专利名称：多瘤病毒的检测的制作方法
多瘤病毒的检测相关专利申请的交叉引用本申请要求2008年2月20日提交的美国临时专利申请第61/064，166号的优先 权日期的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
人多瘤病毒JC和BK广泛存在于人群中。这些病毒导致的原发感染通常是无症 状的，且可导致一过性病毒尿症。在原发感染之后，JC病毒(JCV)和BK病毒(BKV)均在 肾脏组织和B淋巴细胞中建立潜伏期(G. Lecatsas, B. D. Schoub, A. R. Rabson,以及M. Jfe, Letter, Lancet 2 :907-908,1 976)。多瘤病毒相关性疾病主要与免疫损伤有关，免疫妥协 患者中病原的快速检测和区分对于帮助临床处理来说是重要的。JCV是神经疾病进行性多 灶性白质脑病的致病因子，该疾病主要在AIDS (获得性免疫缺陷综合征)患者中发生，而 BKV相关性疾病包括出血性膀胱炎、输尿管狭窄以及其他泌尿道疾病，这些疾病最常见于进 行免疫抑制治疗的移植患者。用于检测和鉴定多瘤病毒的传统方法包括血清学方法、通过细胞培养的病毒分离 以及电子显微镜技术。最近，研究显示PCR是用于检测各种临床样品中多瘤病毒的有效工 具。然而，在开发多瘤病毒的有效检测方法中，主要障碍是BKV和JCV核苷酸序列中的 大量种内多态性。迄今，核苷酸多态性(例如SNP)插入以及缺失已经妨碍了检测感染的可 靠方法的开发。因此，需要更牢靠的测定方法。
发明内容
根据本发明的一方面，提供了用于检测样品中是否存在多瘤病毒的方法，所述方 法包括检测所述样品是否存在具有SEQ ID NO 1的序列的核酸、SEQ ID NO=I的序列的反 向互补序列的核酸或与SEQ ID NO :1具有90%或更多序列同源性的序列的核酸。在一些实施方式中，所述方法还包括扩增SEQ ID NO :1的核酸、或SEQ ID N0:1的 反向互补序列的核酸、或SEQ ID NO :1及其反向互补序列中任一者的一部分的核酸，然后检 测是否存在所产生的扩增子。在一些方面，所述检测步骤包括使所述样品与在严谨条件下 能够与SEQ ID NO :1或其反向互补序列的核酸杂交的至少一种寡核苷酸探针接触，或进行 解链曲线分析。在一种实施方式中，所述方法包括使用至少扩增引物SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3，所述检测步骤包括使用至少寡核苷酸探针SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5。在另一实施方式中，所述方法包括使用至少扩增引物SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 6，所述检测步骤包括使用至少寡核苷酸探针SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5。在另一实施方式中，所述方法包括使用至少扩增引物SEQ ID NO :2和SEQ ID NO: 3，所述检测步骤包括使用至少寡核苷酸探针SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :23。在又一实施方式中，所述方法包括使用至少扩增引物SEQ ID NO :2和SEQ ID NO:
56，所述检测步骤包括使用至少寡核苷酸探针SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :23。在再一实施方式中，所述方法包括使用至少扩增引物SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9。一方面，所述检测步骤包括使用与双链DNA结合的花青染料。在另一实施方式中，所述方法包括使用至少扩增引物SEQ ID NO :4和SEQ ID NO: 6，所述检测步骤包括使用至少寡核苷酸探针SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:13。在所述检测 步骤中可单独或同时使用探针SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:13。在另一实施方式中，所述方法包括使用至少扩增引物SEQ ID NO :4和SEQ ID NO: 6，所述检测步骤包括使用至少寡核苷酸探针SEQ ID N0:14和SEQ ID N0:15。在另一实施方式中，所述方法包括使用至少扩增引物BKV_5. 2和BKV_5. 1。这些引 物位于靠近VP2/3基因的尾端的位置。尽管VP2/3和VPl具有分开的开放阅读框(0RF)，但 是BKV_5. 2和BKV_5. 1引物扩增与VPl基因的起始端重叠的VP2/3基因的区域。另一方面，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包含在严谨条件下能够与SEQ ID NO 1 的核酸杂交的至少一种寡核苷酸探针。一方面，所述试剂盒还包含用于扩增SEQ ID NO 1 及其互补序列或转录子的核酸的扩增引物或用于扩增SEQ ID NO :1及其互补序列或转录子 的一部分的核酸的扩增引物。在一种实施方式中，所述试剂盒包含扩增引物SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3以及 寡核苷酸探针SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5。在另一实施方式中，所述试剂盒包含扩增引物SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 6以及 寡核苷酸探针SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5。在另一实施方式中，所述试剂盒包含扩增引物SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3以及 寡核苷酸探针SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :23。在又一实施方式中，所述试剂盒包含扩增引物SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 6以及 寡核苷酸探针SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :23。在另一实施方式中，所述试剂盒包含扩增引物SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 6以及 寡核苷酸探针SEQ ID NO :9和SEQ ID NO 13。可单独或同时使用探针SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :13。在一种实施方式中，所述试剂盒包含扩增引物SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 6以及 寡核苷酸探针SEQ ID NO 14和SEQ ID NO :15。在一种实施方式中，所述试剂盒包含扩增引物SEQ ID NO 8和SEQ ID NO :9。在另一实施方式中，所述试剂盒包含扩增引物BKV_5. 2和BKV_5. 1。这些引物位 于靠近VP2/3基因的尾端的位置。尽管VP2/3和VPl具有分开的开放阅读框(ORF)，但是 BKV_5. 2和BKV_5. 1引物扩增与VPl基因的起始端重叠的VP2/3基因的区域。在一些实施方式中，在严谨条件下所述扩增引物中的至少一种与BKV基因组DNA 特异性结合。在一种实施方式中，所述寡核苷酸探针中的至少一种与BKV基因组DNA特异 性结合。在另一个实施方式中，所述寡核苷酸探针中的至少一种与JCV基因组DNA特异性
纟口口。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含有利于检测扩增子或结合的探针的试剂。另一方面，提供了使用上述方法检测来自器官供体的血液样品是否存在多瘤病毒 的方法。另一方面，提供了用于监测具有多瘤病毒的患者的治疗的方法，所述方法包括使用
6上述方法检测所述患者的多瘤病毒的病毒载量。在一个实施例中，在所述治疗之前和过程 中检测所述病毒载量。这样的治疗可包括进行抗病毒剂给药，所述抗病毒剂诸如西多福韦、 来氟米特、喹诺酮抗生素和/或静脉注射免疫球蛋白。根据下列详细说明其他目的、特征以及优点将变得显而易见。由于对本领域技术 人员来说根据所述详细说明在本发明的实质和范围内的各种改变和修改将变得显而易见， 所述详细说明和特定实施例仅出于举例说明给出。另外，实施例说明了本发明的原理，并非 能预期所述实施例特别例证本发明应用至其对于本领域技术人员来说明显有用的所有实 施例。
图1显示了 BKV和JCV DNA的PCR扩增。样品Al和A7是不含有病毒DNA的对照。 A2含有具有终浓度为8 X IO5拷贝的BKV DNA。A3至A6分别含有浓度为8 X IO4拷贝、8 X IO3 拷贝、8X IO2拷贝、8X IO1拷贝的系列稀释度的BKV DNA。A8含有具有终浓度为8X IO5拷 贝的JCV DNA。A9至A12分别含有浓度为8 X IO4拷贝、8 X IO3拷贝、8 X IO2拷贝、8 X IO1拷 贝的系列稀释度的JCV DNA。图2显示了基于图1的扩增曲线的标准回归曲线。该标准曲线的误差率(P值) 为0. 0949，有效性为1. 935。图3提供了解链曲线分析。该图分别显示了不含有病毒DNA的样品、仅含有JCV DNA的样品和仅含有BKV DNA的解链峰值。图4显示了 BKV和JCV DNA的PCR扩增。样品D1是不含有病毒DNA的阴性对照。 D2含有具有终浓度为8 X IO5拷贝的BKV DNA。D3至D6分别含有浓度为8 X IO4拷贝、8 X IO3 拷贝、8 X IO2拷贝、8 X IO1拷贝的系列稀释度的BKV DNA。微孔D7至D12分别为微孔Dl至 D6的复孔。样品El为空白对照。样品E2含有1 1比例的BKV DNA和JCV DNA，具有浓 度为8 X IO5的BKV DNA拷贝和浓度为8 X IO5的JCV DNA拷贝。样品E3至E6含有微孔E2 的样品的10倍系列稀释度，E3的浓度8X IO4的BKV DNA拷贝和8 X IO4的JCV DNA拷贝； E4的浓度8 X IO3的BKV DNA拷贝和8 X IO3的JCV DNA拷贝；E5的浓度8 X IO2的BKV DNA 拷贝和8 X IO2的JCV DNA拷贝；E6的浓度8 X IO1的BKV DNA拷贝和8 X IO1的JCV DNA拷 贝。微孔E7至E12分别为微孔El至E6的复孔。图5显示了基于图4的扩增曲线的标准回归曲线。该标准曲线的误差率(P值) 为0. 0391，有效性为1.934。图6提供了解链曲线分析。该图显示了含有不同浓度的1 1比例的BKVDNA和 JCV DNA的样品的解链峰值。El 不含有病毒DNA的阴性对照样品；E2 :8X IO5的BKV DNA 拷贝和 8 X IO5 的 JCV DNA 拷贝；E3 :8X IO4 的 BKV DNA 拷贝和 8 X IO4 的 JCV DNA 拷贝；E4 8 X IO3 的 BKV DNA 拷贝和 8 X IO3 的 JCV DNA 拷贝；E5 :8 X IO2 的 BKV DNA 拷贝和 8 X IO2 的 JCV DNA拷贝；E6 :8X IO1的BKV DNA拷贝和8 X IO1的JCV DNA拷贝。微孔E7至E12分别 为微孔El至E6的复孔。图7显示了测定能力。在美国病理学家学会(CAP)进行的对比性测定中，对各种 测定进行了比较。使用本申请的方法的定量结果处于或接近各阳性CAP样品的中值，而由 其他实验室使用其他技术获得的定量值具有高度的可变性。
图8显示了测定精确度。扩增曲线显示了本申请的方法在宽泛的动态范围的精确 度和再现性。
具体实施例方式阐述并确定BKV基因组的稳定保守区为用于评价样品是否含有多瘤病毒、特别是 BKV的有效靶。对来自超过10种多瘤病毒的氨基酸和核苷酸序列的处于如下条件下的区域 进行了对比和评价即，所述核苷酸序列在形式和功能方面处于严格生物学限制下，所述序 列的产物经历来自宿主免疫系统的有限选择压力，以及所述核苷酸序列或所述序列的产物 对于高效病毒复制和感染是必要的。VP2基因(NCBI登录号YP_717937)的C末端、特别是 包含氨基酸272至323的区域被鉴定为理想的靶。因此，提供了检测和定量BKV和JCV的 方法，以及用于这样的方法的引物、探针以及试剂盒。生物序列下文提供了本文所使用的生物序列的说明。NCBI登录号NC_001538的序列的一部分1437位至1592位可用作靶BKV序列(SEQ ID NO 1) TCAGGAGAGTTTATAGAAAAAACTATTGCCCCAGGAGGTGCTAATCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCATATGAAGATGGCCCCAACCAAAAGAAAAGGAGAGTG。另夕卜，NCBI登录号NC_001538的另一部分1437位至1605位可用作靶序列。另外，NCBI登录号NC_001538的另一部分1437位至1679位可用作靶序列。另外，NCBI登录号NC_001538的另一部分1位至5153位可用作靶序列。另外，NCBI登录号NC_001699的另一部分1位至5130位可用作靶序列。表1鉴定了示例的引物和探针，并提供了它们相对于NCBI登录号NC_001538或 NC_001699 的位置。.
权利要求
1.一种检测样品中是否存在多瘤病毒的方法，所述方法包括检测所述样品是否存在具 有SEQ ID NO 1的序列的核酸、SEQ ID NO 1的序列的反向互补序列的核酸或与SEQ ID NO :1具有90%或更多序列同源性的序列的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括扩增SEQID NO :1的核酸、或SEQ ID NO :1的反向互补序列的核酸、或SEQ ID NO :1及其反向互补序列中任一者的一部分的核 酸，然后检测是否存在所产生的扩增子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述检测步骤包括使所述样品与能够在严谨条 件下与SEQ ID NO :1或其反向互补序列的核酸杂交的至少一种寡核苷酸探针接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述检测步骤还包括进行解链曲线分析。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述扩增步骤包括使用至少扩增引物SEQID NO 2 (BK_F_1. 1)和SEQ ID NO 3 (BK_R_1. 2)，所述检测步骤包括使用至少寡核苷酸探针 SEQ ID NO :4(BK_P_1. 3)和 SEQ ID NO :5(ΒΚ_Ρ_1· 4)。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述扩增步骤包括使用至少扩增引物SEQID NO 2 (BK_F_1. 1)和SEQ ID NO 6 (BK_R_1. 5)，所述检测步骤包括使用至少寡核苷酸探针 SEQ ID NO :4(BK_P_1. 3)和 SEQ ID NO :5(ΒΚ_Ρ_1· 4)。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述扩增步骤包括使用至少扩增引物SEQID NO 2 (BK_F_1. 1)和SEQ ID NO 3 (BK_R_1. 2)，所述检测步骤包括使用至少寡核苷酸探针 SEQ ID NO :4(BK_P_1. 3)和 SEQ ID NO :23(JC_P_1. 5)。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述扩增步骤包括使用至少扩增引物SEQID NO 2 (BK_F_1. 1)和SEQ ID NO 3 (BK_R_1. 2)，所述检测步骤包括使用至少寡核苷酸探针 SEQ ID NO :5(BK_P_1. 4)和 SEQ ID NO :23(JC_P_1. 5)。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增步骤包括使用至少扩增引物SEQID NO 8 (BK_F_2. 1)和 SEQ ID NO 9 (BK_R_2. 2)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述检测步骤包括使用与双链DNA结合的花青 染料。
11.根据权利要求3所述的方法，其中，所述扩增步骤包括使用至少扩增引物SEQID NO 4 (多瘤病毒_F_3. 1)和SEQ ID NO 6 (多瘤病毒_R_3. 2)，所述检测步骤包括使用至少 寡核苷酸探针 SEQ ID NO 9 (BK_P_3. 3)和 SEQ ID NO :13(JCV_P_3. 4)。
12.根据权利要求3所述的方法，其中，所述扩增步骤包括使用至少扩增引物SEQID NO 4 (多瘤病毒_F_3. 1)和SEQ ID NO 6 (多瘤病毒_R_3. 2)，所述检测步骤包括使用至少 寡核苷酸探针 SEQ ID NO 9 (ΒΚ_Ρ_3· 3)。
13.根据权利要求3所述的方法，其中，所述扩增步骤包括使用至少扩增引物SEQID NO 4 (多瘤病毒_F_4. 1)和SEQ ID NO 6 (多瘤病毒_R_4. 2)，所述检测步骤包括使用至少 寡核苷酸探针 SEQ ID NO :14(BK_P_4. 3)和 SEQ ID NO :15(JCV_P_4. 4)。
14.一种试剂盒，所述试剂盒包含能够在严谨条件下与SEQ ID NO :1的核酸杂交的至 少一种寡核苷酸探针。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，所述试剂盒还包含用于扩增SEQID N0:1及其互 补序列或转录子的核酸的扩增引物或用于扩增SEQ ID NO :1及其互补序列或转录子的一部 分的核酸的扩增引物。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒包含扩增引物SEQID N0:2(BK_ F_l. 1)和 SEQ ID NO :3(BK_R_1. 2)以及寡核苷酸探针 SEQ ID NO :4(ΒΚ_Ρ_1· 3)和 SEQ ID NO :5(ΒΚ_Ρ_1. 4)。
17.根据权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒包含扩增引物SEQID Ν0:2(ΒΚ_ F_l. 1)和 SEQ ID NO :6(BK_R_1. 5)以及寡核苷酸探针 SEQ ID NO :4(ΒΚ_Ρ_1· 3)和 SEQ ID NO :5(ΒΚ_Ρ_1. 4)。
18.根据权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒包含扩增引物SEQID Ν0:2(ΒΚ_ F_l. 1)和 SEQ ID NO :3(BK_R_1. 2)以及寡核苷酸探针 SEQ ID NO :4(ΒΚ_Ρ_1· 3)和 SEQ ID NO :23(JC_P_1. 5)。
19.根据权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒包含扩增引物SEQID N0:2(BK_ F_l. 1)和 SEQ ID NO :3(BK_R_1. 2)以及寡核苷酸探针 SEQ ID NO :5(ΒΚ_Ρ_1· 4)和 SEQ ID NO :23(JC_P_1. 5)。
20.根据权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒包含扩增引物SEQID N0:4(多瘤病毒 _F_3. 1)和 SEQ ID NO :6(多瘤病毒 _R_3. 2)以及寡核苷酸探针 SEQ ID NO 9 (BK_P_3. 3) 和 SEQ ID NO 13 (JCV_P_3. 4)。
21.根据权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒包含扩增引物SEQID N0:4(多瘤病毒 _F_3. 1)和 SEQ ID NO :6(多瘤病毒 _R_3. 2)以及寡核苷酸探针 SEQ ID NO 9 (BK_P_3. 3)。
22.根据权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒包含扩增引物SEQID N0:4(多瘤病毒 _F_4. 1)和 SEQ ID NO :6(多瘤病毒 _R_4. 2)以及寡核苷酸探针 SEQ ID NO :14(ΒΚ_Ρ_4· 3) 和 SEQ ID NO 15 (JCV_P_4. 4)。
23.—种试剂盒，所述试剂盒包含扩增引物SEQ ID NO :8(BK_F_2. 1)和SEQ ID NO: 9 (BK_R_2. 2)。
24.一种检测来自器官供体的血液样品是否存在多瘤病毒的方法，所述方法包括权利 要求1至13任一项所述的方法。
25.根据权利要求M所述的方法，其中，被考虑用于供出的器官选自肾脏、肝脏以及 心脏。
26.根据权利要求M所述的方法，所述方法还包括排除来自被发现为多瘤病毒阳性的 器官供体的器官。
27.—种监测具有多瘤病毒的患者的治疗的方法，所述方法包括使用权利要求1至13 任一项所述的方法检测所述患者的多瘤病毒载量。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，在所述治疗之前和过程中检测所述病毒载量。
29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述治疗包括进行抗病毒剂的给药。
30.根据权利要求四所述的方法，其中，所述抗病毒剂选自西多福韦、来氟米特、喹诺 酮抗生素以及静脉注射免疫球蛋白。
31.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增步骤包括使用至少扩增引物SEQID NO 2 和 SEQ ID NO 6 以及探针 SEQ ID NO :14。
32.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增步骤包括使用至少扩增引物SEQID NO 4 和 SEQ ID NO 6 以及探针 SEQ ID NO :14。
33.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增步骤包括使用至少扩增引物SEQIDNO :2 和引物 BKV_5. 2 以及探针 SEQ ID NO :14。
34.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩增步骤包括使用至少扩增引物SEQ ID NO 4 和引物 BKV_5. 2 以及探针 SEQ ID NO :14。
全文摘要
本发明提供了用于检测样品中是否存在诸如BKV(BK病毒)的多瘤病毒的方法和试剂盒。所述方法和试剂盒可用于对BKV进行定量并区分BKV与JCV。
文档编号C12Q1/70GK102066580SQ200980112961
公开日2011年5月18日 申请日期2009年2月19日 优先权日2008年2月20日
发明者岩城公輔 申请人:岩城公輔