膨胀素组合物以及增加纤维素酶效率的方法

专利名称：膨胀素组合物以及增加纤维素酶效率的方法
技术领域：
本组合物和方法涉及使用多肽膨胀素(swollenin)增加从纤维素生物质中产生糖 的纤维素酶的效率。背景对乙醇作为再生燃料的兴趣比以前任何时候更为强烈。使用乙醇作为燃料添加 剂在过去几年中已有增长，并且预期在可见的将来继续增长。使用乙醇降低了对国外石 油的依赖，减少了温室气体的排放，对乡村社区提供了经济利益，并且确立了生物经济 的基础。可能的纤维素乙醇原料包括玉米稿秆、小麦秸秆、甘蔗渣、稻草、纸浆、木 片，和来自于“能源作物”如快速生长树木和草(柳枝稷(SWitchgrass)、草原草、芒属 (miscanthus))的生物质，显著扩展了可用于产生乙醇的材料。尽管纤维素生物质可大量 获得，商业化主要挑战在于降低最终产生乙醇的整体生物精炼工艺的成本。不像淀粉那 样含有同质并且易水解的聚合物，典型用于产生乙醇的纤维素底物/原料本质上并不是 同质的。除了含有可转化纤维素和半纤维素以外，它们也含有木质素和其它成分，这些 不容易转化为可发酵糖。一般而言，未加工生物质必须进行广泛的化学、物理或生物预处理以产生用于 产生乙醇的适当底物/原料。物理预处理技术包括一种或更多种类型的碾磨、破碎、 照射、蒸煮/蒸气爆破和水热解。化学预处理技术包括酸、碱、有机溶剂、氨、二氧化 硫、二氧化碳和控制pH水热解。存在降低将生物质转化为可发酵糖所需水解酶的量和/或降低使生物质能被水 解酶处理所需预处理量的迫切需要。概述一方面，提供增加纤维素酶效率的方法，该方法包括(a)组合纤维素底物 、一定 量的全纤维素酶和一定量的膨胀素以及(b)在有助于水解纤维素的条件下孵育纤维素底 物、混合纤维素酶组合物和膨胀素。在优选的实施方案中，纤维素底物包括氢键键合的 分子。纤维素底物可选自木材、木浆、造纸淤泥、纸浆废液、颗粒板、玉米稿秆、玉米 纤维、稻、纸张和纸浆加工废弃物、木本或草本植物、草、稻壳、棉花秸秆、玉米芯、 酒糟、叶、小麦秸秆、椰子毛、柳枝稷、及其混合物。在相关方面，提供使用纤维素酶增加纤维素水解效率的方法，该方法包括(a) 组合纤维素底物、纤维素酶组合物和重组膨胀素，以及(b)在有助于水解纤维素的条件 下孵育纤维素底物、纤维素酶组合物和膨胀素，其中与不存在膨胀素时使用纤维素酶组 合物获得的效率相比，重组膨胀素的存在增加了纤维素酶组合物的纤维素酶水解效率。
在一些实施方案中，纤维素酶组合物是全纤维素酶组合物。在一些实施方案 中，纤维素酶组合物是混合纤维素酶组合物。在一些实施方案中，纤维素酶组合物包含 内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在一些实施方案中，纤维素酶组合物包含一种或更多种主要纤维素酶。在一些 实施方案中，纤维素酶组合物基本由一种或更多种主要纤维素酶组成。在特定实施方案 中，主要纤维素酶选自CBH1、CBH2、EGU EG2和β-葡糖苷酶。在一些实施方案中，该方法实施时除了膨胀素之外不存在其它辅助酶。在一些实施方案中，该方法实施时不存在EG4和CIPl。在一些实施方案中，该 方法实施时不存在重组EG4或重组CIPl。在一些实施方案中，该方法实施时不存在重组 EG4和重组CIPl。在一些实施方案中，纤维素酶组合物中纤维素酶与膨胀素的比例(重量重量) 在大约20 1和大约1 5之间。在一些实施方案中，纤维素酶组合物中纤维素酶与膨 胀素的比例(重量重量)在大约10 1和大约1 2之间。在一些实施方案中，纤 维素酶组合物中纤维素酶与膨胀素的比例(重量重量)在大约5 1和大约1 1.5之 间。在一些实施方案中，膨胀素和纤维素酶以大约相等的量(重量重量)存在。膨 胀素示例性的量为该方法中使用酶的大约30%至大约70%，大约40%至大约60%，和大 约 50% (wt/wt)。在一些实施方案中，纤维素底物选自木材、木浆、造纸淤泥、纸浆废液、颗粒 板、玉米稿秆、玉米纤维、稻、纸张和纸浆加工废弃物、木本或草本植物、草、稻壳、 棉花秸秆、玉米芯、酒糟、叶、小麦秸秆、椰子毛、柳枝稷、及其混合物。在一些实施 方案中，纤维素底物为软木。在一些实施方案中，纤维素底物为高木质素底物。在一些 实施方案中，纤维素底物具有80或更高的κ值。在一些实施方案中，纤维素酶效率的增加百分数为至少大约10%，至少大约 15%,或甚至至少大约20%。在另一方面，提供酶组合物，其包含混合或全纤维素酶组合物和膨胀素。混合/ 全纤维素酶与膨胀素的比例(重量重量)可以在大约20 1和大约1 5之间，包含本 数。混合纤维素酶与膨胀素的比例(重量重量)可进一步在大约10 1和大约1 2 之间，包含本数。混合纤维素酶与膨胀素的比例(重量重量)甚至可在大约5 1和 大约1 1.5之间，包含本数。在相关方面，提供酶组合物，其包含(a)包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶 和β-葡糖苷酶的混合纤维素酶组合物，以及(b)重组膨胀素。在一些实施方案中，组合物不包含EG4或CIP1。在一些实施方案中，组合物不 包含重组EG4或重组CIPl。在一些实施方案中，组合物不包含重组EG4并且不包含重 组 CIPl。在一些实施方案中，混合纤维素酶组合物基本由主要纤维素酶组成。在另一相关方面，提供酶组合物，其基本由下述物质组成(a)包含内切葡聚糖 酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的混合纤维素酶组合物，以及(b)重组膨胀素。在一些实施方案中，任一混合纤维素酶组合物中纤维素酶与膨胀素的比例(重量重量)在大约20 1和大约1 5之间。在一些实施方案中，任一混合纤维素酶组 合物中纤维素酶与膨胀素的比例(重量重量)在大约10 1和大约1 2之间。权利 要求20-25任一项的组合物，其中任一混合纤维素酶组合物中纤维素酶与膨胀素的比例 (重量重量)在大约5 1和大约1 1.5之间。在一些实施方案中，膨胀素和纤维素 酶以大约相等的量(重量重量)存在。在一些实施方案中，在针对纤维素底物的纤维素酶效率方面，组合物中膨胀素 的量(重量重量)替换组合物中大约相等量(重量重量)的纤维素酶。从下述描述中本组合物和方法的这些方面和其它方面将是明显的。

附图简述

图1图示了存在和不存在膨胀素时经混合纤维素酶组合物产生的葡萄糖。图2A和2B图示了对多种纤维素底物膨胀素的纤维素水解效果。图3图示了每克纤维素30毫克总酶产生的葡萄糖，该酶通过混合纤维素酶与膨 胀素的多种比例而提供。图4图示了在不同相对浓度的混合纤维素酶和膨胀素下软木浆的纤维素消化百 分数。详细描述I.定义在描述本组合物和方法之前，定义下述术语和短语。未定义的术语应与其在本 领域中所使用的普通意义一致。在本文中使用时，“膨胀素(swollenin)”是指具有协助消弱滤纸能力以及导致 棉花纤维肿胀能力而不具有纤维素水解活性(即涉及断裂个体纤维素链成更小单体(葡 萄糖)或寡聚物(多糖)的催化活性)的蛋白质/多肽。尽管就McQueen-Mason等人 (1992)Plant Cell 4 1425-33描述的扩展蛋白(expansin)蛋白质而言，对膨胀素进行宽松 定义是有用的，同样明显地是微生物膨胀素具有不同特性，例如，微生物膨胀素是比植 物扩展蛋白大得多的蛋白质，与植物扩展蛋白具有低水平的序列同一性。然而，某些微 生物膨胀素蛋白质与纤维素结合结构域联合存在并且还可与催化性纤维素酶结构域联合 存在。在本文中使用时，术语“纤维素底物”或纤维素原料”是指由相互交联和与木 质素交联的纤维素、半纤维素、葡聚糖组成的材料。此类纤维素底物也含有其它材 料如果胶、蛋白质淀粉和脂质，但优选地具有纤维素、半纤维素和葡聚糖作为主要 成分。在本文中使用时，术语“纯化”和“分离”，当用于指膨胀素时，是指从一些 或所有天然存在的与之天然相关的组分分离膨胀素，或从一些或所有经异源表达后与之 相关的组分中分离膨胀素。术语“组分” 一般是指其它蛋白质、核酸、脂质、细胞壁材 料和其它细胞成分。在本文中使用时，术语“K值”是指纤维素底物的木质化程度。κ值可使用 例如，国际标准化组织文件ISO 302 2004确定。在本文中使用时，术语“纤维素”是指由β (1 — 4)连接的D-葡萄糖单元组成 的具有通式(C6HltlO5)n的多糖。纤维素是绿色植物、许多藻类和卵菌细胞壁的主要结构成分。在本文中使用时，术语“纤维素酶”是指能够水解纤维素聚合物成更小寡聚物 和/或葡萄糖的酶。在本文中使用时，术语“全纤维素酶组合物/制剂/混合物”等等是指天然存 在和非天然存在的包括由生物(例如丝状真菌)产生的多种纤维素酶的组合物。全纤维 素酶组合物的一个例子是培养丝状真菌的培养基(即液体培养基)，其包含分泌的纤维素 酶，如预先确定比例的一种或更多种纤维二糖水解酶，一种或更多种内切葡聚糖酶，和 一种或更多种葡糖苷酶。在本文中使用时，“内切葡聚糖酶(EG)”是主要作用于纤维素纤维的无定形部 分从而在低结晶度区域水解内部β-1，4-糖苷键的酶(EC 3.2.1.4)。在本文中使用时，“纤维二糖水解酶(CBH) ”或“外切葡聚糖酶”是从纤维素 的还原或非还原末端水解纤维二糖从而降解结晶纤维素的酶(EC3.2丄91)。在本文中使用时，“β-葡糖苷酶”或“β-D-葡糖苷糖水解酶”是通过作用 从而从纤维二糖、纤维-低聚糖和其它葡糖苷释放D-葡萄糖单元的酶(EC3.2.1.21)。在本文中使用时，“半纤维素”是植物材料的聚合物成分，与仅含有葡萄糖的 纤维素相比，其含有葡萄糖之外的糖单体。除了葡萄糖，半纤维素可包含木糖、甘露 糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖等等，木糖是最常见的糖单体。半纤维素含有大部分 D-戊糖，偶尔含有少量的L-糖。半纤维素中的糖可通过酯键和糖苷键连接。示例形式 的半纤维素包括但不限于半乳聚糖、甘露聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、 葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖等等。在本文中使用时，术语“半纤维素酶”是指能够将半纤维素断裂成其成分糖或 更小聚合物的一类酶，包括内部作用水解酶、外部作用水解酶和多种酯酶。在本文中使用时，“主要纤维素酶”或“主要纤维素水解酶 (celluloyticenzyme)"是有效水解纤维素或从纤维素底物产生葡萄糖所需的纤维素酶。主 要纤维素酶包括CBH1、CBH2、EGU EG2和β -葡糖苷酶。在本文中使用时，术语“辅助酶”是指可包含于纤维素酶组合物中以提高纤维 素酶(或纤维素酶组合物)效率但对于有效水解纤维素或从纤维素底物产生葡萄糖所不需 要的酶。辅助酶包括膨胀素、EG4、纤维素诱导蛋白质(CIPl)和木聚糖酶。在本文中使用时，“天然存在” 组合物是天然产生或通过天然存在的生物产生 的组合物。在本文中使用时，“变体”蛋白质与“亲本”蛋白质不同，通过替换、删除 或添加小数目的氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20或更多氨基酸残基从“亲本”蛋白质衍生。在一些情 况下，亲本蛋白质是“野生型”、“天然”或“天然存在”的多肽。变体蛋白质可 描述为与亲本蛋白质具有一定百分数序列同一性，例如，至少80%、至少81%、至 少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至 少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%,至少97%、至少98%、甚至至少99%，其可通过本领域已知的适当软件程序确 定，例如在 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel 等人(编辑)(1987) Supplement 30，7.7.18 部分)中描述的那些。优选程序包括 VectorNTI Advance 9.0 (Invitrogen Corp.Carlsbad, CA)，GCG Pileup 程序，FASTA(Pearson 等人(1988) Proc Natl, Acad.Sci USA 85 2444-2448)，禾Π BLAST (BLAST Manual, Altschul 等人， Nat’ l.Cent.Biotechnol.Inf.，Nat’ ILib.Med. (NCIB NLM NIH)，Bethesda, Md., 禾口 Altschul 等人(1997) NucleicAcids Res.25 3389-3402)。另一个优选比对程序是 ALIGN Plus (Scientificand Educational Software, PA),优选地使用缺省参数。发现有用的另一个 序歹 1J软件程序是 TFASTA Data Searching Program,可在 SequenceSoftware Package Version 6.0 (Genetics Computer Group, University ofWisconsin, Madison, WI)获得。除 非另有特别说明，单数的使用包括了复数形式。除非另有说明，使用“或” 表示“和/或”。术语“包含/含有/包括”及其各种词性形式无限制的意图。术语
“基本由......组成”意思是指可任选地存在其它成分或步骤，但对产生或带来所描述的效
果不是必需的。本文中引用的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的所有氨基酸 和核苷酸序列，在此明确引入作为参考。除非另有说明，下述缩写/首字母缩略词具有下述意义°C摄氏度BSA牛血清白蛋白CBD碳水化合物结合结构域cDNA 互补 DNACMC羧甲基纤维素CMC羧甲基纤维素dH20或DI去离子水dffl20去离子水，Milli-Q过滤DNA脱氧核糖核酸ds或DS干固体含量EDTA乙二胺四乙酸eq.当量ETOH 乙醇g 或 gm 克GA葡糖淀粉酶Genencor Danisco US Inc，Genencor Division, Palo Alto, CA, USAH2O 水HPLC高压/效液相色谱hr 小时IPTG异丙基_ β -D-硫代半乳糖苷IU 国际单位kDa千道尔顿kg 千克L 升
M 摩尔mg 毫克min 禾口'分钟mL 和 ml 毫升mm 毫米mM毫摩尔 MW分子量N 正常PCS预处理玉米稿秆PEG 聚乙二醇pi等电点pNPG P"硝基苯基-a-D-吡喃葡萄糖苷RNA核糖核酸RPM转每分SDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳sec 禾口〃 秒sp./spp.种(单数 / 复数)Spz.SPEZYMEU 单位UFC超滤浓缩物ν/ν体积/体积w/v重量/体积w/w重量/重量Wt %重量百分数Pg 微克μ L 和 μ 1 微升μιη 微米μ M微摩尔II.使用膨胀素从纤维素原料中增加糖产量本组合物和方法一方面涉及通过向纤维素酶组合物添加膨胀素而从纤维素原料/ 底物增加糖产量。一方面，提供增强纤维素酶促水解的方法，该方法包括(a)组合纤 维素底物、混合纤维素酶组合物和膨胀素；以及(b)在有助于水解纤维素的条件下孵育 纤维素底物、混合纤维素酶组合物和膨胀素。本组合物和方法是基于下述令人吃惊的发 现通过膨胀素替换至多50%的混合纤维素酶组合物可大量增加从纤维素底物产生可发 酵糖的量。在多种食用植物中已经鉴定多种被称为“扩展蛋白”的蛋白质。据信这些扩 展蛋白增强水的渗透摄入，这是植物细胞扩张的驱动力。水进入细胞时，原生质体扩张 但被细胞壁限制，细胞壁由包埋在果胶胶样基质中的纤维素微纤维聚合物、半纤维素和 蛋白质的坚硬复合物维持在一起。扩展蛋白蛋白质家族在多种水果、蔬菜、谷物和燕麦中发现， 作为“壁松弛”因子起作用，其改变未成熟细胞壁的机械特性，允许其进行伸 长过程(参见，例如 Shcherban 等人(1995)Proc.Nat，l.Acad.Sci，U.S.A.92 9245-49 ； Wang 等人(1994)Biotech.Lett.l6 955-58; Keller 等人(1995) The Plant Journal8
795-802 ； Li等人(1993)Planta，Vol.191, pp.349_56)。扩展蛋白在植物细胞生长、果实
软化、脱木质化、根毛出现、花粉管侵入柱头和花柱、分生组织功能和其它出现细胞壁 松弛的发育过程中发挥重要作用。最近，扩展蛋白样酶已经从微生物宿主中鉴定。在美国专利No.6,458,928(引入 本文作为参考)描述过一次此类酶，称为膨胀素，来自于里氏木霉(Trichodermareesei)。 膨胀素的序列部分类似于植物扩展蛋白，其被认为断裂细胞壁中多糖之间的氢键。天然 多肽序列，包括氨基末端信号肽显示为SEQ ID NO : 1。成熟多肽序列显示为SEQ ID NO 2。不像扩展蛋白，成熟膨胀素在其氨基末端包含纤维素结合结构域(CBD)，其通 过连接区连接至扩展蛋白样结构域。这种类型的CBD也存在于公知的里氏木霉纤维素酶 中，如CBH I和EG II。不像膨胀素，纤维素酶至少在一定程度上有水解作用。MetAlaGlyLysLeuIleLeu ValAlaLeuAlaSerLeu ValSerLeuSerlleGlnGlnAsnCysAlaAlaLeuPheGlyGlnCysGlyGlylleGlyTrpSerGlyThrThrCysCysValAlaGlyAlaGlnCysSerPhe ValAsnAspTrpTyrSerGlnCysLeuAlaSerThrGlyGlyAsnProProAsnGlyThrThrSerSerSerLeu ValSerArgThrSerSerAlaSerSerSerValGlySerSerSerProGlyGlyAsnSerProThrGlySerAlaSerThrTyrThrThrThrAspThrAlaThrValAlaProHisSerGlnSerProTyrProSerlleAlaAlaSerSerCysGlySerTrpThrLeuValAspAsnValCysCysProSerTyrCysAlaAsnAspAspThrSerGluSerCysSerGlyCysGlyThrCysThrThrProProSerAlaAspCysLysSerGlyThrMetTyrProGluValHisHisValSerSerAsnGluSerTrpHisTyrSerArgSerThrHisPheGlyLeuThrSerGlyGlyAlaCysGlyPheGly
LeuTyrGlyLeuCysThrLysGlySerValThrAlaSerTrpThrAspProMetLeuGlyAlaThrCysAspAlaPheCysThrAlaTyrProLeuLeuCysLysAspProThrGlyThrThrLeuArgGlyAsnPheAlaAlaProAsnGlyAspTyrTyrThrGlnPheTrpSerSerLeuProGlyAlaLeuAspAsnTyrLeuSerCysGlyGluCysIleGluLeuIleGlnThrLysProAspGlyThrAspTyrAlaValGlyGluAlaGlyTyrThrAspProIleThrLeuGluIleValAspSerCysProCysSerAlaAsnSerLysTrpCysCysGlyProGlyAlaAspHisCysGlyGluIleAspPheLysTyrGlyCysProLeuProAlaAspSerlleHisLeuAspLeuSerAspIleAlaMetGlyArgLeuGlnGlyAsnGlySerLeuThrAsnGlyValIleProThrArgTyrArgArgValGlnCysProLys ValGlyAsnAlaTyrIleTrpLeuArgAsnGlyGlyGlyProTyrTyrPheAlaLeuThrAlaValAsnThrAsnGlyPro
GlySerValThrLysIleGluIleLysGlyAlaAspThrAspAsnTrp ValAlaLeuValHisAspProAsnTyrThrSerSerArgProGlnGluArgTyrGlySerTrp ValIleProGlnGlySerGlyProPheAsnLeuPro ValGlylleArgLeuThrSerProThrGlyGluGlnlleValAsnGluGlnAlalleLysThrPheThrProProAlaThrGlyAspProAsnPheTyrTyrlleAspIleGlyValGlnPheSerGlnAsn (SEQ ID NO 1)GlnGlnAsnCysAlaAlaLeuPheGlyGlnCysGlyGlylleGlyTrpSerGlyThrThr
CysCysValAlaGlyAlaGlnCysSerPhe ValAsnAspTrpTyrSerGlnCysLeuAlaSerThrGlyGlyAsnProProAsnGlyThrThrSerSerSerLeu ValSerArgThrSerSerAlaSerSerSerValGlySerSerSerProGlyGlyAsnSerProThrGlySerAlaSerThrTyrThrThrThrAspThrAlaThrValAlaProHisSerGlnSerProTyrPro
SerlleAlaAlaSerSerCysGlySerTrpThrLeuValAspAsnValCysCysProSerTyrCysAlaAsnAspAspThrSerGluSerCysSerGlyCysGlyThrCysThrThrProProSerAlaAspCysLysSerGlyThrMetTyrProGluValHisHisValSerSerAsnGluSerTrpHisTyrSerArgSerThrHisPheGlyLeuThrSerGlyGlyAlaCysGlyPheGlyLeuTyrGlyLeuCysThrLysGlySerValThrAlaSerTrpThrAspProMetLeuGlyAlaThrCysAspAlaPheCysThrAlaTyrProLeuLeuCysLysAspProThrGlyThrThrLeuArgGlyAsnPheAlaAlaProAsnGlyAspTyrTyrThrGlnPheTrpSerSerLeuProGlyAlaLeuAspAsnTyrLeuSerCysGlyGluCysIleGluLeuIleGlnThrLysProAspGlyThrAspTyrAlaValGlyGluAlaGlyTyrThrAspProIleThrLeuGluIleValAspSerCysProCysSerAlaAsnSerLysTrpCysCysGlyPro
GlyAlaAspHisCysGlyGluIleAspPheLysTyrGlyCysProLeuProAlaAspSerIleHisLeuAspLeuSerAspIleAlaMetGlyArgLeuGlnGlyAsnGlySerLeuThrAsnGlyValIleProThrArgTyrArgArgValGlnCysProLys ValGlyAsnAlaTyrIleTrpLeuArgAsnGlyGlyGlyProTyrTyrPheAlaLeuThrAla ValAsnThrAsnGlyProGlySerValThrLysIleGluIleLysGlyAlaAspThrAspAsnTrp ValAlaLeuValHisAspProAsnTyrThrSerSerArgProGlnGluArgTyrGlySerTrpValIleProGlnGlySerGlyProPheAsnLeuPro ValGlyIleArgLeuThrSerProThrGlyGluGlnlleValAsnGluGlnAlalleLysThrPheThrProProAlaThrGlyAspProAsnPheTyrTyrlleAspIleGlyValGlnPheSerGlnAsn (SEQ ID NO 2)在一些实施方案中，膨胀素是里氏木霉膨胀素天然存在的变体，具有与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少 93%,至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或甚至至少99%氨基 酸序列同一性。在一些实施方案中，膨胀素从不同生物中获得，并具有与SEQ ID NO:
1的氨基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至 少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或甚至至少99 %氨基酸序列同 一性。在进一步的实施方案中，膨胀素是工程化变体膨胀素，其包含赋予膨胀素有利特征的至少一个替代、插入或删除，并且其中剩余氨基酸序列(即不包括一个或更多 替代、插入、或删除)具有与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列至少80%、至少85%、至 少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%,至少98%，或甚至至少99%氨基酸序列同一性。替代、插入、或删除可在氨基末 端CBD，由此影响纤维素结合，或在多肽CBD之外的部分，由此影响例如纤维素底物中 氢键的破坏。在相关实施方案中，膨胀素是保留本文描述生物活性的膨胀素的片段或结 构域。在特定实施方案中，该片段缺少CBD。用于与膨胀素一起使用的适当纤维素底物包括木材、木浆、造纸淤泥、纸浆废液、颗粒板、玉米 稿秆、玉米纤维、稻、纸张和纸浆加工废弃物、木本或草本植物、 草、稻壳、棉花秸秆、玉米芯、酒糟、叶、小麦秸秆、椰子毛、柳枝稷、及其混合物。 本组合物和方法的一方面是发现添加膨胀素至纤维素酶增强木本和草本底物的糖产生。 另一方面，据信膨胀素不利于用于基于谷物或基于水果的底物。一般而言，由于膨胀素 打断氢键的能力，任何以氢键为主的底物(例如结晶纤维素)似乎对膨胀素活性是敏感 的，因此是适当底物。示例性纤维素底物具有高木质素含量，如例如软木的情况。在一 些情况下，纤维素底物具有80或更高的κ值，例如80、81、82或更高。纤维素底物可直接使用(即不进行预处理)，或使用本领域已知常规方法进行预 处理。示例性预处理是化学、物理和生物预处理。非限制性地，物理预处理包括多种类 型的碾磨、破碎、蒸煮/蒸气爆破、照射和水热解。非限制性地，化学预处理技术包括 稀释酸、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳和控制pH水热解。非限制性地，生物 预处理技术包括向底物施用木质素溶解微生物。酶水解纤维素优选在温度范围大约45°C至大约75°C，并且pH大约3.5至大约7.5 下进行。在水解开始前，水解反应器中纤维素的初始浓度，优选为大约4% (w/w)至大 约15% (w/w)。所有主要纤维素酶的组合剂量可在每克纤维素大约5至大约45毫克蛋 白质。水解进行的时间期间在大约12小时至大约200小时。优选地，水解进行的期间 为15小时至100小时。应当理解反应条件无意于以任何方式限制本发明，可由本领域技 术人员的根据需要调整。水解过程优选地将大约80%至大约100%或其间任何范围的纤维素转化为可溶 性糖。更优选地，酶水解过程将大约90%至大约100%的纤维素转化为可溶性糖，或甚 至大约98%至大约100%的纤维素转化为可溶性糖。使用混合纤维素酶组合物和膨胀素的水解可以是分批水解、连续水解或其组 合。水解可搅动、未混合或其组合。水解一般地在水解反应器中进行。在添加底物至 水解反应器之前，之中或之后，将主要纤维素酶和膨胀素酶添加至预处理的纤维素原料 (也称作“底物”)中。在水解中可同时或者依次加入纤维素酶和膨胀素。在水解的延 长期间，将额外的纤维素酶和/或膨胀素添加至部分消化的纤维素底物中。膨胀素可从天然产生它的微生物菌株中分离，但优选地由遗传修饰的生物产 生，其中编码膨胀素或其活性片段的基因有效连接至用于过表达该蛋白质的强启动子。 产生的基因构建体(即核酸序列)包含至少编码膨胀素基因部分，用于转化异源或同源宿 主细胞，该细胞随后在表达所需蛋白质的条件下培养。重组蛋白表达方法是本领域已知 的。适当的宿主细胞包括，例如，丝状真菌，如木霉属物种(Trichoderma spp.)或曲霉属 物种(Aspergillusspp.)和酵母。制备膨胀素的优选模式是通过DNA构建体转化木霉属物 种宿主细胞，该DNA构建体包含有功能地连接至启动子的至少编码部分或全部膨胀素的 DNA片段。然后转化的宿主细胞在条件下培养从而表达所需蛋白质。优选地膨胀素作为分泌至培养基中的细胞外蛋白产生，其可直接用作膨胀素的 来源(例如作为液体培养基)，或用于通过本领域已知的方法进一步分离和/或纯化膨胀 素。备选地，当膨胀素作为细胞内蛋白表达时，破坏细胞随后分离和/或纯化细胞内膨 胀素。当需要获得在无纤维素水解活性的情况下的膨胀素蛋白质时，在引入含有编码膨胀素DNA片段的DNA构建体或质粒之前，获得已经删除一种或更多种纤维素酶 基因的木霉属宿主细胞株是有用的。此类细胞株可通过美国专利No.5,246,853和WO 92/06209公开的方法制备，其公开引入本文作为参考。通过在缺失一种或更多种纤维素 酶基因的宿主微生物中表达膨胀素，鉴定和随后的纯化程序被简化了。然而，对于在本 发明中使用，不必从纯化的膨胀素中完全排除纤维素水解酶。 在特定实施方案中，膨胀素或其衍生物在液体培养基中培养之后从宿主细胞中 以活性形式回收。膨胀素可包括适当翻译后加工。表达的膨胀素可通过常规技术从培养 基中回收，包括从培养基中通过离心、过滤分离细胞和或通过盐(例如硫酸铵)沉淀上清 中的蛋白质或过滤。备选地或额外地，可以使用色谱程序如离子交换色谱或亲和色谱。 可产生针对纯化膨胀素、纯化膨胀素片段或对应于膨胀素部分合成肽的抗体(多克隆或 单克隆)。在一些实施方案中，膨胀素蛋白质从与其天然相关或用于表达膨胀素的其它细 胞成分中分离或纯化。纯化的膨胀素不必缺乏所有其它成分，只要比在天然状态、培养 基中或溶解细胞中发现的膨胀素与异物蛋白质(和/或其它成分)的比例更高即可。纯 化可通过认可的分离技术完成，如离子交换色谱、亲和色谱、疏水分离、透析、蛋白酶 处理、硫酸铵或其它盐沉淀、离心、大小排阻色谱、过滤、微量过滤、凝胶电泳或梯度 分离去除在最终组合物中不需要的完整细胞、细胞碎片、杂质、异物蛋白质(包括酶)。 然后也可以添加成分至含有膨胀素的组合物中，其提供额外的益处，例如激活剂、抗抑 制剂、离子、控制pH的化合物或其它酶如纤维素酶。添加至水解混合物中膨胀素的量可根据待处理的生物质而变化，但一般是大约 0.1至大约30毫克/克纤维素，优选地大约2毫克/克至大约20毫克/克纤维素，甚至 大约5毫克/克至大约15毫克/克纤维素。备选地，本发明中使用膨胀素的量可根据总 纤维素底物或总原始或预处理的生物质确定。膨胀素的处理在大约20至大约80°C，优选 地在大约30至大约50°C，pH范围在大约3至大约10，优选地在大约4至大约6进行大 约0.1至大约24小时，优选地进行大约2至大约6小时，在大约至大约30%固体(干 物质)装载，优选地在大约15%至大约25%固体(干物质)装载下进行。一般而言，酶将以纤维素酶膨胀素的比例大约5 1至大约1 5使用。更 优选地，酶以纤维素酶膨胀素比例大约2 1至大约1 2使用。酶相对比例可根据 纤维素底物的类型而变化。在一些情况下，与组合物中纤维素酶的量相比，膨胀素代表 处理纤维素材料组合物中大约相等量的酶。大约相等量意味着大约40-60%的酶是膨胀 素，例如大约50%。富含氢键的微晶纤维素底物(即软木浆)与具有相对低程度氢键的 无定形底物(即磷酸溶胀的纤维素)相比可能需要更多膨胀素。用于所描述用途的混合纤维素酶组合物可具有三种协同纤维素水解活性内 切-1，4-i3-D_葡聚糖酶、外切-1，4-β-葡糖苷酶和β-D-葡糖苷酶活性。这些活性 的每一种都可通过一种或更多种纤维素酶提供，其在本组合物和方法中代表主要纤维素 酶(及其活性)。混合纤维素酶组合物中任何纤维素酶可提供三种纤维素水解活性的一种 或更多种。示例性主要纤维素酶包括CHB1、CBH2、EG1、EG2和β-葡糖苷酶。纤 维素酶组合物可以是蛋白质的水溶液、蛋白质在水中的浆液、固体粉末或颗粒或凝胶。 包含纤维素酶的混合物可包含添加剂如缓冲液、去污剂、稳定剂、填充剂或其它本领域技术人员熟悉的此类添加剂。 在一些实施方案中，本组合物和方法不需要额外的辅助酶(即除了膨胀素之外) 与主要纤维素酶或与纤维素酶组合联合，如可能在全纤维素酶液体培养基中发现的那 样。此类额外辅助酶包括EG4、CIPl和木聚糖酶。因而，在某些实施方案中，本组合 物和方法基本由膨胀素和一种或更多种主要纤维素酶组成，不存在辅助酶如EG4、CIPl 和/或木聚糖酶。在特定实施方案中，本组合物和方法基本由膨胀素和一种或更多种主 要纤维素酶组成，不存在EG4或CIP1。在更特定实施方案中，组合物和方法基本由膨胀 素和一种或更多种主要纤维素酶组成，不存在EG4和CIPl。纤维素酶和/或膨胀素可来源于微生物来源，尤其是来自于真菌或细菌来源。 拥有纤维素水解能力的微生物可以既是纤维素酶的来源又是膨胀素蛋白质的来源。在一 些实施方案中，纤维素酶和/或膨胀素来源于木霉属物种(Trichoderma spp.)，特别是里 氏木霉(长枝木霉(Iongibrachiatum))。然而，纤维素酶和/或膨胀素也可以来源于真菌， 如犁头霉属物种(Absidia spp.)；支顶孢属物种(Acremonium spp.)；伞菌属物种(Agaricus spp.) ； Anaeromycesspp.；曲霉属物禾中(Aspergillus spp.),包括棘孢曲霉(A.auculeatus)， 泡盛曲霉(A.awamori)，黄曲霉(A.flavus)，臭曲霉(A.foetidus)，A.fumaricus,烟曲霉 (A.fumigatus)，构巢曲霉(A.nidulans)，黑曲霉(A.niger)，米曲霉(A.oryzae)，土曲霉 (A.terreus)禾口杂色曲霉(A.versicolor) ； Aeurobasidium spp.；头孢属物禾中(Cephalosporum spp.)；毛壳菌属物种(Chaetomium spp.)；金小孢子属物种(Chrysosporium spp.)； 鬼伞属物种(Coprinus spp.) ； Dactyllumspp.；镰孢属物种(Fusarium spp.),包括 F.conglomerans,多隔镰孢(F.decemcellulare)，爪卩圭镰孢(F.javanicum), F.Iini,尖镰孢 (Foxysporam)和腐皮镰孢(F.solani)；胶枝霉属物种(Gliocladium spp.)；腐质霉属物种 (Humicola spp.)，包括特异腐质霉(H.insolens)和嗜热羊毛状腐质霉(H.lanuginosa)；毛 霉属物种(Mucor spp.)；脉孢菌属物种(Neurospora spp.)，包括粗糙脉孢霉(N.crassa) 禾口 好食脉孢霉(N.sitophila) ； Neocallimastix spp. ； Orpinomyces spp.；青霉属物种 (Penicillium spp)；白腐真菌属物种(Phanerochaete spp.)；射脉菌属物种(Phlebia spp.)； Piromyces spp.；假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)；根霉属物种(Rhizopus spp.)；裂褶 菌属物种(Schizophyllum spp.)；栓菌属物种(Trametes spp.)；木霉属物种(Trichoderma spp.),包括里氏木霉(T.reesei)，长枝木霉(Iongibrachiatum)和绿色木霉(T.viride)；禾口 接霉属物种(Zygorhynchus spp)。相似地，预见到膨胀素和/或编码膨胀素DNA可发现 于分解纤维素的细菌，如杆菌属物种(Bacillus spp.)；纤维单胞菌属物种(Celhilomonas spp.)；梭菌属物种(Clostridium spp.)；毁丝霉属物种(Myceliophthora spp.)；热单孢 菌属物种(Thermomonospora spp.)；链霉菌属物种(Streptomycesspp.),包括橄榄色链 霉菌(S.olivochromogenes)；特别是纤维降解瘤胃细菌如产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)；和酵母包括 Candida torresii ；近平滑假丝酵母(C.parapsllosis)；清酒 假丝酵母(C.sake)；诞沫假丝酵母(C.zeyhnoides)；微小毕赤酵母(Pichiaminuta)； 胶红类酵母(Rhodotoralaglutinis)；胶红酵母(R.mucilaginosa)；和不对称掷孢酵母 (Sporobolomyces holsaticus)。本组合物和方法可根据下述例子进一步理解，这些例子不应解释为限制性的。 对材料和方法的修饰对本领域技术人员来说将是明显的。实施例提供下述例子示例性说明本组合物和方法。实施例1 膨胀素对软木浆的评价

每次试验将相当于0.1克纤维素的软木浆添加至20毫升玻璃闪烁瓶中。减去将 在每次试验中添加的酶量，通过添加蒸馏水将每瓶总体积加至10毫升。每瓶内容物通过 在设定于50° 士 1°C的保温箱中加温至50°C。向每瓶添加1或2毫克从木霉属获得的全纤 维素酶组合物(即SPEZYME CP，比活=3200-4110IU/g ； Genencor International, Inc., Palo Alto, CA, USA)至最终纤维素酶浓度为每克纤维素10毫克纤维素酶或每克 纤维素20毫克纤维素酶(如表1所描述)。纯化的膨胀素或作为对照的牛血清白蛋白 (BSA，Sigma)添加至终浓度为10毫克/克纤维素(表1)。根据Saloheimo等人(2002) Eur.J.Biochem.269 4202-11 (参见实施例5，见下文)描述的程序制备膨胀素、纯化并表 征。膨胀素蛋白质的浓度通过凝胶电泳估计，在两种制剂中都是大约3毫克/毫升。封闭瓶并在50°C温和旋转(180RPM)下孵育24小时。取一份用于分析。固体 通过离心去除。上清使用YSI葡萄糖分析仪或Waters AllianceHPLC系统进行葡萄糖分 析。结果显示于表1和图1中。补充了膨胀素的纤维素酶在24小时内增加了来自软木 和PCS底物两者的葡萄糖浓度。在相同总蛋白质装载(20毫克)条件下，10毫克膨胀素 基本能够替换10毫克纤维素酶。对照蛋白质(BSA)不能产生相同效果。表1
酶(/克纤维素)葡萄糖(克/升)一
_^__软木 PCS 7.2%
_10毫克纤维素酶__10,7__46
__20毫克纤维素酵__^__51.9
10毫克纤维素酶+ 10毫克膨胀素__13,4__49
；亳克纤维素酶+10亳克牛血清白蛋白I 11.445.5实施例2 膨胀素的底物选择性的羧甲基纤维素(CMC) ； 的solka Floc(合成的纯的微晶纤维素)；软木 (κ值=0)；软木(κ值=82)；混合硬木(κ = 81)；软木(κ = 80)；和废浆(κ = 60)；用于试验在添加膨胀素后增强的葡萄糖产生。相当于0.1克纤维素量的每种纤维素 底物添加至20毫升玻璃闪烁瓶中用于每次试验。每瓶添加5.0毫升含有0.1Μ柠檬酸钠 缓冲液(ρΗ 4.8)、40 μ L (400 μ g)四环素和30 μ L (300 μ g)放线菌酮的溶液。通过添加 蒸馏水(减去在每次试验中将要添加的酶量)每瓶加至总体积10毫升。每瓶内容物通 过在设定于50° 士 1°C的保温箱中加温至50°C。向每瓶添加从木霉属获得的全纤维素酶 组合物(即SPEZYME CP，比活=3200-4110IU/g ； Genencor International, Inc., PaloAlto, CA, USA)至最终纤维素酶浓度为每克纤维素20毫克纤维素酶。另外，添加β -葡糖苷酶至最终浓度64pNPG U/g纤维素。添加半纯化的膨胀素至最终浓度10毫克/克纤维素(见表1)。如前所述，膨胀 素根据Saloheimo等人(2002) Eur.J.Biochem.269 4202-11 (参见实施例5，见下文)描述
的程序制备、纯化并表征。膨胀素蛋白质的浓度通过凝胶电泳估计，在两种制剂中都是
大约2毫克/毫升。封闭瓶并在50°C温和旋转(180RPM)下孵育24小时。取一份用于分析。固体 通过离心去除。上清使用YSI葡萄糖分析仪或Waters AllianceHPLC系统进行葡萄糖分 析。结果显示于表2和图2A和2B中。表权利要求
1.增加使用纤维素酶水解纤维素的效率的方法，该方法包括(a)组合纤维素底物、纤维素酶组合物和重组膨胀素，以及(b)在有助于水解纤维素的条件下孵育纤维素底物、纤维素酶组合物和膨胀素， 其中与缺少膨胀素时使用纤维素酶组合物获得的效率相比，重组膨胀素的存在增加了纤维素酶组合物的纤维素酶水解效率。
2.权利要求1的方法，其中纤维素酶组合物是全纤维素酶组合物。
3.权利要求1的方法，其中纤维素酶组合物是混合纤维素酶组合物。
4.权利要求1的方法，其中纤维素酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和 β-葡糖苷酶。
5.权利要求1的方法，其中纤维素酶组合物包含一种或更多种主要纤维素酶。
6.权利要求1的方法，其中纤维素酶组合物基本由一种或更多种主要纤维素酶组成。
7.权利要求5或6的方法，其中主要纤维素酶选自CBH1、CBH2、EGUEG2和 β-葡糖苷酶。
8.权利要求1-7任一项的方法，在除了膨胀素之外不存在其它辅助酶的情况下实施。
9.权利要求1-7任一项的方法，在不存在EG4和CIPl的情况下实施。
10.权利要求1-7任一项的方法，在不存在重组EG4或重组CIPl的情况下实施。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中纤维素酶组合物中纤维素酶与膨胀素的比例 (重量重量)在大约20 1和大约1 5之间。
12.权利要求1-10任一项的方法，其中纤维素酶组合物中纤维素酶与膨胀素的比例 (重量重量)在大约10 1和大约1 2之间。
13.权利要求1-10任一项的方法，其中纤维素酶组合物中纤维素酶与膨胀素的比例 (重量重量)在大约5 1和大约1 1.5之间。
14.权利要求1-10任一项的方法，其中膨胀素和纤维素酶以大约相等的量(重量重 量)存在。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中纤维素底物选自木材、木浆、造纸淤泥、纸浆 废液、颗粒板、玉米稿秆、玉米纤维、稻、纸张和纸浆加工废弃物、木本或草本植物、 草、稻壳、棉花秸秆、玉米芯、酒糟、叶、小麦秸秆、椰子毛、柳枝稷、及其混合物。
16.权利要求1-14任一项的方法，其中纤维素底物是软木。
17.权利要求1-14或16任一项的方法，其中纤维素底物是高木质素底物。
18.权利要求1-14、16或17任一项的方法，其中纤维素底物具有80或更高的κ值。
19.权利要求1-18任一项的方法，其中纤维素酶效率的增加百分数为至少大约 10%。
20.酶组合物，其包含(a)包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的混合纤维素酶组合物，以及(b)重组膨胀素。
21.权利要求20的组合物，其中组合物不包含EG4或CIPl。
22.权利要求20的组合物，其中组合物不包含重组EG4或重组CIPl。
23.权利要求20的组合物，其中组合物不包含重组EG4并且不包含重组CIPl。
24.权利要求20-23任一项的组合物，其中混合纤维素酶组合物基本由主要纤维素酶 组成。
25.酶组合物，其基本由以下物质组成(a)包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的混合纤维素酶组合物，以及(b)重组膨胀素。
26.权利要求20-25任一项的组合物，其中混合纤维素酶组合物中纤维素酶与膨胀素 的比例(重量重量)在大约20 1和大约1 5之间。
27.权利要求20-25任一项的组合物，其中混合纤维素酶组合物中纤维素酶与膨胀素 的比例(重量重量)在大约10 1和大约1 2之间。
28.权利要求20-25任一项的组合物，其中混合纤维素酶组合物中纤维素酶与膨胀素 的比例(重量重量)在大约5 1和大约1 1.5之间。
29.权利要求20-25任一项的组合物，其中膨胀素和纤维素酶以大约相等的量(重 量重量)存在。
30.权利要求20-25任一项的组合物，其中在针对纤维素底物的纤维素酶效率方面， 组合物中膨胀素的量(重量重量)替换组合物中大约相等量(重量重量)的纤维素 酶。
全文摘要
本申请所描述的是涉及使用多肽膨胀素增加从纤维素生物质中产生糖的纤维素酶效率的组合物和方法。
文档编号C12N9/42GK102016055SQ200980115209
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月29日 优先权日2008年4月29日
发明者C·米奇森, R·F·萨拉, T·T·黄 申请人:丹尼斯科美国公司