酶，从而 其含量能治疗性应用该溶酶体硫酸酯酶。该溶酶体硫酸酯酶可以是全长蛋白质，或其 片段、突变体、变体或衍生物。在一些实施方式中，可视需要修饰本发明的溶酶体硫酸 酯酶或其片段、突变体、变体或衍生物以提高其稳定性或药代动力学特性(例如，PEG 化、诱变、融合、偶联)。在优选的实施方式中，该酶是溶酶体硫酸酯酶、具有天然硫 酸酯酶的生物学活性的人溶酶体硫酸酯酶片段、或与人溶酶体硫酸酯酶的氨基酸序列基 本同源的多肽。在一些实施方式中，溶酶体硫酸酯酶是人或哺乳动物序列、来源或起源 的蛋白质。在其它实施方式中，溶酶体硫酸酯酶是其缺乏导致人类疾病的酶，例如异染 性脑白质营养不良或MLD(即，芳基硫酸酯酶A(ARSA))、马-兰二氏综合征或MPS VI (即，芳基硫酸酯酶B (ARSB))、亨特综合征或MPS II (即，艾杜糖醛酸_2_硫酸酯酶 (IDS))、桑菲列普A综合征或MPS IIIa(即，磺酰胺酶/肝素_N_硫酸酯酶6GSH))、 桑菲列普D综合征或MPS IIId(即，N-乙酰葡萄糖胺-硫酸酯酶(G6S))和莫尔基奥A 综合征或MPSIVa(即，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))。在特别优选的实施 方式中，溶酶体硫酸酯酶是其缺乏导致莫尔基奥A综合征或MPS IVa的酶(即，N-乙 酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))。在另一特别优选的实施方式中，溶酶体硫酸酯酶 是其缺乏与人类疾病有关的酶，例如多发性硫酸酯酶缺乏症或MSD(即，N-乙酰半乳糖 胺-6-硫酸酯酶(GALNS))。
溶酶体硫酸酯酶还可以是人或哺乳动物序列来源或起源的。在还有其它的本发 明实施方式中，在各方面，溶酶体硫酸酯酶的氨基酸序列与人或哺乳动物溶酶体硫酸酯 酶氨基酸序列的相应部分相同。在其它实施方式中，多肽部分是人或哺乳动物的天然溶 酶体硫酸酯酶。在其它实施方式中，溶酶体硫酸酯酶多肽在该多肽的至少约25、50、 100、150或200个氨基酸的长度或全长上与人或哺乳动物酶的天然溶酶体硫酸酯酶氨基 酸序列基本上同源(即，氨基酸序列有至少约80%、85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%相同)。在其它实施方式中，给予溶酶体硫酸酯酶的对象是人。
在优选的实施方式中，溶酶体硫酸酯酶是内含体酸化缺陷型细胞系，例如 CHO-衍生的END3互补组细胞系产生的高度磷酸化的重组人溶酶体硫酸酯酶。END3 互补组细胞系是保留END3互补组细胞系的特性，例如内含体酸化缺陷的任何修饰CHO 细胞系。在优选的实施方式中，CHO-衍生的END3互补组细胞或其衍生物是G71细胞 系、G71S细胞系或G71或G71S衍生物。
在更优选的实施方式中，重组人溶酶体硫酸酯酶具有高水平的磷酸化寡糖 (即，每条蛋白质链高于约0.25，优选高于0.5，更优选高于约0.75的双-磷酸化寡聚 甘露糖链)。在甚至更优选的实施方式中，该酶是高度磷酸化的重组人N-乙酰半乳糖 胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。
在更优选的实施方式中，重组人溶酶体硫酸酯酶的高百分比(即，至少约 50%,优选至少约70%、更优选至少约90%、甚至更优选至少约95% )活性位点半胱氨 酸残基转变成Ca-甲酰甘氨酸(FGly)。在甚至更优选的实施方式中，该酶是活性重组人 N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。
在更尤其优选的实施方式中，重组人溶酶体硫酸酯酶具有高水平的磷酸化寡糖 (即，每条蛋白质链高于约0.25，优选高于0.5，更优选高于约0.75的双-磷酸化寡聚甘露 糖链)和高百分比(即，至少约50%、优选至少约70%、更优选至少约90%、甚至更优 选至少约95% )的活性位点半胱氨酸残基转变成Ca-甲酰甘氨酸(FGly)。在最尤其优选 的实施方式中，该酶是活性高度磷酸化重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。
在第四方面，本发明提供通过本发明方法产生纯化重组人溶酶体硫酸酯酶的方 法。在优选的实施方式中，采用包括以下至少5个纯化步骤的双-柱方法纯化溶酶体硫酸 酯酶(染料-配体层析，例如蓝色-琼脂糖(Bhie-Sepharose)，和阴离子交换层析，例如 SEHi-Cap) (1)过滤收集物，即，表达人硫酸酯酶修饰因子I(SUMFl)和重组人溶酶体 硫酸酯酶的END3互补组CHO细胞系或其衍生物的培养介质；( 将经过滤的收集物的 pH调节至pH 4.5(为诱导污染性蛋白质沉淀)；( 将pH-调节过的过滤收集物加载到染 料-配体柱，例如蓝色-琼脂糖柱上，洗涤该柱并将溶酶体硫酸酯酶从该柱洗脱；(4)将 染料-配体柱的洗脱液加载到阴离子交换柱，例如SE Hi-Cap柱上，洗涤该柱并将溶酶体 硫酸酯酶从该柱洗脱；和( 超滤和透析阴离子交换的洗脱液。任选先通过超滤将步骤 (1)中经过滤的收集物浓缩10-20倍，再调节pH。任选在配制缓冲液中配制步骤(5)中 的超滤和透析的溶酶体硫酸酯酶。在特别优选的实施方式中，溶酶体是重组人N-乙酰半 乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。
在另一优选的实施方式中，采用包括以下至少5个纯化步骤的三-柱方法纯化 溶酶体硫酸酯酶(捕捉层析，例如阴离子交换SE Hi-Cap;中间层析，例如染料-配体 Capto BlueZinc> 螯合琼脂糖 FF 或 Capto 附着；润饰层析(polishing chromatography)，例 如，ToyoPearl Butyl 650M、苯基琼脂糖Hi-Sub或苯基琼脂糖Low-Sub) (1)通过，例如 Sartoon盒，(lOkDa，Hydrosart)过滤收集物，S卩，表达人硫酸酯酶修饰因子1 6UMF1) 和重组人溶酶体硫酸酯酶的END3互补组CHO细胞系或其衍生物的培养介质；( 将经 过滤的收集物的pH调节至pH 4.5(为诱导污染性蛋白质沉淀)；( 将pH-调节过的过 滤收集物加载到捕捉柱，例如FractogeIEMDSEHi-CAP(M)阴离子交换柱上，洗涤该柱 并将溶酶体硫酸酯酶从该柱洗脱；(4)将捕捉柱的洗脱液加载到中间柱，例如染料-配体 Capto BlueZinc^螯合琼脂糖FF或Capto附着柱上，洗涤该柱并将溶酶体硫酸酯酶从该柱 洗脱;和(5)将洗脱液加载到润饰柱，例如ToyoPearl Butyl 650M、苯基琼脂糖Hi-Sub或 苯基琼脂糖Low-Sub上，洗涤该柱并将溶酶体硫酸酯酶从该柱洗脱。在配制缓冲液中配 制步骤(5)中的洗脱的溶酶体酶。任选超滤步骤(5)的洗脱的溶酶体硫酸酯酶并在配制 缓冲液中配制。任选将步骤(4)中柱的溶酶体硫酸酯酶接触pH3.5以便先在低pH灭活病 毒再加载到步骤( 的润饰柱上。在特别优选的实施方式中，溶酶体是重组人N-乙酰半 乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。
在第五方面，本发明提供纯化的活性高度磷酸化重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫 酸酯酶(GALNS)或其生物学活性突变体、变体或衍生物，它们可用于治疗患有GALNS 酶缺陷导致的(例如，粘多糖贮积病IVa型(MPSIVa)或莫尔基奥A综合征)或与之相 关(多发性硫酸酯酶缺乏症(MSD))的溶酶体贮积症的对象。在优选的实施方式中，纯 化的活性高度磷酸化重组人GALNS (a)非还原性条件下进行SDS-PAGE时，考马斯 蓝染色测定到纯度为至少约90% ； (b)53位的半胱氨酸残基有至少约90%转变成Ca-甲酰甘氨酸(FGly)；和(C)在178和397位天冬酰胺残基处是N-连接糖基化的，其中连 接于178位天冬酰胺残基的至少约50%的寡聚甘露糖链双-磷酸化。还原条件下进行 SDS-PAGE时，纯化的活性高度磷酸化重组人GALNS由约55_60kDa的主要条带(即， 前体人GALNS是可见蛋白质的至少约75%、优选至少约85%、更优选至少约90%和甚 至更优选至少约95% )和约39kDa及约19kDa的次要条带(即，成熟或加工的人GALNS 是可见蛋白质的少于约25%、优选少于约15%、更优选少于约10%、甚至更优选少于约 5%)构成。在特别优选的实施方式中，还原条件下进行SDS-PAGE时，纯化的活性高 度磷酸化重组人GALNS基本上由约55-60kDa的单一条带(即，前体人GALNS)构成。 在一个实施方式中，纯化的活性高度磷酸化重组人GALNS可用于治疗MPS IVa或莫尔 基奥A综合征。在一个实施方式中，纯化的活性高度磷酸化重组人GALNS可用于治疗 MSD。
在第六方面，本发明提供治疗完全或部分由溶酶体硫酸酯酶缺乏导致或与之有 关的疾病的方法。该发包括给予本发明方法产生的治疗性重组人溶酶体硫酸酯酶，其中 所述溶酶体硫酸酯酶结合MPR受体，经细胞膜转运，进入细胞并递送至细胞内的溶酶 体。
在一个实施方式中，该方法包括治疗患有溶酶体硫酸酯酶缺乏的对象，包括 给予有此需要的对象治疗有效量的所述溶酶体硫酸酯酶，其中所述溶酶体硫酸酯酶是 CHO-衍生的END3互补组细胞或其衍生物产生重组人溶酶体硫酸酯酶或其生物学活性片 段、突变体、变体或衍生物。在一些实施方式中，该方法包括单独给予或与药学上可接 受的运载体、稀释剂或赋形剂联合给予治疗性重组人溶酶体硫酸酯酶或其生物学活性片 段、突变体、变体或衍生物。优选的实施方式包括根据待治疗对象，优选哺乳动物，最 优选人的需求优化剂量，从而最有效改进溶酶体硫酸酯酶的缺乏。
此类治疗性溶酶体硫酸酯酶尤其可用于，例如治疗患有溶酶体硫酸酯酶缺乏所 致溶酶体贮积症的患者，例如患有以下疾病的患者异染性脑白质营养不良或MLD、粘 多糖贮积病VI型(MPSVI)或马-兰二氏综合征、粘多糖贮积病II型(MPSII)或亨特综 合征、粘多糖贮积病IIIa型(MPSIIIa)或桑菲列普A综合征、粘多糖贮积病IIId型(MPS IIId)或桑菲列普D综合征、和粘多糖贮积病IVa型(MPS IVa)或莫尔基奥A综合征。在 尤其优选的实施方式中，溶酶体贮积症是MPS IVa或莫尔基奥A综合征，而溶酶体硫酸 酯酶是重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在还有其它实施方式中，本发 明还提供包含导致溶酶体贮积症的缺乏的溶酶体硫酸酯酶和药学上可接受的运载体、稀 释剂或赋形剂的药物组合物。
在另一实施方式中，该方法包括治疗患有与一种或多种溶酶体硫酸酯酶缺乏有 关的溶酶体贮积症的对象，包括给予有此需要的对象治疗有效量的溶酶体硫酸酯酶，其 中所述溶酶体硫酸酯酶是CHO-衍生END3互补组细胞或其衍生物产生的重组人N-乙酰 半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物。在一 些实施方式中，该方法包括单独或与药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂组合给予 治疗性重组人GALNS酶或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物。在尤其优选的 实施方式中，溶酶体贮积症是多发性硫酸酯酶缺乏症(MSD)。
在尤其优选的实施方式中，CHO-衍生END3互补组细胞或其衍生物是G71细胞系、G71S细胞系或其G71或G71S衍生物系。
在还有另一实施方式中，本发明提供酶替代治疗方法，该方法给予需要酶替代 治疗的对象治疗有效量的溶酶体硫酸酯酶，从而足够量的溶酶体硫酸酯酶进入溶酶体以 防止或减少对细胞的破坏，其中患者细胞的溶酶体含有的溶酶体硫酸酯酶量不足以防止 或减少对细胞的破坏。细胞可以在或不在CNS内，或无需通过毛细血管壁而从血液中隔 开，毛细血管壁的内皮细胞紧密封闭从而通过紧密连接(防止)活性剂扩散。
在特定的实施方式中，本发明提供包含活性重组人溶酶体硫酸酯酶的组合物和 药物组合物，该酶具有的生物学活性在目标溶酶体中降低、不足或不存在，该酶给予对 象。优选的活性人溶酶体硫酸酯酶包括但不限于芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、 艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶、N-乙酰葡萄糖胺-硫酸酯酶 和N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。在优选的实施方式中，N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸 酯酶是活性重组人溶酶体硫酸酯酶。
在优选的实施方式中，本发明提供通过给予对象治疗有效量的重组人N-乙酰半 乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)来治疗患有MPS IVa或莫尔基奥A综合征或MSD的对象 的方法，其中所述重组人GALNS的活性位点半胱氨酸残基高水平地转变成Ca-甲酰甘氨 酸(FGly)(即，至少约50%、优选至少约70%、更优选至少约90%、甚至更优选至少约 95%转变)并且磷酸化水平高(即，每条蛋白质链高于约0.25，优选高于0.5，更优选高 于约0.75的双-磷酸化寡聚甘露糖链)。
在更优选的实施方式中，本发明提供通过给予对象治疗有效量的END3互补组 细胞产生的重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)来治疗患有MPS IVa或莫尔 基奥A综合征或MSD的对象的方法，其中所述重组人GALNS的活性位点半胱氨酸残基 高水平地转变成Ca-甲酰甘氨酸(FGly)(即，至少约50%、优选至少约70%、更优选至 少约90%、甚至更优选至少约95%转变)并且磷酸化水平高(即，每条蛋白质链高于约 0.25，优选高于0.5，更优选高于约0.75的双-磷酸化寡聚甘露糖链)。
在特别优选的实施方式中，本发明提供通过给予对象治疗有效量的纯化的高度 磷酸化重组人GALNS来治疗患有MPS IVa或莫尔基奥A综合征或MSD的对象的方法， 所述GALNS具有(a)非还原性条件下进行SDS-PAGE时，考马斯蓝染色测定到纯度为 至少约90%; (b) 53位的半胱氨酸残基有至少约90%转变成Ca-甲酰甘氨酸(FGly)；和 (C)在178和397位天冬酰胺残基处是N-连接糖基化的，其中连接于178位天冬酰胺残 基的至少约50%的寡聚甘露糖链双-磷酸化。还原条件下进行SDS-PAGE时，纯化的活 性高度磷酸化重组人GALNS由约55-60kDa的主要条带(即，前体人GALNS是可见蛋 白质的至少约75%、优选至少约85%、更优选至少约90%和甚至更优选至少约95%)和 约39kDa及约19kDa的次要条带(即，成熟或加工的人GALNS是可见蛋白质的少于约 25%,优选少于约15%、更优选少于约10%、甚至更优选少于约5%)构成。在更尤其优 选的实施方式中，还原条件下进行SDS-PAGE时，纯化的活性高度磷酸化重组人GALNS 基本上由约55-60kDa的单一条带(即，前体人GALNS)构成。
在一些实施方式中，对象患有MPS IVa或莫尔基奥A综合征。在一些实施方式 中，对象患有MSD。
还考虑了本发明的活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶在制备治疗上述溶酶体贮积症的药物中的相应应用，该酶优选由本发明方法制备。
在第7方面，本发明提供包含本文上述活性高度磷酸化重组人溶酶体硫酸酯酶 和一种或多种药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物，该酶可用于治疗 完全或部分由此类溶酶体硫酸酯酶缺乏导致或与之有关的疾病。在优选的实施方式中， 药物组合物包含本发明方法产生的活性高度磷酸化重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶 (GALNS)或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物以及一种或多种药学上可接受的 运载体、稀释剂或赋形剂。此类药物组合物可适合通过数种途径给予，例如鞘内、胃肠 外、局部、鼻内、吸入或口服给予。在优选的实施方式中，所述药物组合物适用于胃肠 外给予。属于该方面范围的实施方式的特征在于可体内给予入受溶酶体酶缺乏影响的细 胞的编码全长溶酶体硫酸酯酶或其片段、突变体、变体或衍生物的核酸序列。
在另一方面，本发明提供检测溶酶体硫酸酯酶活性的方法，包括(a)在促进软骨 细胞维持分化的条件下培养患有溶酶体硫酸酯酶缺乏的患者，例如患有莫尔基奥综合征 的患者的软骨细胞；(b)使该软骨细胞接触降解硫酸角质素的溶酶体硫酸酯酶；和(c)检 测细胞中的硫酸角质素水平，其中与未接触溶酶体硫酸酯酶的细胞相比，接触溶酶体硫 酸酯酶的细胞中硫酸角质素水平降低表明溶酶体硫酸酯酶活性。在一些实施方式中，溶 酶体硫酸酯酶是N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在一些实施方式中，利用包含 胰岛素生长因子I(IGFl)、转化生长因子β (TGF-β)、转铁蛋白、胰岛素和抗坏血酸的 培养基进行培养。在一些实施方式中，利用共聚焦显微术，或通过与抗-硫酸角质素测 开头结合来检测硫酸角质素。可利用任何溶酶体硫酸酯酶实施该方法，包括天然产生或 重组人酶，或其片段或变体，包括所含的氨基酸序列与前体人酶具有至少80%、85%, 90%, 95%或100%相同的变体，不含信号序列，或其成熟形式。
在还有另一方面，本发明提供检测降解天然底物的重组人溶酶体酶活性的细胞 试验。该方法包括(a)在溶酶体酶的天然底物累积的条件下培养溶酶体酶缺乏的分离人 细胞；(b)使细胞与溶酶体酶接触；(c)裂解细胞；(d)向细胞裂解液中加入酶，所述酶 是G)天然底物特异性的，和Gi)切割天然底物上的小寡糖；(e)用可检测部分标记该 小寡糖；(f)任选分离标记的小寡糖；(g)检测标记的小寡糖；和(h)通过比较(i)和(ii) 来测定溶酶体酶降解天然底物的活性ω接触溶酶体酶的细胞的标记小寡糖量与Gi)未 接触溶酶体酶的标记小寡糖量，其中与(h) ( )相比，(h) ω中标记小寡糖量减少表明溶 酶体酶降解天然底物的活性。在一个实施方式中，该小寡糖是单糖、二糖或三糖。在相 关的实施方式中，该小寡糖是二糖。在一些实施方式中，溶酶体酶选自芳基硫酸酯酶 B (ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素_N_硫酸酯酶6GSH)、 N-乙酰葡萄糖胺-硫酸酯酶(G6S)和N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在一些 实施方式中，溶酶体酶是α-L-艾杜糖苷酸酶(IDU)。在一些实施方式中，溶酶体酶是 酸性α -葡糖苷酶(GAA)。在一些实施方式中，溶酶体酶是β -葡萄醛酸酶(GUSB)。 在一些实施方式中，溶酶体酶是β -半乳糖苷酶(GLBl)。
可用于细胞试验的合适人细胞包括缺乏待测试溶酶体酶，从而能累积该溶酶体 酶的天然底物的任何人细胞。例如，可利用天然显示活性完全或部分缺陷的细胞，例如 活性降低30%、50%, 70%, 80%, 90%, 95%或更多。可利用表达活性降低的突变型 酶的细胞，或自患有溶酶体贮积症，例如粘多糖贮积病的患者获得的细胞。可利用经重组改变以敲除或降低溶酶体酶活性的细胞，例如通过在编码基因或其启动子或其它调控 区域中引入突变。可利用经处理溶酶体酶活性降低的细胞，例如用反义或RNAi处理以 减少酶表达。
本领域普通技术人员可选择从碳水化合物上切割(消化)小寡糖和对溶酶体酶的 天然底物具有“特异性”(即，主要消化)的合适酶。例如，为检测GALNS或GLBl (降 解硫酸角质素的酶)的活性，(d)的酶可以是角质素酶II或主要作用于硫酸角质素的任何 酶。再例如，为检测IDU、ARSB, IDS或GUSB (降解硫酸皮肤素的酶)，步骤(d)的酶 可以是软骨素酶ABC或主要作用于硫酸皮肤素的任何酶。再例如，为检测IDU、IDS、 SGHS、G6S或GUSB (降解硫酸乙酰肝素的酶)，步骤(d)的酶可以是类肝素酶I或类肝 素酶II，或二者。再例如，为检测GAA (降解糖原的酶)，步骤(d)的酶可以是α-淀 粉酶或主要作用于糖原的任何酶。
该细胞方法能以高灵敏度检测溶酶体酶活性。在一些实施方式中，当溶酶体酶 浓度低至约ΙΟηΜ、或约5nM、或约InM、或约0.75nM、或约0.5nM、或约0.25nM、或 约O.lnM、或约0.05nM、或约O.OlnM、或约0.005nM、或约ΙρΜ、或约0.5pM时亦可检测溶酶体酶活性。
本发明的其它特征和优点会从以下详述中明白。然而，应该知道，给予表明本 发明优选实施方式的详述和具体实施例仅是出于说明的目的，因为本领域技术人员鉴于 该详述可以明白属于本发明构思和范围内的各种改变和改进。
附图简述


图1描述了人硫酸酯酶修饰因子1 6UMF1)的核苷酸序列6EQ IDNO 1)。
图2描述了人硫酸酯酶修饰因子1 6UMF 1)的氨基酸序列(SEQ IDNO 2)。
图3描述了人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的核苷酸序列^EQ ID NO 3)。
图4描述了人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的氨基酸序列(SEQID NO 4)。加工的GALNS中不含N_末端的沈个氨基酸的信号肽。
图5描述了加工的人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)结构和特征。
图6显示用人硫酸酯酶修饰因子1 6UMF1)和人GALNS表达载体共同转染的 G71S细胞表达人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。 (A)在96-孔中筛选G71S 克隆的活性GALNS。 (B) G71S克隆GALNS生产率，以皮克/细胞/天计。
图7显示了用于大规模生产表达人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)及 其变体的G71S细胞的WAVE生物反应器控制器的示意图。
图8显示了在4°C (菱形)或-70°C (三角形)保存的纯化人N-乙酰半乳糖 胺-6-硫酸酯酶(GALNS)酶活性的稳定性。
图9显示了依次通过(A)蓝色琼脂糖6快流层析和(B)Fractogel SEHi-CAP层 析纯化人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。通过SDS-PAGE的考马斯蓝染色 (左)和利用抗-GALNS(IVA)抗体的蛋白质印迹(右)测定纯度。
图10显示通过超滤/透析(UF/DF)、Fractogel SE Hi-Cap层析、Zn-螯合琼脂 糖层析和ToyoPearl Butyl 650M层析纯化人N_乙酰半乳糖胺_6_硫酸酯酶(GALNS)。通 过SDS-PAGE的考马斯蓝染色(左上)和利用抗-GALNS抗体(右上)、抗-组织蛋白酶L抗体(左下)及抗-CHOP(中国仓鼠卵巢细胞蛋白)(右下)的蛋白质印迹测定纯度。
图11显示在IDU-处理的GM01391细胞中观察到硫酸皮肤素底物量的剂量依赖 性降低。
图12显示在ARSB-处理的GM00519细胞中观察到硫酸皮肤素底物量的剂量依赖性降低。
图13显示培养的滑膜细胞摄取未标记的(圆圈)或与A488(正方形)或A555(三 角形)偶联的人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。
发明详述
本发明涉及发现了某种方法能使得大规模生产重组溶酶体硫酸酯酶的需求与活 性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶产物的要求相一致，该产物能有效靶向溶酶体，因此是治 疗有效的。
溶酶体酶制品的疗效取决于该制品中甘露糖-6-磷酸的水平。通过内质网和早 期高尔基体中的翻译后修饰将磷酸根加入目标糖蛋白。折叠的溶酶体酶显示寡糖修饰酶 识别的独特三级决定簇。该决定簇由一组专门隔开的赖氨酸构成，其在大多数溶酶体酶 上发现，但缺乏一级序列同源性。修饰酶，即UDP-GlcNAc磷酸转移酶结合蛋白质决定 簇，并将GlcNAc-1-磷酸加入寡糖上接近结合位点的末端甘露糖残基的6-位；然后， 第二酶，即磷酸二酯α-GlcNAc酶切割GlcNAc-磷酸键得到甘露糖-6-磷酸末端寡糖 (Canfield等，美国专利号6,537,78 。甘露糖-6-磷酸的目的是将溶酶体酶从分泌途径 转向细胞内的溶酶体途径。高尔基体外侧中的MPR结合携带甘露糖-6-磷酸的酶，从而 该酶定向于溶酶体而非细胞表面。
除了在溶酶体酶寡糖上存在甘露糖-6-磷酸标记外，酶的溶酶体定向取决于出 现在高尔基体外侧堆栈(tons Golgi stack)末端的运输内含体的酸化。用可扩散的碱性分 子化学猝灭这些内含体内的酸性环境导致包括溶酶体酶在内的囊泡内含物流入胞外环境 (Braulke等，Eur.J.Cell Biol.43 (3) 316-321，1987)。酸化需要包埋在内含体膜内的特 定空泡 ATP 酶(Nishi 等，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.3 (2) 94-103，2002)。预计该 ATP 酶失 效会增强溶酶体酶的分泌而损害溶酶体定向。制备空泡ATP酶中有缺陷的细胞系估计将 防止磷酸化的重组酶非生产性转向至胞内溶酶体区室。
在1984年，产生并表征了内含体酸化专门有缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞 突变体(Park 等，Somat.Cell Mol.Genet.17 O) 137-150，1991)。化学诱变 CHO-KI 细胞，并在毒素存在和升高温度下选择存活情况。这些毒素要完全表现出它们的致死性需 要内含体酸化(Marnell 等，J.Cell.Biol.99 (6) 1907-1916，1984)。在前一研究中，选 择具有不同作用机制的两种毒素的混合物以避免选择毒素特异性耐受性。其原则是导致 对一种特定毒素耐受的偶发突变的可能性不大时，两种完全不同毒素的两个特异性的同 时偶发突变的可能性不存在。在高温下进行选择以便于温度敏感性突变。该遗传筛选 获得两种突变体，其一指定为G.7.1(G71)，其在高温下耐受毒素。G71中的损害不是 因摄取了两种毒素或其作用机制所致，而是高温下该克隆不能酸化内含体所致。在允许 的温度下(34°C )也观察到这种无能力，但程度较低。还发现高温下G71细胞对铁是营 养缺陷型的，虽然能从培养基中正常摄取转铁蛋白(Timchak等，J3iOl.ChemJ61(30) 14154-14159，1986)。由于转铁蛋白只在低pH下释放铁，虽然有正常的转铁蛋白摄取，但对铁的营养缺陷型表明内含体酸化故障。另一项研究证明酸化缺陷主要出现在内含体 而非溶酶体中 Mtone 等，J.Biol.ChemJ62 (20) 9883-9886，1987)。G71 的数据与突变 导致负责内含体酸化的空泡ATP酶失稳的结论一致。高温下(39.5°C)失稳最明显，但即 使在较低温度下(34°C)也部分表现。将两种内源性溶酶体酶，即组织蛋白酶D和α-葡 萄糖苷酶运输到 G71 细胞中的研究(Park 等，Somat.CellMol.Genet.17 (2) 137-150， 1991)显示两种酶在高温下定量分泌，而两种酶的糖基化未受影响。非许可温度下磷酸化 酸性α-葡萄糖苷酶的分泌显著增加。
溶酶体硫酸酯酶制品的疗效不仅取决于甘露糖-6-磷酸的水平，还取决于该制 品中活性酶是否存在。所有已知的硫酸酯酶在它们的催化位点含有半胱氨酸残基；该 半胱氨酸残基经翻译后修饰成Ca-甲酰甘氨酸(FGly)以活化该酶。硫酸酯酶修饰因子 1 (SUMFl)催化的这种半胱氨酸到FGly的翻译后酶活化发生在内质网内未折叠的硫酸酯 酶上，在翻译后立即进行，而在将硫酸酯酶靶向溶酶体之前(Dierks等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA94 11963-11968，1997)。突出该独特的翻译后修饰的重要性是因为SUMFl 中的突变导致溶酶体硫酸酯酶中FGly形成受损，从而在人中导致多发性硫酸酯酶缺乏症 (MSD) (Diez-Ruiz 等，Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.6 355-379，2005)。
因此，内含体酸化缺陷的G71细胞，即突变型CHO细胞共同表达重组人硫酸酯 酶修饰酶6UMF1)和人溶酶体硫酸酯酶的能力为大规模生产用于控制此类溶酶体硫酸酯 酶缺乏所致或与之相关的溶酶体贮积症的活性高度磷酸化重组人溶酶体硫酸酯酶提供了 机制。
I.定义
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的 普通技术人员通常理解的一样。以下参考文献为技术人员提供了本发明所用许多术 语的通用定义Singleton 等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY (微生物学和分子生物学词典)(第2版，1994) ； THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE ANDTECHNOLOGY (剑桥科技词典)(Walker 编，1988)； THE GLOSSARY OFGENETICS (遗传学词汇表)，第 5 版，R.Rteger 等(编)，SV 公 司(SpringerVerhg) (1991) ； Hale 禾P Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY(哈帕科林斯生物学词典)(1991)。
本文引用的各出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用全文纳入本文 的程度与本文一致。
除非文章另有明确表述，此处应该注意本说明书和随附的权利要求书中所用的 单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。
除非另有指定，本文所用的以下术语具有归于它们的意义。
“等位基因变体”指占据相同遗传基因座的基因的两种或更多种多形形式。突 变天然产生等位基因变体，从而可在人群中导致表型多态性。基因突变可以是沉默的 (即，编码的多肽中没有改变)或者可编码氨基酸序列改变的多肽。“等位基因变体”还 指衍生自遗传等位基因变体的mRNA转录物的cDNA以及它们编码的蛋白质。
“扩增”指拷贝多核苷酸序列，因而扩展成大量多核苷酸分子的任何方式，例 如通过逆转录、聚合酶链式反应和连接酶链式反应。
如果有以下情况则称第一序列对于第二序列是“反义序列”其序列是第一序 列的多核苷酸特异性杂交其序列是第二序列的多核苷酸。
“cDNA”指与mRNA互补或相同的单链或双链形式的DNA。
本文利用常规标记描述多核苷酸序列单链多核苷酸序列的左手端是5’ -端； 双链多核苷酸序列的左手方向称为5’ -方向。向新生RNA转录物加入核苷酸的5’到 3’方向称为转录方向。具有与mRNA相同序列的DNA链称为“编码链” ；DNA链上 具有与从该DNA转录的mRNA相同的序列并位于该RNA转录物5’端的5’方向的序 列称为“上游序列” ；DNA链上具有与RNA相同的序列并位于编码RNA转录物3’端 的3’方向的序列称为“下游序列”。
“互补”指两种多核苷酸的相互作用表面的形态相容性或共同匹配性。因此， 该两种分子可以描述成互补的，此外，接触表面特征彼此互补。如果第一多核苷酸的核 苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合伴侣的核苷酸序列相同，则该第一多核苷酸与 第二多核苷酸互补。因此，序列为5' -TATAC-3'的多核苷酸与序列为5' -GTATA-3' 的多核苷酸互补。如果与某核苷酸序列的互补序列与参比核苷酸序列基本上相同，则该 核苷酸序列与参比核苷酸序列“基本上互补”。
“保守性取代”指用功能相似的氨基酸取代多肽中的某氨基酸。以下六组各含 有彼此是保守性取代的氨基酸
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
术语“片段”用于述及多肽时，其指由于在蛋白质的N-末端或C-末端或两端 截短，和/或蛋白质的内部部分或区域缺失而短于全长多肽的多肽。可通过本领域已知 的任何方法制备多肽的片段。
术语“突变体”用于述及多肽时，其指蛋白质中的一个或多个氨基酸被不同氨 基酸取代的多肽。氨基酸取代可以是以上定义的保守性取代，或者可以是非保守性取 代。可通过本领域已知的方法制备突变型多肽。
术语“衍生物”用于述及多肽时，其指通过以下技术作化学修饰的多肽，例如 但不限于遍在蛋白化、标记(例如，用放射性核素或各种酶)、共价聚合物连接，例如 PEG化(即，用聚乙二醇衍生)和通过化学合成人蛋白质中通常不产生的氨基酸，例如鸟 氨酸作插入或取代。可通过本领域已知的方法制备衍生物多肽。
术语“衍生物系”用于述及细胞系时，其指作为亲代细胞系后代的细胞系；例 如，该术语包括从亲代细胞传代或亚克隆并保留所需特性的细胞，经突变和选择保留所 需特性的亲代细胞系的后代，和经改变而含有不同表达载体或不同外源性添加的核酸的 亲代细胞系的后代。
“检测”指测定样品中分析物的存在、不存在或含量，可包括定量测定样品中 或样品中每细胞的分析物含量。
“可检测部分”或“标记物”指可由光谱学、光化学、生物化学、免疫化学 或化学方法检测的组合物。例如，有用的标记物包括^P、35s、荧光染料、电子致密剂 (electron-dense reagent) >酶(例如，ELISA中常规使用的)、生物素-链霉亲和素、洋地 黄毒苷(dioxigenin)、有抗血清或多克隆抗体可用的半抗原和蛋白质、或具有与靶标互补 序列的核酸分子。可检测部分常产生可检测的信号，例如放射性、产色性或荧光信号， 该信号可用于定量测定样品中结合的可检测部分的含量。可共价，或通过离子键、范德 华力或氢键将可检测部分掺入或连接于引物或探针，例如掺入放射性核苷酸或链霉亲和 素识别的生物素化核苷酸。可检测部分可以直接或间接检测。间接检测可包括将第二直 接或间接可检测部分结合于可检测部分。例如，可检测部分可以是结合伴侣的配体，例 如生物素，其是链霉亲和素的结合伴侣，或核苷酸序列，其是可与其特异性杂交的互补 序列的结合伴侣。结合伴侣本身可以是可检测的，例如可用荧光分子标记抗体本身。结 合伴侣还可以是间接可检测的，例如具有互补核苷酸序列的核酸可以是分支DNA分子的 一部分，进而可通过与其它标记的核酸分子杂交来检测。(参见，例如Fahriander等， Bio/Technology 6 1165，1988)。通过，例如闪烁计数、光密度法或流式细胞术定量测 定信号。
“诊断”表示鉴定病理性状况的存在或性质。诊断方法的特异性和选择性不 同。虽然具体的诊断方法可能不提供某状况的确定诊断，但如果该方法提供有助于诊断 的证明指示就足够了。
术语“有效量”表示足以对对象的健康状况、病理学状况和疾病产生所需结 果，或对于诊断目的足够的剂量。所需结果可包括该剂量的受者的主观或客观改善。“治疗有效量”指足以对健康产生所需益处的药剂用量。
“编码”指多核苷酸，例如基因、CDNA或mRNA中的特定核苷酸序列在生物 学过程中用作合成具有指定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或指定的氨基酸 序列和所导致的生物学特性的其它聚合物和大分子的模板的固有特性。因此，如果某基 因产生的mRNA经转录和翻译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋 白质。用作转录模板的某基因或cDNA的编码链和非编码链可称为编码该基因或cDNA 的蛋白质或其它产物，所述编码链的核苷酸序列与mRNA序列相同，通常在序列表中提 供。除非另有指定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此是简并形式并编码相同 氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包含内含子。
“当量剂量”指含有相同量活性剂的剂量。
“表达控制序列”指多核苷酸中的核苷酸序列，该核苷酸序列调节与其操作性 相连的核苷酸序列表达(转录和/或翻译)。“操作性相连”指两部分之间的功能关系， 其中一部分的活性(例如，调节转录的能力)对另一部分有作用(例如，序列的转录)。 表达控制序列可包含，例如但不限于启动子序列(例如，诱导型或组成型)、增强子、 转录终止子、起始密码子(即，ATG)、内含子的剪接信号和终止密码子。
“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，所述多核苷酸含有与待表达核苷酸 序列操作性连接的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用元件以供表达；用于 表达的其它元件可由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域已知的所有那 些，例如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸质粒或包含在脂质体中)和病毒。
“高度磷酸化”、“高水平磷酸化”和“高水平磷酸化寡糖”指某种溶酶体硫 酸酯酶制品，其中至少50%溶酶体硫酸酯酶通过磷酸化寡糖结合于不依赖阳离子的甘露 糖-6-磷酸受体。通过对甘露糖-6-磷酸竞争的灵敏度来进一步表征结合情况。高度 磷酸化溶酶体硫酸酯酶还可称为每条蛋白质链具有至少0.25、优选至少0.5，更优选至少 0.75双-磷酸化寡糖链的溶酶体。
本文所用的“双-磷酸化寡糖链”指含甘露糖的寡糖链，其N-连接于溶酶体硫 酸酯酶中的天冬酰胺残基并包含两个甘露糖-6-磷酸残基。双-磷酸化的寡聚甘露糖链 通常具有7个甘露糖残基，S卩，双-磷酸甘露糖7CBPM7)，它们连接于两个GIcNAC残 基，进而连接于溶酶体硫酸酯酶中的天冬酰胺残基。
“活性”、“活化的”和“高水平活化”指某种溶酶体硫酸酯酶制品，其中至 少50%，优选至少70%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%的蛋白质的活性位点半 胱氨酸残基经翻译后修饰成Ca-甲酰甘氨酸(FGly)。
“活性高度磷酸化”指某种溶酶体硫酸酯酶制品，其中至少50%、优选至少 70%,更优选至少90%、甚至更优选至少95%的蛋白质活性位点半胱氨酸经翻译后修饰 成Ca-甲酰甘氨酸(FGly)，其中每条蛋白质链具有至少0.25、优选至少0.5，更优选至少 0.75双-磷酸化寡糖链。
术语“生物学活性的”指保留全长多肽的一种或多种生物学活性中至少基本量 (例如，至少约50%、优选至少约70%、更优选至少约90%)的其多肽(即，酶)片段、 突变体、变体或衍生物。用于述及溶酶体硫酸酯酶时，其生物学活性片段、突变体、变 体或衍生物保留至少基本量的硫酸酯酶活性(即，从其目标底物切割硫酸酯)。用于述及 硫酸酯酶修饰因子KSUMF1)时，其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物保留至少 基本量的甲酰甘氨酸-产生活性(即，将溶酶体硫酸酯酶的活性位点半胱氨酸残基修饰成 Ca-甲酰甘氨酸(FGly))。
当术语“纯度”或“纯的”用于述及多肽时，其指与可采用特定方法检测的 任何污染性物质相比，所分析多肽的含量。对于本发明的重组溶酶体硫酸酯酶，可在还 原性或非还原性条件下通过SDS-PAGE电泳分离硫酸酯酶制品，然后用考马斯蓝或银染 色，或通过HPLC层析分离(例如，C4反相(RP))或通过任何其它层析分离，例如尺寸 排阻6EC)等来测定“纯度”。采用这些方法，本发明的纯化重组溶酶体硫酸酯酶的 纯度为至少约80%、优选至少约90%、更优选至少约95%、甚至更优选至少约98%或 99%。
术语“前体”或“前体形式”指哺乳动物细胞分泌的重组溶酶体硫酸酯酶形 式。即，缺乏信号序列，但缺乏某些修饰，例如溶酶体中通常发生的蛋白质内部切割。 术语“成熟”、“成熟形式”、“加工”或“加工形式”指重组溶酶体硫酸酯酶在溶 酶体中通常存在的形式。对于本发明的重组溶酶体硫酸酯酶，可在还原性条件下通过 SDS-PAGE电泳分离硫酸酯酶制品，然后用考马斯蓝或银染色，或通过HPLC层析分离 (例如，C4反相(RP))或通过任何其它层析分离，例如尺寸排阻6EC)等来测定“前 体”或“前体形式”和“成熟”、“成熟形式”、“加工”或“加工形式”。采用 这些方法，本发明的纯化重组溶酶体硫酸酯酶包含至少约75%、优选至少约85%、更优 选至少约90%、甚至更优选至少约95%的“前体”或“前体形式”。或者，采用这些方法，本发明的纯化重组溶酶体硫酸酯酶包含至少约25%、优选至少约15%、更优选至 少约10%、甚至更优选至少约5%的“成熟”、“成熟形式”、“加工”或“加工形 式”。在一些实施方式中，只检测到“前体”或“前体形式”，即，在还原性条件下进 行SDS-PAGE时，硫酸酯酶制品基本上由单一的可检测条带构成，或者通过HPLC分析 时基本上是单峰。
就两条或多条多核苷酸或更多肽序列而言，术语“相同”或“相同性百分比” 指当采用以下序列比较算法之一或通过目测观察检测来比较和比对最大对应性时，两条 或更多条序列或子序列相同或具有一定百分比的核苷酸或氨基酸残基相同。
“接头”指共价，或通过离子键、范德华力或氢键连接两个其它分子的分子， 例如在5’端杂交一条互补序列，在3’端杂交另一条互补序列，从而连接两条非互补序 列的核酸分子。
“低水平磷酸化”或“低磷酸化”指某种溶酶体硫酸酯酶制品，其中摄取入成 纤维细胞的半最大浓度大于IOnM或者结合甘露糖-6-磷酸受体柱的溶酶体硫酸酯酶部分 低于约25%。
应用于某对象的“天然存在”指该对象可在自然界中发现的事实。例如，存在 于生物体(包括病毒)中的多肽或多肽序列是天然存在的，其可从自然界来源分离并且未 由人类在实验室中作有意修饰。
“药物组合物”指适合在对象动物，包括人和哺乳动物中药学应用的组合物。 药物组合物包含药学有效量的治疗性溶酶体硫酸酯酶，还包含一种或多种药学上可接受 的运载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物包括含有活性成分和构成运载体、稀释剂或赋 形剂的惰性成分的组合物，以及任何两种或更多种成分的组合、复合或凝聚，或一种或 多种成分解离，或一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用而直接或间接获得的任 何产物。因此，本发明的药物组合物包括通过混合本发明的溶酶体硫酸酯酶和一种或多 种药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂而制成的任何组合物。
“药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂”指任何标准的药物运载体、稀释 剂、缓冲剂和赋形剂，例如但不限于，磷酸缓冲盐水、5%葡萄糖水溶液和乳液，如油/ 水或水/油乳液，和各种类型的润湿剂和/或佐剂。《雷明顿药物科学》(Remington' s Pharmaceutical Sciences)，第 19 版(马克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿，1995) 描述了合适的药物运载体、稀释剂或赋形剂和制剂。优选的药物运载体、稀释剂或赋形 剂取决于活性剂打算的给药方式。典型的给药方式包括，例如但不限于经肠(例如， 口服)或胃肠外(例如，皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内)注射、或局部、经皮或经粘膜 给药。
“药学上可接受的盐”是可配制成溶酶体硫酸酯酶以供药学应用的盐，包括， 例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)和铵或有机胺的盐。
“多核苷酸”指核苷酸单元构成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例 如脱氧核糖核酸(“DNA” )和核糖核酸(“RNA” )以及核酸类似物。核酸类似物包 括含有非天然存在碱基，与除天然存在的磷酸二酯键以外的其它核苷酸相连的核苷酸， 或者包含通过除磷酸二酯键以外的连接键相连的碱基的那些。因此，核苷酸类似物包 括，例如但不限于，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯(phosphorotriester)、氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯(bonmophosphate)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2_0_甲基核糖核苷 酸、肽-核酸(PNA)，等。例如，可用自动DNA合成仪合成此类多核苷酸。术语“核 酸”通常指大多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常指短多核苷酸，一般不大于约50个核 苷酸。应该知道，当由DNA序列(即，A、T、G、C)表示核苷酸序列时，其还包括 RNA序列(即，A、U、G、C)，其中〃 U"替代〃 T"。
“多肽”指通过肽键连接的由氨基酸残基构成的聚合物、其相关的天然存在的 结构变体和合成非天然存在的类似物、其相关的天然存在的结构变体和合成的非天然存 在的类似物。例如，可通过自动多肽合成仪合成多肽。术语“蛋白质”通常指大多肽。 术语“肽”通常指短多肽。本文利用常规标记描绘多肽序列多肽序列的左手端是氨 基-末端；多肽序列的右手端是羧基-末端。
“引物”指能特异性杂交指定多核苷酸模板并提供互补多核苷酸的合成起点的 多核苷酸。当多核苷酸引物置于诱导合成的条件下，即，有核苷酸、互补多核苷酸模板 和聚合试剂，例如DNA聚合酶存在时，发生此类合成。引物通常是单链的，但可以是双 链的。引物通常是脱氧核糖核酸，但许多应用中可利用各种合成的和天然存在的引物。 引物与设计要与之杂交的模板互补以便用作合成起点，但无需反映该模板确切的序列。 在此情况中，引物与模板的特异性杂交取决于杂交条件的严格性。可用，例如产色性、 放射性或荧光部分标记引物，引物可用作可检测部分。
“探针”用于述及多核苷酸时，其指能特异性杂交另一多核苷酸的指定序列的 多核苷酸。探针特异性杂交互补靶多核苷酸，但无需反映该模板的确切互补序列。在此 类情况中，探针与靶标的特异性杂交取决于杂交条件的严格性。可用，例如产色性、放 射性或荧光部分标记探针并将其用作可检测部分。
“预防性”治疗是为降低产生病状的可能性而给予未表现出疾病迹象或仅表现 出早期迹象的对象以治疗。可将本发明化合物作为预防性治疗给予以降低产生病状的可 能性或最大程度降低病状的严重性，如果产生的话。
“重组多核苷酸”指具有天然未连接在一起的序列的多核苷酸。可将扩增或组 装的重组多核苷酸包含在合适载体中，可利用该载体转化合适的宿主细胞。包含重组多 核苷酸的宿主细胞称为“重组宿主细胞”。然后在重组宿主细胞中表达该基因以产生， 例如“重组多肽”。重组多核苷酸还可起到非编码功能(例如，启动子、复制起点、核 糖体结合位点，等)。
“特异性杂交于”、“特异性杂交”或“选择性杂交于”指严格性条件下，当 某特定核苷酸序列存在于复杂混合物中时(例如总细胞DNA或RNA)，核酸分子优先与 该序列结合、形成双链体或杂交。
术语“严格性条件”指探针优先杂交其靶序列，而与其它序列杂交程度低或根 本不杂交的条件。就核酸杂交实验，例如Scmrthem和Northern杂交而言，“严格性杂 交”和“严格性杂交洗涤条件”依赖于序列，在不同环境参数下有所不同。核酸杂交的 广泛指导见Tijssen (1993)生物化学和分子生物学实验室技术核酸探针杂交(Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Acid Probes) 第I部分第2章“杂交原理和核酸探针试验方案综述(Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays)",埃尔赛维公司(Elsevier)，纽约。高严格性杂交和洗涤条件通常选择比指定离子强度和pH下具体序列的热解链温度(Tm)低约5°C。 该Tm是50%靶序列杂交完美匹配的探针的温度(指定离子强度和pH下)。非常严格性 条件选择等于特定探针的Tm。
在Southern或northern印迹的滤膜上，具有多于100个互补残基的互补核酸杂交的严格杂交条件的例子是42°C，含Img肝素的50%福尔马林，杂交进行过夜。高度严格 性洗涤条件的例子是72°C，0.15M NaCl,约15分钟。严格性洗涤条件的例子是65°C， 0.2XSSC洗涤，15分钟(缓冲液的描述参见Sambrook等)。高度严格性洗涤之前常先进 行低严格性洗涤以除去背景探针信号。对于，例如多于100个核苷酸的双链体，示例性 的中等严格性洗涤是lxSSC，4515分钟。对于，例如多于100个核苷酸的双链体， 示例性低严格性洗涤是4-6xSSC，4015分钟。特定杂交试验中信噪比是观察到的无 关探针的2x(或更高)通常表明检测到特异性杂交。
诊断或治疗的“对象”是人或非人动物，包括哺乳动物或灵长类。
就两条核酸或多肽而言，短语“基本同源”或“基本相同”通常指当采用以下 序列比较算法之一或通过目测观察检测来比较和比对最大对应性时，两条或更多条序列 或子序列具有至少40%、60%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%核苷酸或 氨基酸残基相同性。基本相同优选存在于至少约50个残基长度的序列区域、更优选在至 少约100个残基的区域上，最优选序列在至少约150个残基上基本相同。在最优选的实 施方式中，序列在比较生物聚合物之一或二者的全长上基本相同。
对于序列比较，通常一条序列用作与测试序列比较的参比序列。当采用序列比 较算法时，将测试和参比序列输入计算机，如果需要，指定子序列座标，并指定序列算 法程序参数。然后该序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参比序列的 序列相同性百分比。
可通过以下方法进行序列比较的最佳比对，例如Smith和Waterman的局部同 源算法(Adv.Appl.Math.2 482，1981)、Needleman 和 Wunsch 的同源比对算法(J.Mol. Biol.48 443，1970)、Pearson 和 Lipman 的相似度检索法(Proc.Nat' l.Acad.Sci.USA 85 2444, 1988)、计算机执行这些算法(威斯康星遗传学软件包的GAP、BESTFIT、FASTA 禾口 TFASTA，遗传学计算机组(GeneticsComputer Group)，575Science Dr.,麦迪逊，威斯 康星州)或目测观察。
有用算法的一个例子是PILEUP。PILEUP采用渐进的成对比对从一组相关序列 产生多重序列比对从而显示关系和序列相同性百分比。其还绘制显示用于产生比对的聚 类关系(clustering relationship)的树和树图 Wendogram)。PILEUP 利用 Feng 和 Doolittle (J.Mol.Evol.35 351-360，1987)的简化渐进比对方法。所用的方法类似于Higgins和 Sharp(CABIOS 5 151-153，1989)描述的方法。该程序可比对最多300条序列，各自的 长度最多为5,000核苷酸或氨基酸。该多重比对方法从两个最相似序列的成对比对开始， 产生两个比对序列的群(cluster)。然后，可将此群与下一个最相关序列或比对序列的群 作比对。可通过简单延伸两个单独序列的成对比对来比对两个序列群。通过一系列渐 进的成对比对实现最终比对。通过指定特定序列和序列比较区域的氨基酸或核苷酸坐标 并指定程序参数来运行该程序。例如，可利用以下参数比较参比序列和其它测试序列以 确定序列相同性关系百分比默认空位权重(3.00)、默认空位长度权重(0.10)和加权末端空位。可用于产生多重序列比对的另一算法是Clustal W(Thompson等，Nucleic Acids Research 22 4673—4680，1994)。
适合于测定序列相同性和序列相似性百分比的算法的另一例子是BLAST算法， 其描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215 403-410，1990。进行BLAST分析的软件可自生 物技术信息国家中心(National Center for Biotechnologylnformation)公开获得。该算法包括先通过鉴定查询序列中长度为W的短字符来确定高评分序列对(HSP)，所述短字符在 与序列数据库中相同长度的字符比对时匹配或满足某些正阈值评分T。T称为相邻字符评 分阈值(Altschul等，J.Mol.Biol.215 403-410，1990)。这些初始的相邻字符选中(hit) 作为种子启动检索来寻找含有它们的更长HSP。然后字符选中在各序列的两个方向上延 伸，直到累积比对评分升高。用参数M(匹配残基对的奖赏分数；恒大于0)和N(错配 残基的惩罚分数；恒小于0)来计算核苷酸序列的累积评分。对于氨基酸，可利用评分矩 阵来计算累积评分。当以下情况发生时，中止字选中在各方向上的延伸与最大获得值 相比，累积比对评分减少X ；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分接近零 或低于零；或者到达任一序列末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和 速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用默认参数，字长(W)为11、期望值(E)为 10、M = 5、N = -4且比较两条链。就氨基酸序列而言，BLASTP程序使用默认参数， 字长(W)为3、期望值(E) 10、使用BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 10915，1989)。
除计算序列相同性百分比外，BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学 分析(参见例如，Karlin 和 Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90 5873-5787, 1993)。 BLAST算法提供的一种相似性检测是最小概率和(P(N))，它说明两个核苷酸或氨基酸序 列之间偶尔发生匹配的概率。例如，如果测试核酸与参比核酸比较时的最小概率和小于 约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，那么认为该核酸与参比序列相似。
两条核酸序列或多肽基本相同的另一标志是第一核酸编码的多肽与第二核酸编 码的多肽免疫学交叉反应，如下所述。因此，当两种肽的区别仅在于保守性取代时，某 多肽通常与第二多肽基本相同。两条核酸序列基本相同的另一标志是该两分子在本文所 述的严格性条件下彼此杂交。
“基本纯”或“分离的”表示目标物质是存在的主要物质(即，以摩尔计，比 组合物中的任何其它各大分子更丰富)，互补纯的部分是其中目标物质占所有存在的大分 子物质的至少约50% (以摩尔计)的组合物。基本纯的组合物通常表示组合物中存在的 约80 %到90 %或更多的大分子物质是感兴趣的纯化物质。如果组合物基本上由单一大分 子物质构成，则目标物质纯化成基本上均质(常规检测方法不能在该组合物中检测到污 染性物质)。出于该定义的目的，溶剂物质、小分子(< 500道尔顿)、稳定剂(例如， BSA)和元素离子物质不视作大分子物质。在一些实施方式中，本发明溶酶体硫酸酯酶的 是基本纯的或分离的。在一些实施方式中，本发明的溶酶体硫酸酯酶相对于合成所用的 大分子起始物质是基本纯的或分离的。在一些实施方式中，本发明的药物组合物包含与 一种或多种药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂混合的基本纯的或分离的治疗性溶 酶体硫酸酯酶。
“治疗性”治疗是为减少或消除病状的迹象或症状而给予表现出那些迹象或症状的对象的治疗。迹象或症状可以是生物化学的、细胞学的、组织学的、功能的、主观 的或客观的。本发明的溶酶体硫酸酯酶可作为治疗性治疗或为诊断而给予。
“治疗指数”指最低治疗用量之上和不可接受的毒性用量之下的剂量范围(用量 和/或定时)。
“治疗”指预防性治疗或治疗性治疗或诊断性治疗。
本文所用的术语“单位剂型”指适合作为人和动物对象的单一剂量的物理上不 连续的单位，各单位含有与一种或多种药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂相结合 的预定量的本发明溶酶体硫酸酯酶，该预定量经计算能产生所需作用。本发明新型单位 剂型的规格取决于所用的特定溶酶体硫酸酯酶和要达到的作用以及各溶酶体硫酸酯酶在 宿主中的相关药效学特性。
II.产生溶酶体硫酸酯酶
一方面，本发明的特征在于产生活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的新型方法， 所述酶的产生量能治疗性应用此类酶。该方法的特征通常在于用编码人硫酸酯酶修饰因 子KSUMF1)或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物的cDNA和编码全长溶酶体 硫酸酯酶或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物的cDNA转化合适细胞系。本领 域技术人员可制备除本文专门描述的那些构建物之外的表达构建物以便优化此类溶酶体 硫酸酯酶在合适转化细胞系中的产生。此外，技术人员不难设计编码天然存在的SUMFl 或溶酶体硫酸酯酶的生物学活性片段、变体、突变体或衍生物的cDNA的片段，这些片 段、变体、突变体或衍生物具有天然存在的全长酶相同或相似的生物学活性。
宿主细胞
用于产生重组溶酶体硫酸酯酶的宿主细胞是内含体酸化缺陷型细胞系，其特征 在于能产生此类溶酶体硫酸酯酶，而此类酶的产生量能治疗性应用该酶。本发明提供 CHO-Kl-衍生的END3互补组细胞系，指定为G71。本发明还提供适合于无血清悬浮培 养的G71细胞系，指定为G71S。本发明还提供G71和G71S细胞系的衍生物系，其经进 一步亚克隆或含有不同表达载体。
本文将含有和表达编码重组蛋白质的DNA或RNA的细胞称为遗传修饰的细 胞。含有和表达编码重组蛋白质的DNA或RNA的哺乳动物细胞称为遗传修饰的哺 乳动物细胞。可通过已知转染方法将DNA或RNA引入细胞，例如但不限于电穿 孔、微量注射、微粒轰击、磷酸钙沉淀、改进的磷酸钙沉淀、阳离子脂质处理、光化 (photoporation)、融合方法、受体介导的转移、或1，5-二甲基-1，5-二氮i^一亚甲 基聚甲溴化物沉淀。或者，可通过病毒载体感染来引入DNA或RNA。表达编码重组 蛋白质的DNA或RNA的细胞，包括哺乳动物细胞的产生方法描述于共同待批的专 利申请美国序列号08/334,797，名为"基因治疗的体内蛋白质产生和递送系统Ctn Vivo ProteinProduction and Delivery System for Gene Therapy) “，Richard F Selden、Douglas AJreco 和 Michael W.Heartlein(1994 年 11 月 4 日提交)；美国序列号 08/3 ,455，名为“基因治疗的促红细胞生成素或胰岛素调理素的体内产生和递送CtnVivo Production and Delivery of Erythropoietin orlnsulinotropin for Gene Therapy) "， Richard F Selden、 Douglas A.Treco 和 Michael W.Heartlein(1994 年 11 月 4 日提交)和美国序列号 08/231,439，名 为“为基因治疗将DNA靶向引入原代和次级细胞及它们的应用(Targetedlntroduction ofDNA Into Primary or Secondary Cells and Their Use for GeneTherapy) ”，Douglas A.Treco、 Michael W.Heartlein和Richard F Selden (1994年4月20日提交)。这些申请的各自教导专门通过引用全文纳入本文。
在优选的实施方式中，用于产生重组溶酶体硫酸酯酶的宿主细胞是内含体酸化 缺陷型细胞系，其特征在于能产生此类溶酶体硫酸酯酶，而此类酶的产生量能治疗性应 用该酶。在优选的实施方式中，本发明提供指定为G71的CHO-Kl-衍生的END3互补 组细胞系和指定为G71S的适合于无血清悬浮培养的G71细胞系，二者共同表达人硫酸酯 酶修饰因子KSUMF1)和重组溶酶体硫酸酯酶，因此能产生高产量的活性高度磷酸化溶 酶体硫酸酯酶，如“定义”所所述的，从而能大规模产生治疗性溶酶体硫酸酯酶。在最 优选的实施方式中，G71或G71S细胞系或其衍生物系表达和分泌重组溶酶体硫酸酯酶， 其数量为至少约0.5、优选至少约0.75、更优选至少约1.0、甚至更优选至少约1.25皮克/ 细胞/天。
载体和核酸构建物
用于表达重组蛋白质，S卩，人硫酸酯酶修饰因子KSUMF1)或溶酶体硫酸酯酶 或二者的核酸构建物可以在转染的哺乳动物细胞中染色体外(附加体)表达或者通过同 源重组而随机或在预选的靶向位点整合入受者细胞的基因组。除重组蛋白编码序列外， 染色体外表达的构建物包含足以在细胞中表达该蛋白的序列和任选用于构建物复制的序 列。其通常包含启动子、重组蛋白-编码DNA和多腺苷酸化位点。编码重组蛋白的DNA 在构建物中的安置方式使其表达在启动子的控制下。该构建物可任选含有额外的组分， 例如以下一种或多种剪接位点、增强子序列、合适启动子控制下的可选择标记基因、 合适启动子控制下的可扩增标记基因和基质附着区(MAR)或增强其所插入区域表达的其 它本领域已知元件。
在DNA构建物整合入细胞基因组的那些实施方式中，其仅需包含重组蛋白-编 码核酸序列。其可任选包含启动子和增强子序列、一个或多个多腺苷酸化位点、编码一 个或多个可选择标记的核酸序列、基质附着区(MAR)或增强其所插入区域表达的其它本 领域已知元件、和/或与受者细胞中基因组DNA同源的DNA，从而将DNA靶向整合至 基因组中所选的位点(靶向DNA或DNA序列)。
细胞培养方法
在适于细胞生长和DNA或RNA表达的条件下培养含有重组蛋白编码DNA或 RNA的哺乳动物细胞。可采用已知方法和本文所述方法鉴定表达重组蛋白的那些细胞， 可采用已知方法和本文所述方法分离和纯化重组蛋白，其中重组蛋白产生可放大或不放 大。可通过，例如筛选遗传修饰的哺乳动物细胞，该细胞显示表明有编码重组蛋白的 DNA或RNA存在的表型，例如PCR筛选，通过Sourthem印迹分析筛选或筛选重组蛋白 的表达来进行鉴定。可通过将可选择标记包含入DNA构建物，然后在仅适合表达该可选 择标记基因的那些细胞存活的条件下培养含有可选择标记基因的转染或感染细胞来选择 包含掺入的重组蛋白-编码DNA的细胞。可在合适条件下(例如，在只含有多拷贝可扩 增标记基因的细胞能存活的药物浓度下培养含有可扩增标记基因的遗传修饰哺乳动物细 胞)培养遗传修饰的哺乳动物细胞来进一步扩增引入的DNA构建物。
可如本文所述，通过检测表达产物来鉴定编码重组蛋白的遗传修饰哺乳动物细胞。例如，可通过夹心酶免疫测定鉴定表达活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的哺乳动物 细胞。抗体可以直接针对活性剂部分。
溶酶体硫酸酯酶的变体
在某些实施方式中，可制备活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶突变体或变体，这 些突变体或变体在可利用活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的各种领域中有用。多肽的氨 基酸序列突变体或变体可以是取代、插入或缺失突变体或变体。缺失突变体或变体缺乏 天然蛋白质中对于功能或免疫原性活性不是至关重要的一个或多个残基。共同类型的缺 失突变体或变体缺乏分泌信号序列或引导蛋白质结合细胞特定部分的信号序列。插入突 变体或变体通常涉及在多肽的非末端位点加入物质。这可包括插入免疫反应性表位或简 单地插入单一残基。以下讨论了末端添加，也称为融合蛋白。
变体可以与上述未修饰的溶酶体硫酸酯酶基本上同源或基本上相同。优选的变 体是保留溶酶体硫酸酯酶的至少一些生物学活性，例如硫酸酯酶活性的活性高度磷酸化 溶酶体硫酸酯酶的变体。其它优选的变体包括保留人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶的至 少一些硫酸酯酶活性的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶多肽的变体。
取代突变体或变体通常将蛋白质内一个或多个位点的一个野生型多肽氨基酸换 为另一个，并可将其设计成调节该多肽的一种或多种特性，例如但不限于针对蛋白水解 切割的稳定性，而不丧失其它功能或特性。该类取代优选保守性的，即，用形状和电荷 相似的氨基酸替代某一氨基酸。保守性取代是本领域熟知的，包括，例如以下更换丙 氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸； 半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨 酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸； 赖氨酸到精氨酸；甲硫氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨 酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨 酸；和缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。
本发明一方面考虑产生糖基化位点突变体或变体，其中溶酶体硫酸酯酶的O-或 N-连接的糖基化位点突变。此类突变体或变体产生与活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的 生物学活性、物理结构和底物结合潜力有关的重要信息。某些方面考虑了可产生保留了 生物学活性但底物结合活性提高或降低的活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶多肽的其它突 变体或变体。因此，尤其考虑活性位点或催化区域的突变以产生底物结合活性改变的蛋 白质突变体或变体。在此类实施方式中，比较活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的序列与 其它相关酶的序列并特别突变所选的残基。
将成熟蛋白质推定氨基末端的氨基酸编为1号氨基酸，可采用的示范性突变包 括，例如取代重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的所有或一些可能糖基化 的天冬酰胺，包括178和397位(参见图5)。
可在溶酶体硫酸酯酶的活性位点处/附近突变来改进底物结合。考虑到此类突 变是示范性的，本领域技术人员应知道可作出酶序列的其它突变以提供关于该蛋白质及 其活性的额外结构和功能信息。
为构建突变体或变体，例如上述那些，本领域技术人员可采用熟知的标准技 术。尤其考虑了 N-末端缺失、C-末端缺失、内部缺失以及随机和点诱变。
N-末端和C-末端缺失是利用，例如C-或N-末端区域末端附近有合适单个限 制性位点存在的缺失诱变形式。在该位点切割DNA，用核酸酶，例如BAL31、核酸外 切酶III、DNA酶I和Sl核酸酶降解切割的末端。再连接两末端产生在限制性位点周围 有各种大小的缺失的一系列DNA。可采用本领域的标准技术和说明书所述的技术检验此 类突变体表达的蛋白质的合适生物学功能，例如酶活性。利用两个合适安置的限制性位 点，可将类似技术应用于内部缺失突变体，从而能精确限定要作出的缺失和上述要再连 接的末端。
还考虑了部分消化突变体。在此类例子中，本领域技术人员利用根据反应时间 的长度而在许多位置切割DNA的“频繁切割器”。因此，通过改变反应条件，可能产生 一系列不同大小的突变体，然后可筛选它们的活性。
还可用DNA酶I切割DNA序列进行随机插入突变，例如插入编码3、6、9、12种等氨基酸的核苷酸延伸段并再连接末端。一旦作出此类突变，可筛选这些突变体中野 生型蛋白所呈现的各种活性。
还可采用点诱变特异性地鉴定哪个氨基酸残基对于溶酶体硫酸酯酶生物学活性 相关的特定活性至关重要。因此，本领域技术人员能在DNA链中产生单碱基改变，从而 导致改变的密码子和错义突变。
可改变特定蛋白质的氨基酸以产生等价，或者甚至改进的第二代分子。此类改 变包括取代蛋白质的给定氨基酸而不显著丧失与诸如抗体的抗原结合区或底物分子或受 体上的结合位点等结构的相互作用结合能力。由于是蛋白质的相互作用能力和性质决定 蛋白质的生物学功能活性，可在蛋白质序列及其DNA编码序列中作出某些氨基酸取代， 但能获得特性相似的蛋白质。因此，可在基因的DNA序列中作出各种改变而不会显著丧 失它们的生物学效用或活性，如下所述。
在制备此类改变中，应考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic tedex)。氨基酸的相 对亲水特征有助于所得蛋白质的二级结构，进而决定该蛋白质与其它分子(例如酶、底 物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用是公认的。根据各氨基酸的疏水性和电荷 特征给它们指定亲水指数(通过引用纳入本文的Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol., 157(1) 105-132，1982)。通常可用具有相似亲水指数或评分的其它氨基酸取代氨基酸，但仍获 得具有相似生物学活性的蛋白质，即，仍获得生物学功能相等的蛋白质。
此外，可根据亲水性有效作出类似氨基酸的取代。通过引用纳入本文的美国专 利4,554,101描述了由毗连氨基酸的亲水性控制的蛋白质的最高局部平均亲水性与该蛋白 质的生物学特性相关。因此，某一氨基酸可取代具有相似亲水性值的另一氨基酸，而仍 能获得生物学相当和免疫学相当的蛋白质。
可用于本发明的示范性氨基酸取代包括但不限于精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和 天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的 交换。本领域技术人员熟知考虑到需要保留一些或全部生物学活性，同时改变蛋白质的 二级结构的其它此类取代。
制备本发明多肽所考虑的另一类变体是利用肽模拟物。模拟物是模拟蛋白质 二级结构的元件的含肽分子。参见，例如Johnson等，“肽翻转模拟物(Peptide Turn Mimetics) ” 刊于生物技术和药学(BIOTECHNOLOGY ANDPHARMACY)，Pezzuto 等编.，C&H公司(Chapman and Hall)，纽约(1993)。利用肽模拟物的原理是蛋白质中肽 骨架的存在主要是为了将氨基酸侧链定向成有助于分子相互作用，例如抗体和抗原的相 互作用。预计肽模拟物能进行类似于天然分子的分子相互作用。可联用这些原理和上述 的原理来工程改造具有溶酶体硫酸酯酶的许多天然特性，但其特征改变、甚至提高的第 二代分子。
溶酶体硫酸酯酶的修饰糖基化
与亲代多肽相比，还可产生具有修饰的糖基化模式的活性高度磷酸化溶酶体硫 酸酯酶的变体，例如缺失一个或多个碳水化合物部分和/或添加天然多肽中不存在的一 个或多个糖基化位点。
糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接的指碳水化合物部分连接于天冬 酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯 氨酸外的任何氨基酸)是碳水化合物部分酶促连接于天冬酰胺侧链的识别序列。多肽中 存在这些三肽序列之一产生潜在的糖基化位点。因此，可通过改变氨基酸序列将N-连接 的糖基化位点加入多肽，从而其含有一个或多个这些三肽序列。O-连接的糖基化位点指 将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨 酸，虽然5也可利用-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸。可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸 残基插入或取代入原始多肽序列而加入O-连接的糖基化位点。
结构域转换
溶酶体硫酸酯酶蛋白的各部分具有大量序列同源性。可在溶酶体硫酸酯酶多肽 中鉴定该改变其功能的突变。出于至少两个原因，这些研究可能是重要的。首先，它 们合理地预计相关物种，例如大鼠、家兔、猴、长臂猿、黑猩猩、猿、狒狒、牛、猪、 马、绵羊和猫中可能还存在该基因的其它同源物、等位基因变体和突变体。分离这些同 源物、变体和突变体后，并结合其它分析可鉴定某些活性和功能结构域。第二，这将为 上述分子的进一步突变分析提供起点。开发该信息的一种方法是“结构域转换(domain switching) ”。
结构域转换涉及利用不同但相关的多肽产生重组分子。例如，通过比较溶酶体 硫酸酯酶，例如N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶的序列与另一来源的相似溶酶体硫酸酯酶 的序列，可以预测这些分子中功能显著的区域。然后，可能转换这些分子的相关结构域 以图测定这些区域对于酶功能和在溶酶体贮积症中作用的临界性(criticality)。这些分子 可具有的额外价值在于这些“嵌合体”可与天然分子不同，但可能提供相同、甚至提高 的功能。
根据目前鉴定的许多溶酶体硫酸酯酶，进一步分析突变和它们对二级结构预计 的影响会增进这种了解。预计在溶酶体硫酸酯酶之间转换结构域的突变体将提供关于这 些分子的构效关系和与它们相互作用的多肽的有用信息。
融合蛋白
除了上述突变，本发明还考虑产生专门种类的插入变体，称为融合蛋白。该 分子通常具有天然分子的全部或大部分，在N-或C-末端连接于第二多肽的全部或一部 分。例如，融合通常利用其它物种的前导序列从而能在异源宿主中重组表达蛋白质。另 一种有用的融合包括加入免疫学活性结构域，例如抗体表位以便促进融合蛋白纯化。在融合结合处或附近包含切割位点将有助于在纯化后除去外来多肽。其它有用的融合包括 连接功能结构域，例如酶、糖基化结构域、细胞靶向信号或跨膜区的活性位点。
本发明可利用各种可商品化购得的融合蛋白表达系统。特别有用的系统包括但 不限于新泽西州皮斯卡塔市法玛西亚公司CPharmacia，Piscataway, NJ)的谷胱甘肽 S-转移酶(GST)系统、马萨诸塞州贝弗利市NEB公司(NEB，Beverley, ΜΑ)的麦芽糖 结合蛋白系统、康涅狄格州纽黑文市IBI公司(IBI，New Haven, CT)的FLAG系统、加 利福尼亚州查塔沃斯市恰根公司(Qiiigen，Chatsworth, CA)的6xHis系统。这些系统能 产生仅携带少量额外氨基酸的重组多肽，不大可能影响重组多肽的抗原性能力。例如， FLAG系统和6xHis系统仅加入短序列，二者已知抗原性差并不会不利地影响多肽折叠成 其天然构象。估计有用的另一 N-末端融合是在蛋白质或肽的N-末端区域融合Met-Lys 二肽。此类融合可有益地增加蛋白质表达或活性。
特别有用的构建物可能是其中活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶多肽或其片段融 合于半抗原的构建物，从而增强溶酶体硫酸酯酶融合构建物的免疫原性。这可用于产生 针对活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的抗体从而能检测该蛋白。在其它实施方式中，可 制备会增强溶酶体硫酸酯酶相关组合物靶向特定部位或细胞的融合构建物。
包含具有所需特性的异源肽，例如将溶酶体硫酸酯酶靶向特定器官、组织或细 胞类型的基序的其它融合构建物。在优选的实施方式中，包含骨靶向肽，例如融合于溶 酶体硫酸酯酶的6个天冬氨酸残基(6xAsp或6D)的融合构建物可将该酶靶向骨中的特定 部位。
还考虑了包含具有所需特性的异源多肽，例如Ig恒定区的其它融合构建物以延 长靶向抗体或其片段的血清半衰期。其它融合系统产生多肽杂种，在此情况中优选切除 所需多肽的融合伴侣。在一个实施方式中，融合伴侣通过含有蛋白酶的特定识别序列的 肽序列连接于重组活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶多肽。合适序列的例子是马里兰州盖 瑟斯堡的生命技术公司(LifeBchnologies，Gaithersburg, MD)的烟草蚀纹病毒蛋白酶或 马萨诸塞州贝弗利市新英格兰生物实验室(New England Biolabs，Beverley, ΜΑ)的因子 Xa识别的那些序列。
衍生物
如上所述，衍生物指通过以下技术化学修饰的多肽，例如但不限于遍在蛋白 化，标记(例如，用放射性核素或各种酶)，共价聚合物连接，例如化(用聚乙二醇 衍生)和化学合成氨基酸，例如鸟氨酸的插入或取代。溶酶体硫酸酯酶的衍生物还可用 作治疗剂，可由本发明方法产生。
聚乙二醇(PEG)可连接于本发明方法产生的溶酶体硫酸酯酶以提供更长的体内 半衰期。PEG基团可以具有任何便利的分子量，可以是线形或支链的。PEG的平均分 子量优选约2千道尔顿(“kDa” )到约IOOkDa,更优选约5kDa到约50kDa，最优选约 5kDa到约lOkDa。PEG基团一般通过酰化或还原性烷化，经PEG部分的反应性基团(例 如，醛基、氨基、巯基或酯基)与蛋白质部分的反应性基团(例如，醛基、氨基或酯基) 连接于本发明的溶酶体硫酸酯酶。可采用本领域熟知的技术将PEG部分加于感兴趣的多 肽。参见，例如国际公布号WO 96/11953和美国专利号4,179,337。
溶酶体硫酸酯酶多肽与PEG相连在水相中发生，通过反相分析型HPLC不难监测。通过制备型HPLC和不难纯化PEG化肽，通过分析型HPLC、氨基酸分析和激光解 吸质谱法不难表征。标记物在一些实 施方式中，标记治疗性溶酶体硫酸酯酶以利于检测。“标记物”或 “可检测部分”是可由光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理学方法
检测的组合物。例如，适用于本发明的标记物包括但不限于放射性标记物(例如， 32P)、荧光团(例如，荧光素)、电子致密剂、酶(例如，ELISA中常规使用的)、生物 素、洋地黄毒苷、或半抗原以及可制成可检测(例如通过将放射性标记物掺入半抗原或 肽)，或用于检测与半抗原或肽特异性反应的抗体的蛋白质。适用于本发明的标记物的例子包括但不限于荧光染料(例如，异硫氰酸荧光 素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记物(例如，3H、125K 35S、14C或32P)、酶(例 如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它常规用于ELISA中的)和比色标记物，例如胶 体金、有色玻璃或塑料珠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)。可根据本领域熟知的方法将标记物直接或间接偶联于溶酶体硫酸酯酶的所需部 分。在一个实施方式中，优选利用偶联本发明活性物质的异氰酸试剂将标记物共价结合 于溶酶体硫酸酯酶。在本发明的一方面，可利用本发明的双功能异氰酸酯试剂将标记物 偶联于溶酶体硫酸酯酶以便形成没有活性剂相连的标记物溶酶体硫酸酯酶偶联物。标记 物溶酶体硫酸酯酶偶联物可用作合成本发明的标记偶联物的中间体，或可用于检测溶酶 体硫酸酯酶偶联物。如上所述，可利用各种标记物，根据所需灵敏度、与溶酶体硫酸酯 酶的所需部分偶联是否方便、稳定性要求、可用的仪器和处理规定选择标记物。常通过 间接方法连接非放射性标记物。通常将配体分子(例如，生物素)共价结合于溶酶体硫 酸酯酶。然后将配体结合于另一分子(例如，链霉亲和素)，其是本身可检测的或共价结 合于信号系统，例如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物。本发明的溶酶体硫酸酯酶还可直接偶联于信号产生化合物，例如偶联于酶或荧 光团。适合用作标记物的酶包括但不限于水解酶，特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或 氧化酶(oxidotase)，特别是过氧化物酶。适合用作标记物的荧光化合物，即荧光团包括 但不限于荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰基、伞形酮等。合适荧光团的 其它例子包括但不限于曙红、TRITC-胺、奎宁、荧光素W、吖啶黄、丽丝胺罗丹明、 B磺酰氯赤藓红(erythroscein)、钌(三、二吡啶盐)、德克萨斯红、烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸、黄素腺嘌呤二核苷酸等。适合用作标记物的化学发光化合物包括但不限于萤光素 和2，3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。可用于本发明方法的各种标记物或信号产生系统 的综述参见美国专利号4,391，904。本领域技术人员熟知检测标记物的器件。因此，例如如果标记物是放射性的， 检测器件包括闪烁计数器或照相胶片，如放射自显影中的。如果标记物是荧光标记物， 可用适当波长的光激发荧光染料并检测产生的荧光作检测。可利用电子检测器，例如电 荷耦合器件(CCD)或光电倍增管等目测检测荧光。类似地，可通过提供酶的合适底物并 检测反应产物来检测酶标记物。可通过观察标记物相关的颜色来简单检测比色或化学发 光标记物。本领域技术人员不难明白适用于本发明方法的其它标记和检测系统。此类标 记的调节剂和配体可用于诊断疾病或健康状况。
在优选的实施方式中，该方法包括从内含体运输缺陷型细胞系产生活性高度磷 酸化溶酶体硫酸酯酶的步骤。在特别优选的实施方式中，该方法包括从CHO细胞系G71 或其衍生物系产生 活性高度磷酸化重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。产 生溶酶体硫酸酯酶，例如但不限于GALNS包括以下步骤(a)产生共同表达重组人溶酶 体硫酸酯酶，例如N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)和重组人硫酸酯酶修饰因子 1 (SUMFl)的G71或G71衍生物系；(b)培养人溶酶体硫酸酯酶和SUMFl共同表达细胞 系；和(C)将人溶酶体硫酸酯酶和SUMFl共同表达细胞系规模放大至生物反应器以便产 生溶酶体硫酸酯酶。在优选的实施方式中，基本上如下所述将人溶酶体硫酸酯酶，例如 N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)和人SUMFlcDNA亚克隆入哺乳动物表达载体。对于细胞系开发，用人GALNS哺乳动物表达载体、人SUMFl哺乳动物表达载 体和可选择标记基因共同转染G71或G71S (适合于无血清悬浮培养生长的G71克隆)， 选择稳定的转化子。稳定的转染子经第一轮亚克隆后，利用荧光底物选择细胞系，并专 门命名。分别分析在含微载体的旋转器中或悬浮培养中的G71或G71S细胞系的细胞特 异性产量(皮克产物/细胞)。鉴定人GALNS的最佳生产细胞系并规模放大至生物反应 器以便产生临床前材料。在另一实施方式中，本发明提供检测重组人溶酶体酶降解天然底物活性的细胞 试验。该方法包括(a)在溶酶体酶的天然底物累积的条件下培养溶酶体酶缺陷型的分离 人细胞；(b)将该细胞与溶酶体酶接触；(c)裂解该细胞；(d)向细胞裂解物中加入(i)天 然底物特异性，和Gi)从天然底物上切割小寡糖的酶；(e)用可检测部分标记该小寡糖； (f)任选分离标记的小寡糖；(g)检测该标记的小寡糖；和(h)通过比较(i)接触溶酶体酶 的细胞的标记小寡糖的含量与Gi)未接触溶酶体酶的细胞的标记小寡糖的含量来测定溶 酶体酶降解天然产物的活性，其中与(h) ( )相比，(h) ω降低表明溶酶体酶降解天然底 物的活性。在一个实施方式中，该小寡糖是单糖、二糖或三糖。在相关的实施方式中， 该小寡糖是二糖。在一些实施方式中，溶酶体酶选自芳基硫酸酯酶B(ARSB)、艾杜糖醛 酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)、N_乙酰葡萄糖胺_硫 酸酯酶(G6S)和N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在一些实施方式中，溶酶 体酶是α -L-艾杜糖苷酸酶(IDU)。在一些实施方式中，溶酶体酶是酸性α -葡糖苷酶 (GAA)。在一些实施方式中，溶酶体酶是β-葡萄醛酸酶(GUSB)。在一些实施方式 中，溶酶体酶是β-半乳糖苷酶(GLBl)。可用于细胞试验的合适人细胞包括缺乏待测试溶酶体酶，从而能累积该溶酶体 酶的天然底物的任何人细胞。例如，可利用天然显示活性完全或部分缺陷的细胞，例如 活性降低30%、50%, 70%, 80%, 90%, 95%或更多。可利用表达活性降低的突变型 酶的细胞，或自患有溶酶体贮积症，例如粘多糖贮积病的患者获得的细胞。可利用经重 组改变以敲除或降低溶酶体酶活性的细胞，例如通过在编码基因或其启动子或其它调控 区域中引入突变。可利用经处理溶酶体酶活性降低的细胞，例如用反义或RNAi处理以 减少酶表达。本领域普通技术人员可选择从碳水化合物上切割(消化)小寡糖和对溶酶体酶的 天然底物具有“特异性”(即，主要消化)的合适酶。例如，为检测GALNS或GLBl (降解硫酸角质素的酶)的活性，步骤(d)的酶可以是角质素酶II或主要作用于硫酸角质素的任何酶。再例如，为检测IDU、ARSB, IDS或GUSB (降解硫酸皮肤素的酶)，步骤(d) 的酶可以是软骨素酶ABC或主要作用于硫酸皮肤素的任何酶。再例如，为检测IDU、 IDS、SGHS> G6S或GUSB (降解硫酸乙酰肝素的酶)，步骤(d)的酶可以是类肝素酶I 或类肝素酶II，或二者。再例如，为检测GAA(降解糖原的酶)，步骤(d)的酶可以是 α-淀粉酶或主要作用于糖原的任何酶。 该细胞方法能以高灵敏度检测溶酶体酶活性。在一些实施方式中，当溶酶体酶 浓度低至约ΙΟηΜ、或约5nM、或约InM、或约0.75nM、或约0.5nM、或约0.25nM、或 约O.lnM、或约0.05nM、或约O.OlnM、或约0.005nM、或约ΙρΜ、或约0.5pM时亦可检 测溶酶体酶活性。
II.纯化溶酶体硫酸酯酶含有重组人GALNS的生物反应器材料经0.2 μ m无菌过滤，4°C保存。将生物 反应器材料直接加载到捕捉柱上，或先通过超滤浓缩10-或20-倍再加载到捕捉柱上。 将生物反应器材料或浓缩的生物反应器材料的pH调节至pH 4.5，然后加载到蓝-琼脂糖 柱上，用20mM乙酸/磷酸，50mM NaCl, pH 4.5和20mM乙酸/磷酸，50mM NaCl, pH 6.0顺次洗涤，用20mM乙酸/磷酸，IOOmMNaCl, pH 7.0洗脱。然后将蓝-琼脂糖 柱洗脱液加载到Fractogel SE Hi-Cap上，用2OmM乙酸/磷酸，5OmM NaCl, pH 5.0禾口 20mM乙酸/磷酸，50mM NaCl, pH 5.5顺次洗涤，用20mM乙酸/磷酸，50_350mM NaCl 梯度，pH 5.5 洗脱。用 IOmMNaOAc, ImM NaH2PO4, 0.005%吐温-80，pH 5.5 配 制 Fractogel SEHi-Cap 洗脱液。或者，先通过超滤将含重组人GALNS的生物反应器材料浓缩20-倍，再加 载到捕捉柱上。将浓缩的生物反应器材料的pH调节至pH 4.5，然后加载到Fractogel SE Hi-Cap柱上，用IOmM乙酸/磷酸，50mM NaCl, pH 4.5禾Π IOmM乙酸/磷酸， 50mM NaCl, pH 5.0 顺次洗涤，用 IOmM 乙酸 / 磷酸，140mMNaCl，pH 5.0 洗脱。然 后将Fractogel SE Hi-Cap柱洗脱液调节至500mMNaCl，pH 7.0，加载到Zn-螯合琼脂 糖(Zn-IMAC)柱上，用 IOmM 乙酸 / 磷酸，125mM NaCl, IOmM 咪唑，pH 7.0 洗涤， 用IOmM乙酸/磷酸，125mMNaCl，90mM咪唑，pH 7.0洗脱。将Zn-螯合琼脂糖 (Zn-IMAC)柱洗脱液调节至pH 3.5以便低pH病毒灭活，调节至IOmM乙酸/磷酸，2M NaCl, pH5.0,然后加载到 ToyoPearl Butyl 650M 柱上，用 IOmM 乙酸 / 磷酸，2MNaCl， pH 5.0 洗涤，用 IOmM 乙酸 / 磷酸，0.7MNaCl，pH 5.0 洗脱。超滤 ToyoPearlButyl 650M 洗脱液，在20mM乙酸，ImM磷酸，150mMNaCl，pH 5.5中透析，然后用20mM乙酸， ImM 磷酸，150mMNaCl，0.01%吐温-20，pH 5.5 配制。下文详细描述了重组人GALNS的纯化，下文详细描述了按照以上方案的改进方 法纯化重组人GALNS。如实施例III所述，在G71S细胞中表达重组人GLANS酶，如实施例V所述 纯化。可将本发明的纯化重组人GALNS与其它GALNS记录制品比较。Masue等 (J.Biochem.110 965-970，1991)描述了人胎盘的GALNS的纯化和表征。发现纯化酶的 分子量为120kDa，由40kDa和15kDa的多肽构成，后者证明是糖蛋白。因此Masue等 的GALNS酶看来对应于图5所述的加工形式。Bielicki等(Biochem.J.279 515-520，1991)描述了人肝的GALNS的纯化和表征。当通过SDS-PAGE分析时，该酶在非还原 性条件下的分子量为70kDa，还原性条件下的分子量为57kDa、39kDa和19kDa。Bielicki 等(Biochem.J.311 333-339，1995)描述了中国仓鼠卵巢细胞的重组人GALNS的纯化和 表征。将SDS-PAGE发现纯化酶在非还原性条件下的分子量为58-60kDa，还原性条件下 的分子量为55-57kDa、39kDa和38kDa。因此，Bielicki等的GALNS酶看来对应于图5 所述酶的加工前(前体)形式和加工形式的混合物。相比之下，本发明的重组人GALNS 酶基本上完全由酶的前体形式构成(见图9)，或主要(即，至少约85% )酶的前体形式 构成(见图10)。 IV.溶酶体硫酸酯酶和溶酶体贮积症溶酶体硫酸酯酶是全长酶或保留该酶治疗或生物学活性(例如，硫酸酯酶活性) 的至少大部分(例如，至少约50%、优选至少约75%、更优选至少约90%)，基本上全 部，或全部的其任何片段、突变体、变体或衍生物。在一些实施方式中，溶酶体硫酸酯酶是如果未表达或未产生，或者如果表达或 产生的实质性降低会产生疾病，包括但不限于溶酶体贮积症的酶。在一些实施方式中， 溶酶体硫酸酯酶是如果未表达或未产生，或者如果表达或产生的实质性降低可能不产生 疾病，但其不存在或表达或产生的降低与疾病，包括但不限于溶酶体贮积症有关的酶。 溶酶体硫酸酯酶优选衍生自或得自人。在溶酶体贮积症的治疗中，溶酶体硫酸酯酶优选是如果未表达或未产生，或者 如果表达或产生的实质性降低会产生溶酶体贮积症的酶。或者，在溶酶体贮积症的治疗 中，溶酶体硫酸酯酶是其不存在或表达或产生的实质性降低与疾病有关，但其不存在或 表达或产生的实质性降低可能本身不产生疾病的酶。溶酶体硫酸酯酶优选衍生自或得自 人。所述酶优选溶酶体硫酸酯酶，例如芳基硫酸酯酶A (ARSA) (Genbank登录号NP 000478 (同种型a)，Genbank登录号NP 001078897 (同种型b)和前体变体)、芳基硫酸酯 酶B/N-乙酰葡糖胺-4-硫酸酯酶(ARSB) (Genbank登录号P15848)、艾杜糖醛酸_2_硫 酸酯酶(IDS) (Genbank登录号NP 000193 (同种型a)、Genbank登录号NP 006114 (同种 型b))、磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH) (Genbank登录号NP 000190)、N_乙酰葡 萄糖胺_硫酸酯酶(G6S) (Genbank登录号NP 002067)和半乳糖_6_硫酸酯酶/N-乙酰半 乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS) (Genbank登录号NP 000503)。溶酶体贮积症和其中缺乏 的可用作治疗剂的溶酶体硫酸酯酶的表格如下所示溶酶体贮积症溶酶体硫酸酯酶缺乏粘多糖贮积病II型亨特综合征艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶粘多糖贮积病IIIA型桑菲列普综合征磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶粘多糖贮积病IIID型桑菲列普综合征N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶粘多糖贮积病IVA型莫尔基奥综合征 N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶粘多糖贮积病VI型N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶异染性脑白质营养不良(MLD)芳基硫酸酯酶A多发性硫酸酯酶缺乏症(MSD)多种硫酸酯酶在优选的实施方式中，溶酶体硫酸酯酶是内含体酸化_缺陷型细胞系产生的重组人溶酶体硫酸酯酶。在更优选的实施方式中，重组人溶酶体硫酸酯酶是有活性的，具有高水平的磷酸化寡糖，如“定义”所规定。在最优选的实施方式中，溶酶体硫酸酯酶 是活性高度磷酸化重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。因此，可采用本发明方法治疗或预防的溶酶体贮积症包括但不限于异染性脑 白质营养不良或MLD、马-兰二氏综合征或MPS VI、亨特综合征或MPSII、桑菲列普A 综合征或MPS Ilia、桑菲列普D综合征或MPS Illd、和莫尔基奥A综合征或MPS IVa。 在特别优选的实施方式中，溶酶体硫酸酯酶是其缺乏会导致桑菲列普A综合征或MPS IVa 的酶。在另一特别优选的实施方式中，溶酶体硫酸酯酶是其缺乏与人溶酶体贮积症，例 如多发性硫酸酯酶缺乏症或MSD有关的酶。因此，根据上表，对于各疾病，溶酶体硫酸酯酶优选包括疾病中缺乏的特定活 性溶酶体硫酸酯酶。例如，对于涉及MPS II的方法，优选的酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸 酯酶。对于涉及MPS IIIA的方法，优选的酶是磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶。对于涉 及MPS IIID方法，优选的酶是N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶。对于涉及MPS IVA的方 法，优选的酶是半乳糖6-硫酸酯酶/N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。对于涉及MPSVI 的方法，优选的酶是N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶。对于涉及异染性脑白质营养不良 (MLD)的方法，优选的酶是芳基硫酸酯酶A。对于涉及多发性硫酸酯酶缺乏症(MSD) 的方法，酶可以是芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B/N-乙酰葡萄糖胺4-硫酸酯酶、艾杜 糖醛酸-2-硫酸酯酶、磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶、N-乙酰葡萄糖胺_硫酸酯酶或半 乳糖6-硫酸酯酶/N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，优选的酶是半乳糖6-硫酸酯酶/N-乙 酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。V.粘多糖贮积病IVA型(莫尔基奥综合征，MPS IVA)粘多糖贮积病IVA型(莫尔基奥综合征，MPS IVA)是属于粘多糖贮积病的遗 传性、常染色体隐性疾病。降解两种葡萄糖胺聚糖(GAG)，硫酸角质素(KS)和软骨 素-6-硫酸(C6S)所需的溶酶体酶缺乏导致莫尔基奥综合征。具体地说，MPS IVa的特征 在于缺乏酶N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)以及KS分泌入尿液。缺乏GALNS 导致透明软骨(骨骼组织的主要组分)中异常累积大量的粘多糖。所有患者具有全身性 骨骼发育异常。其它症状在严重性上患者与患者之间不同，可包括听力丧失、白内障、 脊柱不稳、心脏瓣膜病和呼吸问题等。GALNS水解KS上半乳糖-6-硫酸的硫酸酯键和C6S上N_乙酰半乳糖胺_6_硫 酸的硫酸酯键。人GALNS表达为55-60kDa前体蛋白，其中只有两个潜在的天冬酰 胺_连接糖基化位点。甘露糖-6-磷酸(M6P)是GALNS分子上存在的寡糖的一部分。 溶酶体细胞表面的受体识别M6P，因此对于GALNS的有效摄取至关重要。与所有硫酸酯酶相似，GALNS需要由硫酸酯酶修饰因子1 (SUMFl)基因编码的 甲酰甘氨酸_活化酶(FGE)加工以获得活性。由于该活化步骤涉及活性位点半胱氨酸残 基翻译后修饰成Ca-甲酰甘氨酸(FGly)，重组硫酸酯酶的过表达可导致硫酸酯酶产生的 比活性低(即，活化和非活化硫酸酯酶的混合物)且产生滴度低(即，非活化硫酸酯酶的 降解和/或未分泌)。本发明的目的是提供可用于治疗N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶缺乏相关的莫尔 基奥综合征和其它疾病，例如多发性硫酸酯酶缺乏症(MSD)的活性高度磷酸化人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。此类活性高度磷酸化人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶能定位 于KS和C6S累积的组织，具有充足的M6P水平以供有效摄取、对于酶活性有足够高百 分比的FGly并具有较高产生水平。应该理解，本文所述的本发明方法适用于产生其它溶酶体硫酸酯酶，例如芳基 硫酸酯酶A(ARSA)、芳基硫酸酯酶B/N-乙酰葡糖胺-4-硫酸酯酶(ARSB)、艾杜糖醛 酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)和N_乙酰葡萄糖胺_硫 酸酯酶(G6S)，这些酶可用于治疗其缺乏导致的或特征在于其缺乏的溶酶体贮积症。

VI.药物组合物和给药可通过各种途径给予本发明的溶酶体硫酸酯酶。对于口服制品，可单独使用 或与合适添加剂联用溶酶体硫酸酯酶以制备片剂、粉末、颗粒或胶囊，例如，常规添加 齐U，如蔗糖、甘露糖、玉米淀粉或马铃薯淀粉；粘合剂，如微晶纤维素、纤维素衍生 物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素 钠；润滑剂，如滑石粉或硬脂酸镁；以及如果需要，可含有稀释剂、缓冲剂、润湿剂、 防腐剂和调味剂。可通过将本发明的溶酶体硫酸酯酶溶解、悬浮在水性或非水性溶剂，例如植物 油或其它类似油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇中或在其中乳化而配 制成注射制品；如果需要，可含有常规添加剂，例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化 齐U、稳定剂和防腐剂。可本发明的溶酶体硫酸酯酶可采用气溶胶制剂以便经吸入给药。可将本发明的 溶酶体硫酸酯酶配制入加压的可接受推进剂，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。此外，可通过与各种基料，例如乳化基料或水溶性基料混合将本发明的溶酶体 硫酸酯酶制成栓剂。可采用栓剂经直肠给予本发明的溶酶体硫酸酯酶。栓剂可包含在体 温下融化，但在室温下是固体的载体，例如可可油、碳蜡和聚乙二醇。可提供口服或直肠给药的本发明溶酶体硫酸酯酶的单位剂型，例如糖浆、酏剂 和混悬液，其中各剂量单位，例如一茶匙、一汤匙、一片或一枚栓剂含有预定量的含活 性剂的溶酶体硫酸酯酶。类似地，用于注射或静脉内给药的单位剂型可包含溶酶体硫酸 酯酶，例如无菌水、普通盐水或另一种药学上可接受的运载体配制的溶液。在实际应用中，本发明的溶酶体硫酸酯酶可作为活性成分与常规药物混合技术 的一种或多种药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂密切混合。根据给药，例如口服 或胃肠外(包括静脉内)所需制品的优选形式，运载体、稀释剂或赋形剂可采取各种形 式。制备口服剂型的溶酶体硫酸酯酶组合物时，可利用任何常用的药物介质，在口服液 体制品，例如混悬液、酏剂和溶液的情况下，可用例如水、甘油、油、醇类、调味剂、 防腐剂、着色剂等；在口服固体制品，例如粉末、硬和软明胶胶囊和片剂的情况中，或 可用运载体，例如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂 等，其中固体口服制品优于液体制品。对于经皮给药途径，经皮给予药物的方法见《雷明顿药物科学》，第17版 (Geimaro等编，马克出版公司，1985)。真皮或皮肤贴剂是经真皮递送本发明溶酶体硫 酸酯酶的优选方式。贴剂最好提供吸收增强剂，例如DMSO以增加溶酶体硫酸酯酶的 吸收。经皮药物递送的其它方法见各自通过引用全文纳入本文的美国专利号5,962,012、6,261,595 和 6,261,595。药学上可接受的赋形剂，例如载体、佐剂、运载体或稀释剂可商品化购得。此 夕卜，药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂 等也了商品化购得。在各方面，溶酶体硫酸酯酶组合物包括但不限于适合口服、直肠、局部、胃 肠外(包括皮下、肌肉内和静脉内)、肺部(鼻部或口腔吸入)或鼻部给药的组合物，但 是任何给定情况中最合适的途径部分取决于所治疗病症的性质和严重程度以及活性成分 的性质。示范性给药途径是口服和静脉内途径。溶酶体硫酸酯酶组合物可以方便地采取 单位剂型，可通过药学领域熟知的任何方法制备。由于它们便于给药，片剂和胶囊代表了最有利的口服单位剂型，该情况明显利 用固体药物运载体。如果需要，可通过标准的水性或非水性技术包衣片剂。这些组合物 中活性溶酶体硫酸酯酶的百分比当然可变，可以方便地采取单位重量的约2% -约60%。可将本发明的溶酶体硫酸酯酶包裹在病毒包膜或囊泡中或与其相连或掺入细胞 中而给予。囊泡是通常为球形并常是脂类的微团颗粒(micellularparticle)。脂质体是双 层膜形成的囊泡。合适的囊泡包括但不限于单层囊泡和多层脂质囊泡或脂质体。可采 用标准技术，例如美国专利号4,394,448所述的从各种脂质或磷脂化合物制备此类囊泡和 脂质体，例如磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、糖脂、神 经节苷脂等。可利用此类囊泡或脂质体胞内给予溶酶体硫酸酯酶并将溶酶体硫酸酯酶递 送至靶器官。还可采用胶囊化实现感兴趣溶酶体硫酸酯酶的控释(参见，例如美国专利 号 5,186,941)。可采用将溶酶体硫酸酯酶组合物稀释入血流，或优选至少血脑屏障外侧的任何 给药途径。优选外周，最优选静脉内或经心导管给予溶酶体硫酸酯酶组合物。还可采用 颈静脉内和颈动脉内注射。可局部或区域性地，例如腹膜内、皮下或肌肉内给予溶酶体 硫酸酯酶组合物。在一方面，溶酶体硫酸酯酶组合物与一种或多种药学上可接受的运载 体、稀释剂或赋形剂组合给予。技术人员不难知道剂量水平可与具体溶酶体硫酸酯酶、症状的严重程度和对象 对副作用的敏感性呈函数变化。本领域技术人员通过各种方法不难测定给定溶酶体硫酸 酯酶的优选剂量，包括但不限于在患者、测试动物和体外进行剂量反应和药代动力学评 估。待给予的剂量还可取决于个体需要、所需作用、所用的具体溶酶体硫酸酯酶和 所选的给药途径。溶酶体硫酸酯酶的剂量范围是约0.2皮摩尔/公斤到约20纳摩尔/公 斤，优选的剂量范围是2皮摩尔/公斤到2纳摩尔/公斤，特别优选的剂量范围是2皮摩 尔/公斤到200皮摩尔/公斤。或者溶酶体硫酸酯酶的剂量范围可以是0.01到IOOOmg/ kg。优选的剂量范围可以是0.1到lOOmg/kg，特别优选的剂量范围是0.1到lOmg/kg。这 些剂量会受以下的影响，例如但不限于具体的溶酶体硫酸酯酶、药物组合物的形式、 给药途径、具体溶酶体硫酸酯酶的作用部位。本发明的溶酶体硫酸酯酶可在动物，特别是人中用于治疗性、预防性和诊断性 干预。溶酶体硫酸酯酶可显示优先累积在特定组织中。诊断性应用的优选医学适应症包 括，例如感兴趣的靶器 官(例如，肺、肝、肾、脾)相关的任何病症。
所述 方法可用于治疗各种不同疾病。在某些实施方式中，特别感兴趣的是在以 前鉴定了具有所需活性的溶酶体硫酸酯酶，但该溶酶体硫酸酯酶未充分递送至靶部位、 区域或区室的疾病中采用所述方法以产生完全满意的治疗结果。利用此类溶酶体硫酸酯 酶，可采用产生活性高度磷酸化硫酸酯酶的所述方法增强溶酶体硫酸酯酶的疗效和治疗 指数。治疗表示包括对溶酶体硫酸酯酶给药相关对象有益的任何结果，包括生病的可 能性降低、预防疾病、减缓、终止或逆转疾病的进展或缓解宿主所罹患疾病的相关症 状，其中缓解或益处按广义使用，其至少指所治疗的病理性状况，例如相关炎症和疼痛 的相关参数，例如症状的量级降低。因此，治疗还包括完全抑制，例如防止发生，或终 止，例如终结病理性状况，或至少相关症状的情况，从而宿主不再患有该病理性状况， 或至少不再受该病理性状况的特征性症状之苦。所述方法可治疗各种宿主或对象。此类宿主通常是“哺乳动物”，可广泛利用 这些术语描述哺乳动物纲的生物，包括以下目，食肉动物(例如，狗和猫)、啮齿目(例 如，小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目(例如，人、黑猩猩和猴)。在许多实施方式中，宿主 是人。现已总体上描述了本发明，参考以下实施例更易于理解本发明，这些实施例提 供了活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的产生和纯化以及它们用于治疗溶酶体贮积症的示 范性方案。提供这些实施例只是为了说明的目的，不是要以任何方式限制本发明的范 围。已努力确保所用数值(例如，数量、温度等)的准确性，但当然应考虑到一些实验 误差和偏差。
实施例实施例1人硫酸酯酶修饰因子1 (SUMFl)和人N_乙酰半乳糖胺_6_硫酸酯酶(GALNS)的哺乳动物表达载体目标是构建哺乳动物表达载体，其适合在稳定转染的细胞中产生充足量的磷酸 化水平提高的活性溶酶体硫酸酯酶。将编码374氨基酸多肽的全长人硫酸酯酶修饰因子1 (SUMFl)cDNA(参见美国 专利申请号US 20005/0123949，公布日期2005年6月9日，US2004/0229250，公布日 期2004年11月8日，二者通过引用全文纳入本文)克隆入加利福尼亚州卡尔斯巴德市 英杰公司(Invitrogen，Carlsbad, CA)的哺乳动物表达载体cDNA4，其含有人CMV增强 子-启动子和多克隆位点。有牛生长激素多腺苷酸化序列存在确保有效的转录终止。选 择标记是EM-7启动子和SV40早期多腺苷酸化序列控制下的零霉素耐受性基因。得到的 质粒称为 pcDNA4SUMFl。人 SUMFl 多核苷酸(SEQ ID NO 1)和多肽(SEQ IDNO 2)序列分别示于图1和图2。将编码包含一 26氨基酸信号肽的522氨基酸多肽的全长人N-乙酰半 乳糖胺 _6_ 硫酸酉旨酶(GALNS) cDNA(参见 Tomatsu 等，Biochem.Biophys.Res. Commun. 181(2) 677-683，1991)克隆入生物马林公司(BioMarin)的哺乳动物表达载体
pCIN,其含有连接于家兔β-珠蛋白IVS2内含子的人CMV增强子-启动子和多克隆位点。有牛生长激素多腺苷酸化序列存在确保有效的转录终止。选择标记是携带点突变以 降低酶效率的新霉素磷酸转移酶基因。用弱HSV-&启动子进一步妨碍减弱的标记。得 到的质粒称为pCIN 4A。人GALNS多核苷酸(SEQ ID NO 3)和多肽(SEQ ID NO 4) 序列分别示于图3和图4。 为增加SUMFl和GALNS的表达水平，将支架/基质连接区(MAR)元件(参 见Mermod等，美国专利号7,129,062)克隆如SUMFl和GALNS表达质粒。用BamHI 和 HincII 消化赛莱克斯公司(Selexis)的 P < 168X X NcoI 填充 MAR， 然后将释放的MAR片段插入BglII和NraI消化的pcDNA4SUMFl来制备BMAR SUMFl。用HindIII和XbaI消化赛莱克斯公司的P < 168NcoI填充(MAR) SV40EGFP以 除去EGFP基因，然后插入通过HindIII和XbaI消化从pcDNA4SUMFl释放的SUMFl基 因来制备PMAR SUMFl。用PrneI和SpeI消化BMAR SUMFl以除去SUMFl基因，然后插入通过PmeI禾口 SpeI消化从pCIN 4A释放的GALNS基因来制备BMAR 4A。用HindIII和XbaI消化赛莱克斯公司的P < 168NcoI填充(MAR) SV40EGFP以 除去EGFP基因，然后插入通过HindIII和XbaI消化从pCIN 4A释放的GALNS基因来制 备 PMAR 4A。还将全长人GALNS CDNA克隆入加利福尼亚州卡尔斯巴德市英杰公司的哺乳动 物表达载体pcDNA4。用HindIII和XbaI消化pCDNA4SUMFl以除去SUMFlcDNA，用 HindIII 和 XbaI 消化 pCIN 4A 以分离 GALNS cDNA。将 GALNS cDNA Hindlll/Xbal 片段 连接入pcDNA4载体Hindlll/Xbal片段。得到的质粒称为pcDNA4_4A。利用新英格兰生物实验室获得的酶进行限制性作图来证实pCIN 4A、BMAR和 pCDNA4-4A表达载体中GALNS基因的完整性。PMAR 4A表达载体未作图。人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的完全加工形式的结构描述于图5。 GALNS表达为含一 26氨基酸信号肽序列的522氨基酸多肽。496氨基酸GALNS多肽分 泌为约55-60kDa的酶加工前(前体)形式。在活性GALNS中，前体或完全加工GALNS 多肽中53位(对应于全长GALNS多肽的79位)的半胱氨酸残基通过硫酸酯酶修饰因子 1 (SUMFl)转变成Ca-甲酰甘氨酸(FGly)。在溶酶体中，在完全加工GALNS多肽的325 位后切割GALNS，产生约40kDa和19kDa的GALNS肽片段。这些GALNS肽通过完全 加工GALNS多肽的282和393位的半胱氨酸(C)残基之间的二硫键桥连接。完全加工 GALNS多肽的178和397位有两个标准N_连接的糖基化位点。在N178，而非N397上 发现包含2个甘露糖-6-磷酸残基的双-磷酸化甘露糖7 (BPM7)。实施例II共同表达人硫酸酯酶修饰因子I(SUMFl)和人N_乙酰半乳糖胺_6_硫酸酯酶 (GALNS)的G71S细胞系目标是开发能产生磷酸化水平提高的活性溶酶体硫酸酯酶的细胞系。G71 细胞(Rockford K.Draper)直接衍生自 CHO-K1 (ATCC CCL-61)。对于 内含体的酸化，G71细胞系是CHO-Kl的温度敏感性突变体，观察到其在升高温度下 对于几种酶的总蛋白分泌和甘露糖残基磷酸化方面有所不同(Park等，Somat.Cell Mol. Genet. 17 (2) 137-150，1991 ； Marnell 等，J.Cell.Biol.99 (6) 1907-1916，1984)。
在34°C下将G71细胞维持在补加了 2.5%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、庆大霉素 和两性霉素的BioWhittaker UltraCHO培养基中。为 能更方便地利用细胞系以供蛋白质产生，采用使贴璧依赖性、血清依赖性哺 乳动物细胞适应于高密度无血清悬浮培养的方案使贴璧G71细胞预先适应于无血清生长 培养基(Sinacore等，Mol.Biotechnol.15 (3) 249-257，2000)，从而产生无血清悬浮培养 适应性细胞系，G71S。或者，如下所述稳定转染后，可如Sinacore等所概述使得贴璧 G71细胞适应于无血清生长培养基。按照赛莱克斯公司所述的MARtech II方案，将人SUMFl和人GALNS表达载体 的成对组合(实施例 I)，pcDNA4SUMFl+pCIN44A> BMAR SUMF1+BMAR 4A 或 PMAR SUMF1+PMAR 4A转化入在补加抗生素-抗真菌溶液(100IU青霉素，IOmg链霉素， 25yg两性霉素B，赛尔格罗公司(Cellgro))的培养基中生长的G71S细胞。转染子合并物 在补加 5% Y-照射胎牛血清(FBS，JRH)、200yg/mLG418(科学公司(AGScientific)) 和200 μ g/mL零霉素(英杰公司)的UltraCHO培养基(坎布莱克斯公司(Cambrex))中 生长，在96-孔板中用相同生长培养基通过有限稀释进行克隆。通过细胞筛选(伊诺瓦 蒂斯公司(Imiovatis))成像监测克隆生长。采用酶捕捉活性ELISA筛选所有克隆的活性 GALNS (参见实施例IV)。在4天期间，将GALNS活性的酶捕捉活性ELISA值除以每 天细胞生长(V-C公司，贝克曼计数器(Vi-Cell，Beckman Coulter))来计算细胞产量。制备了 202个G71S克隆并筛选活性GALNS 用pcDNA4SUMFl+pCIN4A共转 染86个克隆，用BMAR SUMF1+BMAR 4A共转染65个克隆，用PMAR SUMF1+PMAR 4A共转染51个克隆。首先根据96-孔组织培养板的高水平活性GALNS选择克隆(图 6A)。采用酶捕捉活性ELISA检测GALNS活性，表示为ng/mL (y-轴)。χ-轴显示了 用于SUMFl和GALNS表达的三种共转染条件hCMV启动子，不含MAR ； hCMV启 动子，含MAR;和SV40启动子，含MAR。各柱代表各群体的一个克隆。该96-孔克 隆筛选未说明细胞密度，该图未显示所有的共转染G71S克隆。选择产生最高活性GALNS的G71S克隆用于产量分析(图6B)。每日细胞产量 以皮克/细胞/天计，将GALNS活性除以该天的细胞密度得到每日细胞产量。该图显 示以5x10s个细胞/烧瓶接种后的第4天(96小时)。采用酶捕捉活性ELISA检测克隆 的GALNS，以皮克/细胞/天计(y_轴)。正对照由表达GALNS的BHK和CHO克隆 (生物马林公司)组成。各垂直柱表示一个克隆。pCIN4A克隆产生活性GALNS，但仅 比试验背景高少许。 通过96-孔筛选和4-天产量试验分析克隆证明与不含MAR元件的表达载体共转 染相比，含MAR元件的表达载体共转染提高了 G71S克隆的生产力。BMAR4A+BMAR SUMFl共转染的克隆显示合并物产生快速、克隆生长快速并且产生的活性GALNS是产 量最高的PMAR 4A克隆的2倍，以及与缺乏MAR元件的CHO 4A和BHK 4A克隆相比
升高最多10倍。表达 GALNS 的 G7IS 克隆适应于采用 Sinacore 等(Mol.Biotechnol.15 (3) 249-257，2000)概述方案的无血清生长培养基。在有两种选择试剂(200 μ g/mL的零霉 素，200 μ g/mL的新霉素)存在下进行完整的适应改造。将T-烧瓶中培养的表达GALNS 的 G71 克隆分入(1)含 Cambrex UltraCHO 培养基和 5% FBS (批号 8L2242)的 125mL烧瓶；⑵含JRH 302M培养基(生产培养基)禾Π 5 % FBS的125mL烧瓶；(3) T-烧瓶中作为储备物(UltraCHO，5%FBS)。一旦产生了悬浮培养物，弃去贴壁细胞，开始不 再供应FBS。当生长率回归至>0.5(1/天)，3代，存活率>95%时，将FBS浓度降低 50%。细胞在任何给定的FBS浓度下维持最少3代。一旦适应在2.5% FBS中生长， 将细胞直接加入无血清培养基。细胞储存在含10% (v/v)DMSO的新鲜培养基中。检 验实验性融化以确保细胞能在冷冻过程中存活。BMAR 4A+BMAR SUMFl转染的表达 GALNS的两种G71S克隆，克隆4和5传大约15代以便适应无血清悬浮培养。还分离 了 pcDNA4SUMFl+pCIN 4A转染的GALNS表达克隆，使之适应无血清培养。除了用200yg/mL零霉素(英杰公司)进行选择，基本上如上所述，将人 SUMFl和人GALNS表达载体的成对组合(实施例I)，pcDNA4SUMFl+pCDNA4_4A转 化入G71S细胞。基本如上所述分离6种GALNS表达克隆，C2、C5、C7、CIO、Cll 和C30，使它们适应于无血清悬浮培养。实施例III大规模培养表达人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的G71S细胞系目的是检测表达人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的G71S克隆的酶 产量。大规模培养共同表达人SUMFl和人GALNS的适应无血清培养的G71S细胞系并 评估活性GALNS酶产量。由于G71S宿主细胞系适应无血清悬浮培养较快，确定可在以灌注方式操作的 WAVE生物反应器中进行生产。WAVE生物反应器的接种体积具有较大灵活性，因为可 直接在袋中进行规模放大，从而降低污染风险并加速物质产生。图7显示WAVE生物反 应器装置的示意图。该图以灌注方式显示加载室通过测定袋重量并调节进料和收集速度 来监测袋中的培养基体积以便维持理想体积。在IOL袋中，还通过插入袋中的探针将pH 控制在所需设置点。表达GALNS的G7IS克隆4和5产生的物质是IL规模。在这些操作中不控制 培养pH。WAVE袋的操作极限是每天3容器体积(VV/天)的处理量。为防止物质有 任何灭活，靶细胞单位灌注速度(CSPR，target cell specificperfusion rate)是0.3纳升/细 胞/天，从而导致GALNS的平均停留时间是8小时。因此，袋中的细胞密度维持在约 10-12xl06个细胞/毫升。表达GALNS的G71S克隆4和5的生长速度分别是0.16和 0.20。从袋中直接放出以维持靶细胞密度。将收集液pH调节至pH 5.5-6.5以维持酶活性，因为已证明GALNS在pH6时稳 定。这可通过在离开反应器的收集液中定时推注加入5体积％ pH 4.0柠檬酸钠缓冲液得 以实现。将调节的收集液保存在4°C，再进行下游处理。表达GALNS的两个G71S克 隆，4和5的平均滴度约为4.2mg/L，相关的单位生产率是约1.25皮克/细胞/天。表达GALNS 的 G71S 克隆，C2、C5、C6、C7、C10、C 11 和 C30 作类似的大 规模培养，并评估活性GALNS酶产生。实施例IV检测人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的浓度和活性开发酶联免疫吸附测定(ELISA)以检测共同表达人SUMFl和人N_乙酰半乳糖 胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的G71S克隆的GALNS酶浓度和活性。
酶捕捉活性ELISA结合于ELISA平板 的抗-GALNS特异性抗体捕捉后，酶捕捉活性ELISA检测固 相的GALNS酶活性。缓冲液.缓冲液A(碳酸缓冲液)将3.09克Na2CO3和5.88克NaHCO3溶解 于900mL去离子(DI)H2O中，然后加入DI H2O至终体积为lOOOmL。检测pH是否在 9.4-9.6，然后过滤除菌。为用100微升每孔完全包被1块96-孔微量滴定板，将19 μ L 抗-GALNS抗体稀释入一个试管(12mL)。缓冲液B (ELISA阻断缓冲液和连续稀释缓冲 液)Ix酸性PBS，0.05%吐温-20和2% BSA，用乙酸调节至pH 6.5。缓冲液Bw(洗 涤缓冲液)IOOmMNaOAc和0.05%吐温-20，用乙酸调节至pH 6.5。缓冲液C (底物缓 冲液)25mM乙酸钠，ImMNaCI，0.5mg/mL脱盐BSA和0.01 %叠氮钠，用冰醋酸调 节至pH4.0。缓冲液D( β-半乳糖苷酶缓冲液)300mM磷酸氢二钠，O.lmg/mlBSA， 0.01%叠氮钠和0.01%吐温-20，用磷酸调节至pH 7.2。缓冲液E (终止缓冲液)350mM 甘氨酸和440mM碳酸缓冲液，用6M NaOH调节至pH 10.7。试剂.抗-GALNS IgG抗体多克隆兔抗体是从血清中纯化的G蛋白。在 D-PBS中，总蛋白=3.17mg/mL(BCA)。将试样(WyL)储存在_20°C以供单次使用。 4MU-Gal-6-S底物(固体；440MW) DI水制备的IOOmM储备物，储存在4°C。β -半 乳糖苷酶(Sigma G-4155)先用缓冲液D稀释至12 μ g/mL再使用。方案将抗-GALNS抗体结合于平板用缓冲液A配制的最终蛋白质浓度 为 5 μ g/mL 的抗-GALNS 包被 Nunc MaxiSorp ELISA 平板(NN 国际公司(Nalge/Nunc International)，费希尔(Fisher)编号12-565-135)。为制备该溶液，融化1份19 μ L试样， 用微型离心机简单离心(10秒)以收集液体。将所有19 4 1^转移入120^缓冲液人。通 过颠倒剧烈混合，然后倒入储器，再用多通道移液管进行平板加载(100微升/孔)。覆盖 该平板，4°C温育过夜。除去未结合的抗-GALNS抗体用缓冲液B w溢流三次来洗涤该 平板。阻断用缓冲液B (320微升/孔)阻断该平板，然后覆盖该平板，37°C温育1小 时。在阻断步骤期间制备纯化GALNS标准品和测试样品(未知)的稀释系列用缓冲液 B将标准品稀释至该试验线性范围的高端(high end) (128ng/mL，A行)，然后在96-孔板 的B-G行中作连续稀释(2-倍)。H行是缓冲液空白(即，无GALNS酶)。首先用缓 冲液B制备500yL，浓度为128ng/mL。然后用缓冲液B作2-倍连续稀释(250 μ L加入 250yL)直至达到2ng/mL。除去阻断缓冲液阻断步骤后，弃去缓冲液B。将GALNS 酶和测试样品结合于抗-GALNS抗体将连续稀释的标准品和测试样品以100微升/孔加 载于平板(一式两份)。覆盖该平板，37°C下温育1小时。除去GALNS抑制剂用缓 冲液Bw溢流来洗涤该平板，三次。加入GALNS底物(第一反应)制备足够的最终底 物溶液以便每孔加载100微升(在使用前1小时内制备)。用缓冲液C将4MU-Gal_6-S 储备液(IOOmM)稀释至ImM。每孔加载100微升。覆盖该平板，37°C下温育30分钟。 加入β -半乳糖苷酶(第二反应):将缓冲液D配制的50 μ L 12 μ g/ml β -半乳糖苷酶 加入各孔。覆盖该平板，37°C下温育15分钟。终止反应向各孔中加入100 μ L缓冲 液Ε(终止缓冲液)以使释放的4MU电离。转移至荧光板(fluoroplate)将ELISA平板 各孔的250 μ L中的200 μ L ( —次8孔)转移至黑色未处理平底微量滴定板(荧光板，柯 斯达(Costar)编号3915)。读取荧光采用SOFTmax PRO程序(366nm激发，446nm发射，435nm截断)，用分子装置公司(MolecularDevicesCorporation)的Gemini平板读数 计对平板读数。GALNS ELISA采用夹心免疫测定，GALNS ELISA检测细胞培养条件化培养基或其它工艺样品 的GALNS酶浓度。缓冲液.缓冲液A(碳酸缓冲液):将3.09克Na2CO3和5.88克NaHCO3溶解 于900mL去离子(DI)H2O,然后加入DI H2O至最终体积为lOOOmL。检测pH是否在 9.4-9.6，然后过滤除菌。为用100微升每孔完全包被1块96-孔微量滴定板，将19 μ L 抗-GALNS抗体稀释入一个试管(12mL)。缓冲液B (ELISA阻断缓冲液和连续稀释缓冲 液)Ix酸性PBS，0.05%吐温-20和2% BSA，用乙酸调节至pH 6.5。缓冲液Bw(洗 涤缓冲液)IOOmMNaOAc和0.05%吐温-20，用乙酸调节至pH6.5。缓冲液F(终止缓 冲液)2N H2SO4 总共 600mL，加入 IOOmL 12N H2SO4 和 500mL MilliQ 水。试剂.抗-GALNS IgG抗体兔多克隆抗体是从血清中纯化的G蛋白。在D-PBS 中，总蛋白=3.17mg/mL(BCA)。将试样(19 μ L)储存在_20°C以供单次使用。HRP-偶 联的检测抗体(RIVAH)用D_PBS/1%BSA对最终偶联的抗体作1 100稀释，-20°C， 以120 μ L试样储存以供单次使用。TMB EIA底物试剂盒(生物辐射公司(BioRad)编号 172-1067)。 方案将抗-GALNS抗体结合于平板用缓冲液A配制的最终蛋白质浓度 为5 μ g/mL的抗-GALNS包被Nunc MaxiSorp ELISA平板(NN国际公司，费希尔编号 12-565-135)。为制备该溶液，融化1份19 μ L试样，用微型离心机简单离心(10秒)以 收集液体。将所有19μL转移入12mL缓冲液A。通过颠倒剧烈混合，然后倒入储器，再 用多通道移液管进行平板加载(100微升/孔)。覆盖该平板，37°C温育(对流孵育箱)2 小时。不用加热块。除去未结合的抗-GALNS抗体用缓冲液Bw溢流来洗涤该平板， 三次。阻断用缓冲液B (320微升/孔)阻断该平板，然后覆盖该平板，37°C温育1小 时。在阻断步骤期间制备纯化GALNS标准品和测试样品(未知)的稀释系列用缓冲液 B将标准品稀释至该试验线性范围的高端(40ng/mL，A行)，然后在96-孔板的B_G行 中作连续稀释(2-倍)。H行是缓冲液空白(即，无GALNS酶)。首先用缓冲液B制 备500 μ L,浓度为40ng/mL。然后用缓冲液B作2-倍连续稀释(250 μ L加入250 μ L) 直至达到0.625ng/mL。除去阻断缓冲液阻断步骤后，弃去缓冲液B。将GALNS酶 和测试样品结合于抗-GALNS抗体将连续稀释的标准品和测试样品以100微升/孔加 载于平板(一式两份)。覆盖该平板，37°C下温育1小时。洗涤用缓冲液Bw溢流来 洗涤该平板，三次。结合检测抗体偶联物融化1份抗体RIVAH试样(120 μ L)，用微 型离心机简单离心(10秒)以收集液体。将所有120 μ L转移入11.9mL缓冲液B并剧烈 颠倒该试管进行混合。倒入储器，再用多通道移液管加入100微升/孔。覆盖该平板， 37°C温育30分钟。洗涤用缓冲液Bw溢流来洗涤该平板，三次。TMB底物通过混 合1.2mL溶液B与10.8mL溶液A来制备最终底物溶液。倒入储器，再用多通道移液管 加入100微升/孔。覆盖该平板，37°C温育15分钟。终止溶液将12mL 2N H2SO4终 止溶液吸入储器，用多通道移液管加入100微升/孔。轻扣混合。读取A450 用平板 读数计对平板读数。
GALNS比活性试验GALNS比活性试验利用GALNS-特异性底物检测溶液中GALNS的酶活性。缓冲液.MilliQ H2O用于所有缓冲液。稀释缓冲液(DB)对于IL DB，将1.74mL 乙酸，0.75g 乙酸钠，233.6mg NaCl，2mL 50 % 吐温-20 和 IOmLl % 叠氮钠溶解 于MilliQ H2O,如果pH低于3.95，用0.1M NaOH，如果pH高于4.05，用0.IM乙酸将 pH调节至4.0+/-0.5。终浓度是19.5mM乙酸，5.5mM乙酸钠，ImM NaCl，0.1%吐 温-20和0.01 %叠氮钠。磷酸缓冲液(PB)对于IL PB,将13.9g NaH2PO4-H2O和55g NaHP04_7H20溶解于MilliQ H2O,将pH调节至7.2。终浓度是300mM NaPi。终止缓 冲液(SB)对于1LSB，将26.2§甘氨酸和46.6§碳酸钠溶解于施11丨0压0，用NaOH将 pH调节至10.6。试验缓冲液(AB)用DB对4MU_Ga卜6S储备液作1 50稀释(最终 为2mM)。β -半乳糖苷酶缓冲液(β GB) 25 μ g/mL β -半乳糖苷酶，300mM NaPi配 制，pH7.2。试剂.4MU_Ga卜6S IOOmM, H2O配制(多伦多研究化学品公司(Toronto Research Chemicals)目录号 M334480)。 β -半乳糖苷酶SigmaG-4155。4-甲基伞形 酮(4MU 标准品)Sigma M-1381 (IOmM 储备液，DMSO 配制)。方案.连续稀释GALNS酶。对于纯化的和配制的GALNS (约1.5mg/ml)，先 在含有DB的低蛋白粘附微量离心管(美国科学公司(USAScientific)目录号1415-2600) 中1 10,000稀释样品，再作1 1连续稀释。将100 μ L DB置于低蛋白-结合96-空 白中。在第一行中移入IOOyL GALNS样品。现在沿平板(96-孔板上A_G)连续稀释 (1:1)。孔H中不加入样品(空白)。该试验的线性范围是l-75ng/mL。采用相同的 方法制备4MU标准曲线。用DB 1 100稀释DMSO配制的IOmM 4MU储备液。在 第一孔中加入50 μ L 50 μ M 4MU开始4MU标准曲线，然后连续稀释。将AB(DB配制 的2mM 4MU-半乳糖-6S)配制的50 μ L底物加入96-孔荧光板。37°C预温育底物10 分钟。将100 μ L GALNS连续稀释液中的50 μ L和4MU标准品加入AB配制的50 μ L 底物。37°C，温育30分钟(该第一反应除去底物中的硫酸盐)，猝灭该第一反应，通过 力口入50 μ L β -半乳糖苷酶(用β GB将β -半乳糖苷酶储备液稀释至25 μ g/mL)开始 第二反应。磷酸盐抑制GALNS，pH升高也终止GALNS反应。现在，得到的pH处于 β-半乳糖苷酶的最佳pH范围。37°C，温育该第二反应15分钟。加入100 μ L SB电离 释放的4MU。用96-孔荧光平板读数计读取Ex355Em460。酶活性计算(37°C，pH 4.0 缓冲液)1单位=释放的μ mol 4MU/分钟；活性=μ mol 4MU/分钟/毫升；比活性 =μ mol 4MU/分钟/毫克。蛋白质浓度计算利用GALNS的消光系数(lmg/mL = 280nm的1.708吸光度单位)。实施例V纯化人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)目的是获得大量重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在生物反应 器培养条件下培养共同表达人SUMFl和人GALNS的稳定转染G71细胞，从细胞培养基 中纯化活性GALNS酶。液相层析设备.APBA浏览器 900 系统(Amersham Pharmacia BiotechAKTA explorer 900system)，采用 Unicorn 控制软件。
蛋白质分析方法.遵循SDS-PAGE、考马斯蓝染色(B101-02-COOM)、蛋白质印 迹和Bradford蛋白质测定的标准方法。通过活性得率评估纯化操作，通过SDS-PAGE目 测评估GALNS产物的纯度。利用抗-GALNS抗体，通过蛋白质印迹检测是否存在加工 的杂质。采用Bradford蛋白质测定检测蛋白质浓度。采用1.708的消光系数，通过测量 A280来检测最终纯化的GALNS蛋白的浓度。层析树脂.蓝琼脂糖6FF (GE保健品公司(GE Healthcare)，批号306346)和 Fractogel SE Hi-Cap (MK 公司(Merck KgaA)，FC040894449)。GALNS酶活性测定.利用小荧光底物4-甲基伞形酮基(umbelliferyl) -6_S_GAL ( 4-MU-6-S-GAL)测定GALNS比活性。GALNS比活性试验涉及两步反应，其中加入加 入β _半乳糖苷酶是GALNS与底物温育一定时间后释放荧光标签所必需的。利用荧光 平板读数计进行检测。用平衡缓冲液(EQB，50mMNaOAc, IOmM NaCl，pH 5.8)平衡 IODG 脱盐柱
(生物辐射公司)。MilliQ H2O用于所有缓冲液。将3mL纯化的GALNS (0.5_2mg/mL) 加载到脱盐柱上，洗脱，利用EQB将4mL试样收集在不同试管中。利用GALNS的消光 系数计算蛋白质浓度(lmg/mL = 280nm的1.708吸光度单位)。

用稀释缓冲液(DB，50mMNaOAc, ImMNaCl, pH 4.0+0.5mg/mLBSA)连续稀
释(1 1)脱盐的GALNS样品。使用前先将BSA储备液脱盐，再将50mg/mL BSA储备 液(不超过5% CV)加载到已用milliQ H2O平衡的G25柱上。将100 μ L脱盐的GALNS 样品移入低蛋白结合96-孔板的第一行，将连续稀释的GALNS样品沿平板移入(96-孔板 上的A-G行)。将100 μ L DB移入最后孔(H)。该试验的线性范围的顶端是200ng/mL， 线性范围的3-200ng/mL。进行相同的方法以制备4-甲基伞形酮(4MU) (Sigma M-1381, IOmM储备液，DMSO配制)的标准曲线。将100 μ L GALNS连续稀释液中的50 μ L禾口 4MU转移至新的96-孔荧光平板(黑底平板)。将50 μ L 2mM4MU_半乳糖_6S (milliQ H2O配制)加入待测样品，37°C温育30分钟。猝灭该第一反应，加入50 μ L β -半乳糖 苷酶(Sigma G-4155，用300mM NaPi, pH7.2稀释至12 μ g/mL的储备液)开始第二反 应，37°C温育15分钟。加入100 μ L终止缓冲液(甘氨酸/碳酸盐，pH 10.6)电离释放 的4MU。用96-孔荧光平板读数计对平板读数(激发355nm，发射460nm)。1单位定 义为释放1 μ mol 4MU/分钟，酶活性以μ mol 4MU/分钟/毫升给出，比活性以μ mol 4MU/分钟/毫克给出，所有操作均在37°C，pH 4.0缓冲液中。第一纯化方法.第一种纯化方法包括超滤(UF)步骤，然后进行2-柱纯化方法。1.收集过滤(HF)生物反应器材料经0.2 μ m无菌过滤。2.超滤(UF)生物反应器材料通过30kD Sartocon膜超滤浓缩10-20倍。3.pH4.5调节室温下，用pH调节缓冲液(1.75M NaOAc，pH 4.0)将浓缩的生 物反应器材料(UF(20X))调节至pH 4.5，先无菌过滤再加载到蓝琼脂糖柱上。4.蓝琼脂糖6速流(FF)将pH 4.5调节的UF (20X)加载到蓝琼脂糖柱上，如表 1和图9A所示洗脱GALNS蛋白。表1 蓝琼脂糖6速流层析
权利要求
1.一种在END3互补组CHO细胞或其衍生物中产生的重组人溶酶体硫酸酯酶或其生 物学活性片段、突变体、变体或衍生物，其中所述END3互补组CHO细胞或其衍生物表 达重组人硫酸酯酶修饰因子I(SUMFl)，其中所述重组溶酶体硫酸酯酶或其生物学活性 片段、突变体、变体或衍生物具有高水平的活化、和高水平的磷酸化。
2.如权利要求1所述的重组人溶酶体硫酸酯酶或其生物学活性片段、突变体、变 体或衍生物，其特征在于，所述重组溶酶体硫酸酯酶选自芳基硫酸酯酶A(ARSA)、 芳基硫酸酯酶B (ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素_N_硫酸 酯酶(SGSH)、N-乙酰葡萄糖胺-硫酸酯酶(G6S)和N-乙酰半乳糖胺_6_硫酸酯酶 (GALNS)。
3.一种由END3互补组CHO细胞或其衍生物产生的重组人N_乙酰半乳糖胺_6_硫 酸酯酶(GALNS)或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物，其中所述END3互补组 CHO细胞或其衍生物表达重组人硫酸酯酶修饰因子1 (SUMFl)，其中所述重组人GALNS 具有高水平的活化、和高水平的磷酸化。
4.如权利要求1-3中任一项所述的酶，其特征在于，所述END3互补组CHO细胞或 其衍生物是G71细胞系或G71衍生物。
5.一种产生活性高度磷酸化重组人溶酶体硫酸酯酶或其生物学活性片段、突变体、 变体或衍生物的方法，包括以下步骤(a)培养中国仓鼠卵巢(CHO)-衍生的END3互补组细胞或其衍生物；(b)制备能在所述END3互补组细胞或其衍生物中表达所述活性高度磷酸化重组人 溶酶体硫酸酯酶或其生物学活性片段、突变体、变体或其衍生物的第一哺乳动物表达载 体；(C)制备能在所述END3互补组细胞或其衍生物中表达重组人硫酸酯酶修饰因子 1 (SUMFl)或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物的第二哺乳动物表达载体；(d)用所述第一和第二表达载体转染所述END3互补组细胞或其衍生物；(e)选择和克隆表达所述活性高度磷酸化重组人溶酶体硫酸酯酶或其生物学活性片 段、突变体、变体或衍生物的所述END3互补组细胞或其衍生物的转染子；和(f)优化细胞培养方法以便产生所述高度磷酸化的重组人溶酶体硫酸酯酶或其生物学 活性片段、突变体、变体或衍生物，其中所述重组人溶酶体硫酸酯酶选自芳基硫酸酯酶A(ARSA)、芳基硫酸酯酶 B (ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素_N_硫酸酯酶(SGSH)、 N-乙酰葡萄糖胺_硫酸酯酶(G6S)和N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中将所述第一和第二表达载体 同时转染入所述END3互补组细胞或其衍生物。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中所述第一和第二表达载体顺 序转染入所述END3互补组细胞或其衍生物。
8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述END3互补组CHO细胞 或其衍生物是G71细胞系或G71衍生物。
9.一种通过权利要求5-8中任一项所述的方法产生的活性高度磷酸化重组人溶酶体硫 酸酯酶或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物。
10.一种药物组合物，其包含权利要求9所述的溶酶体硫酸酯酶或其生物学活性片 段、突变体、变体或衍生物和一种或多种药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。
11.一种产生活性高度磷酸化重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生 物学活性片段、突变体、变体或衍生物的方法，包括以下步骤(a)培养中国仓鼠卵巢(CHO)-衍生的END3互补组细胞或其衍生物；(b)制备能适合在所述END3互补组细胞或其衍生物中表达所述活性高度磷酸化重组 人GALNS或其生物学活性片段、突变体、变体或其衍生物的第一哺乳动物表达载体；(C)制备能适合在所述END3互补组细胞或其衍生物中表达重组人硫酸酯酶修饰因子 KSUMF1)或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物的第二哺乳动物表达载体；(d)用所述第一和第二表达载体转染所述END3互补组细胞或其衍生物；(e)选择和克隆表达所述活性高度磷酸化重组人GALNS或其生物学活性片段、突变 体、变体或衍生物的所述END3互补组细胞或其衍生物的转染子；和(f)优化细胞培养方法以便产生所述活性高度磷酸化重组人GALNA或其生物学活性 片段、突变体、变体或衍生物。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中将所述第一和第二表达载 体同时转染入所述END3互补组细胞或其衍生物。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中所述第一和第二表达载体 顺序转染入所述END3互补组细胞或其衍生物。
14.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述END3互补组CHO细 胞或其衍生物是G71细胞系或G71衍生物。
15.一种通过权利要求11-14中任一项所述的方法产生的高活性高度磷酸化重组人 N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物。
16.一种药物组合物，其包含权利要求15所述重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶 (GALNS)或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生物和一种或多种药学上可接受的运 载体、稀释剂或赋形剂。
17.—种可用于治疗患有N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)缺乏所致或与之 相关的溶酶体贮积症的对象的重组人GALNS或其生物学活性片段、突变体、变体或衍生 物，其中所述GALNS酶或其生物学活性突变体、变体或衍生物(a)非还原性条件下进行SDS-PAGE时，考马斯蓝染色测定到的纯度至少约为 90% ；(b)53位的半胱氨酸残基至少约有90%转变成Ca-甲酰甘氨酸(FGly)；和(C)在178和397位天冬酰胺残基处是N-连接糖基化的，其中连接于178位天冬酰 胺残基的至少约50%的寡聚甘露糖链是双-磷酸化的。
18.如权利要求17所述的GALNS酶，其特征在于，所述溶酶体贮积症是粘多糖贮积 病IVa型(MPS IVa)或莫尔基奥A综合征。
19.如权利要求17所述的GALNS酶，其特征在于，所述溶酶体贮积症是多发性硫酸 酯酶缺乏症。
20.如权利要求17所述的GALNS酶，其特征在于，在还原性条件下进行SDS-PAGE 时，通过考马斯蓝染色测得，所述GALNS酶由约55-60kDa的主要条带构成，该条带是可见蛋白质的至少约75%。
21.如权利要求17所述的GALNS酶，其特征在于，在还原性条件下进行SDS-PAGE 时，考马斯蓝染色测定到所述GALNS酶基本上由约55-60kDa的单一条带构成。
22.一种治疗患有溶酶体硫酸酯酶缺乏症的对象的方法，包括给予需要所述溶酶体硫 酸酯酶的对象治疗有效量的所述溶酶体硫酸酯酶，其中所述溶酶体硫酸酯酶是CHO-衍 生的END3互补组细胞或其衍生物产生的重组人溶酶体硫酸酯酶或其生物学活性片段、 突变体、变体或衍生物。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述溶酶体硫酸酯酶缺乏症选自下组 异染性脑白质营养不良(MLD)、粘多糖贮积病VI型(MPSVI)或马-兰二氏综合征、粘 多糖贮积病II型(MPSII)或亨特综合征、粘多糖贮积病IIIa型(MPS IIIa)或桑菲列普A 综合征、粘多糖贮积病IIId型(MPSIIId)或桑菲列普D综合征、和粘多糖贮积病IVa型 (MPSIVa)或莫尔基奥A综合征。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述溶酶体硫酸酯酶缺乏症是MPSIVa 或莫尔基奥A综合征。
25.—种治疗患有与一种或多种溶酶体硫酸酯酶缺乏有关的溶酶体贮积症的对象的方 法，包括给予缺乏所述一种或多种溶酶体硫酸酯酶的对象治疗有效量的CHO-衍生END3 互补组细胞或其衍生物产生的重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物 学活性片段、突变体、变体或衍生物。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述溶酶体贮积症是多发性硫酸酯酶缺 乏症(MSD)。
27.如权利要求22-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述END3互补组CHO细 胞或其衍生物是G71细胞系或其G71衍生物。
28.一种治疗患有粘多糖贮积病VIa型(MPS IVa)或莫尔基奥A综合征或多发性硫 酸酯酶缺乏症(MSD)的对象的方法，包括给予该对象治疗有效量的纯化的重组人N-乙 酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物学活性突变体、变体或衍生物，其中所述 GALNS或其生物学活性突变体、变体或衍生物(a)在非还原性条件下进行SDS-PAGE时，考马斯蓝染色测定到纯度至少约为 90% ；(b)53位的半胱氨酸残基至少约有90%转变成Ca-甲酰甘氨酸(FGly)；和(C)在178和397位天冬酰胺残基处是N-连接糖基化的，其中连接于178位天冬酰 胺残基的至少约50%的寡聚甘露糖链是双-磷酸化的。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述对象患有MPSIVa或莫尔基奥A综 合征。
30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述对象患有MSD。
31.如权利要求28所述的方法，其特征在于，在还原性条件下进行SDS-PAGE时， 通过考马斯蓝染色测得，所述GALNS酶由约55-60kDa的主要条带构成，该条带是可见 蛋白质的至少约75%。
32.如权利要求28所述的方法，其特征在于，在还原性条件下进行SDS-PAGE时， 考马斯蓝染色测定到所述GALNS酶基本上由约55-60kDa的单一条带构成。
33.一种衍生自G71或其衍生物的END3互补组CHO细胞系，其中所述END3互补 组CHO细胞系包含(a)重组人硫酸酯酶修饰因子I(SUMFl)的表达载体；和(b)重组人溶酶体硫酸酯酶的表达载体，其中所述重组人溶酶体硫酸酯酶选自芳 基硫酸酯酶A (ARSA)、芳基硫酸酯酶B (ARSB)、艾杜糖醛酸_2_硫酸酯酶(IDS)、磺酰 胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)、N-乙酰葡萄糖胺_硫酸酯酶(G6S)和N-乙酰半乳 糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。
34.如权利要求33所述的END3互补组CHO细胞系，其特征在于，所述END3互补 组CHO细胞系包含重组人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的表达载体。
35.如权利要求34所述的END3互补组CHO细胞系，其特征在于，所述END3互补 组CHO细胞系表达并分泌重组人GALNS。
36.如权利要求34所述的END3互补组CHO细胞系，其特征在于，所述END3互补组 CHO细胞系选自克隆4、克隆5、克隆C6、克隆C2、克隆C5、克隆C7、克隆C10、 克隆Cll和克隆C30。
37.如权利要求34所述的END3互补组CHO细胞系，其特征在于，所述END3互补 组CHO细胞系是克隆C2。
38.如权利要求34所述的END3互补组CHO细胞系，其特征在于，END3互补组CHO 细胞系适合于悬浮生长。
39.一种检测重组人溶酶体酶降解天然底物的活性的方法，包括(a)在溶酶体酶的天然底物累积的条件下培养缺乏溶酶体酶的分离人细胞；(b)使该细胞与溶酶体酶接触；(c)裂解该细胞；(d)向细胞裂解液中加入酶，所述酶是ω天然底物特异性的，和Gi)切割天然底 物上的小寡糖；(e)用可检测部分标记该小寡糖；(f)任选分离标记的小寡糖；(g)检测标记的小寡糖；和(h)通过比较⑴和Gi)来测定溶酶体酶降解天然底物的活性ω接触溶酶体酶的细 胞的标记小寡糖量；(ii)未接触溶酶体酶的标记小寡糖量，其中与(h) (ii)相比，(h)⑴中标记小寡糖量的减少表明了溶酶体酶降解天然底物的 活性。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述溶酶体酶是选自下组的溶酶体硫酸 酯酶芳基硫酸酯酶B (ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶/肝素_N_硫 酸酯酶(SGSH)、N-乙酰葡萄糖胺_硫酸酯酶(G6S)和N-乙酰半乳糖胺_6_硫酸酯酶 (GALNS)。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述溶酶体酶是GALNS。
42.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述溶酶体酶是α-L-艾杜糖苷酸酶 (IDU)。
全文摘要
本发明提供活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶的组合物、它们的药物组合物、产生和纯化此类溶酶体硫酸酯酶的方法以及它们在诊断、预防或治疗疾病和病症中的应用，尤其包括溶酶体硫酸酯酶缺乏所致或与之相关的溶酶体贮积症。
文档编号C12N9/16GK102027110SQ200980108887
公开日2011年4月20日 申请日期2009年1月16日 优先权日2008年1月18日
发明者C·豪格, E·普格, M·C·维拉德, M·德沃莱克-艾维尔, V·科帕卡 申请人:生物马林药物股份有限公司