专利名称：与硅转运相关的组合物和方法
与硅转运相关的组合物和方法
背景技术：
本发明涉及可以用于在植物中(比如大豆)增加硅吸收并且增加对生物性以及非生物性胁迫的耐受性的组合物和方法。对植物的生物性以及非生物性胁迫每年对作物引起价值数十亿美元的危害。例如，大豆锈病(由豆薯层锈菌真菌所引起的一种疾病)2003年在巴西导致价值大约十亿美元的损害。这种疾病现在已经开始传播进入美国(全世界大豆最大的生产者)。虽然这种锈病可以使用化学杀菌剂来治疗，这么做是昂贵的、对环境有潜在的损害、并且可能仅仅是部分有效的。因此，对于用于保护植物免受生物性连同非生物性胁迫的额外的或改进的方法存在一种需求。大豆锈病的预防或控制是在这方面最重要的应用之
ο发明概述我们已经发现在已知的有效吸收硅的植物中硅流入和流出转运蛋白的基因，这些植物包括小麦、木贼、高粱、燕麦、以及大麦。这些编码的转运蛋白当在一种植物(如大豆) 中表达时增加对生物性以及非生物性应激源的耐受性。因此，本发明的特征在于对硅转运蛋白进行编码的多核苷酸；包括这类多核苷酸的载体、细胞、以及植物；以及用于制造这类植物的方法。该发明的特征还在于硅转运蛋白多肽以及它们的片段。具体地讲，有用的是用在此所说明的这些硅转运蛋白转化的大豆植物，其中该硅转运蛋白的表达导致对大豆锈病的耐受性增加。相应地，在一个第一方面中，本发明的特征在于一种基本上纯的多核苷酸，该多核苷酸包括与选自下组的一种序列基本上一致的一个核酸序列(例如至少85^^90^^95%, 96%,97%,98%,99%,99. 5%、或 100%—致性)，该组的组成为=SEQ ID NO :4、9、12、13、 14、15、33、52、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124-919,SEQ ID NO 22 的核苷酸 146-694、以及 SEQ ID NO 32的核苷酸1M-1014、或其一种片段。本发明的特征还在于包括一个核酸序列的一种多核苷酸，该核酸序列编码与选自下组的一种序列基本上一致的一种多肽，，该组的组成为SEQ ID NOS :5、6、34-38、60、以及68、或其一种片段。在其他的实施方案中，将该核酸序列进行修饰以便包含一种或多种(例如至少2、3、4、5、8、10、15)突变、缺失、插入、或它们的一种组合。该修饰的核酸序列可以编码当它在一种细胞中表达时具有增加或者减少硅转运的一种多肽。该多肽在与小麦SIITl序列(SEQ ID NO 37)的位置132对应的位置可以具有一种突变。在某些实施方案中，该突变是一种苏氨酸到丙氨酸的突变)。在某些实施方案中，该多核苷酸是与SEQ ID NO :50基本上一致的或该多核苷酸编码与SEQ ID NO 51 基本上一致的一种多肽。在一些实施方案中，在一种细胞中由该第一方面的多核苷酸编码的多肽的表达增加或能够增加进入所述细胞的硅转运。在另一方面，本发明的特征在于包括与选自下组的一种核苷酸序列基本上一致的 (例如至少 85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%、或 100%—致性)一个核酸序列的一种基本上纯的多核苷酸，该组的组成为SEQ ID N0SJ9、71、以及73、或其一种片段。 本发明的特征还在于包括一个核酸序列的一种基本上纯的多核苷酸，该核酸序列编码与选自下组的一种氨基酸序列基本上一致的一种多肽，该组的组成为SEQ ID N0S:31、72、以及 74、或其一种片段。在一些实施方案中，在一种细胞中由该多核苷酸编码的多肽的表达增加或能够增加离开所述细胞的硅转运。在另一方面，本发明的特征在于包括与选自下组的一种核苷酸序列基本上一致的 (例如至少 85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%、或 100%—致性)一个核酸序列的一种基本上纯的多核苷酸，该组的组成为SEQ ID N0:56、58、以及59、或其一种片段。 本发明的特征还在于包括一个核酸序列的一种基本上纯的多核苷酸，该核酸序列编码与选自下组的一种序列基本上一致的一种多肽，该组的组成为SEQ ID N0:63、65、以及66、或其一种片段。在一些实施方案中，在一种细胞中由该多核苷酸编码的多肽的表达增加或能够增加进入所述细胞的硅转运。在上述方面的任何一种中，该多核苷酸长度可能是小于1，000、500、100、50、30、 20、15、10、8、6、5、4、3、或2吐。该多核苷酸可以被可操作地连接到一种启动子上，例如能够在一种植物细胞中表达的一种启动子。该启动子可以是时间依赖性的、细胞特异性的(例如根细胞)、或组织特异性的(例如在此所说明的任何一种组织中)。该启动子可以是组成型的或诱导型的，例如在类似任何一种非生物性或生物性胁迫的环境条件之下(例如在此所说明的那些)。本发明的特征还在于包括本发明的一种多核苷酸的一种载体。该载体可以进一步包括一种第二多核苷酸。在一个实施方案中，该第二多核苷酸编码一种硅流出转运蛋白或其一种片段(例如与选自下组的一种序列基本上一致的一种多核苷酸，该组的组成为SEQ IDNO :28、四、71、以及73 ；对与选自下组的一种序列基本上一致的一种多肽进行编码的一种多核苷酸，该组的组成为SEQ ID而30、31、72、以及74、或其一种片段)。在另一个实施方案中，该第二多核苷酸编码一种硅流入转运蛋白或其一种片段(例如与选自下组的一种序列基本上一致的一种多核苷酸，该组的组成为SEQ ID N0:3、4、9、12、13、14、 15、33、50、52、53、55、56、57、58、59、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124-919、SEQ ID NO :22 的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO :32的核苷酸124-1014 ；对与选自下组的一种氨基酸序列基本上一致的一种多肽进行编码的一种多核苷酸，该组的组成为SEQ ID NO :5,6,34-38, 51、54、60、61、62、63、64、65、66、以及68、或其一种片段)。本发明的特征还在于一种细胞， 例如包括该载体的一种植物细胞(例如一种大豆细胞或来自在此所说明的任何一种植物的一种细胞)、一种细菌细胞、或在此所说明的任何一种细胞。在一些实施方案中，该细胞可以是一种植物种子或来自一种植物(例如在此所说明的任何一种植物)的一种组织的一部分。本发明的特征还在于由在此所说明的这些多核苷酸的任何一种进行编码的一种多肽、或其片段。该多肽可以是基本上纯的或可以在一种细胞中重组表达。在另一方面，本发明的特征在于包括一个或多个异源多核苷酸的一种植物(例如大豆或在此所说明的任何一种植物)、植物组织、或种子，该异源多核苷酸包括与对一种硅流入转运蛋白或其一种片段进行编码的一个核酸序列基本上一致的一个核酸序列(例如，与选自下组的一种序列基本上一致的一个核酸序列，该组的组成为SEQ ID NO :3,4,9, 12、13、14、15、33、50、52、53、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124-919、SEQ ID NO :22 的核苷酸 146-694、以及SEQ ID NO :32的核苷酸124-1014，或其一种片段)或对与SEQ ID NO :5、6、 34-38、51、54、60、61、以及68、或其一种片段的一种氨基酸序列基本上一致的一种多肽进行编码的一个核酸序列。由该异源多核苷酸编码的多肽在表达时可以增加或能够增加进入该植物内至少一个组织或细胞(例如根细胞)的硅转运。该植物、植物组织、或种子可以进一步包括与对一种硅流出转运蛋白、一种硅流入转运蛋白、或其一种片段进行编码的一种多核苷酸基本上一致的一种第二异源多核苷酸。该第二异源多核苷酸可以是与以下序列基本上一致的(a)选自下组的一个核酸序列，其组成为SEQ ID NO :28、四、71、以及73，(b)对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为SEQ ID NO :30,31, 72、以及74，或(c)其一种片段。在其他的实施方案中，该第二异源多核苷酸是与以下序列基本上一致的(a)SEQ ID NO :55、56、57、58、或 59 的核酸序列，(b)对 SEQ ID NO :62、63、 64、65、或66的氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，或(c)其一种片段。该植物可以显示对一种或多种生物性或非生物性胁迫(例如在此所说明的那些)增强的耐受性。在一个实施方案中，该植物是展示了对大豆锈病增强的耐受性的一种大豆植物、或来自这样一种植物的一种组织或种子。 在另一方面，本发明的特征在于一种植物(例如大豆或在此所说明的任何一种植物)、植物组织、或种子，它们包括一种或多种异源多核苷酸，这些异源多核苷酸包括与对一种硅流出转运蛋白或其一种片段进行编码的一个核酸序列基本上一致的一个核酸序列。该多核苷酸可以包括与以下序列基本上一致的一种序列(a)选自下组的一个核酸序列，该组的组成为SEQ ID而28、四、71、以及73，或(13)对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为SEQ ID N0:30、31、72、以及74，或(c)其一种片段。该异源多核苷酸可以编码一种多肽，该多肽在表达时增加或能够增加离开该植物内至少一个组织或细胞(例如，根细胞)的硅转运。该植物、植物组织、或种子可以进一步包括与对一种硅流入转运蛋白、或其一种片段进行编码的一个核酸序列基本上一致的一种第二异源多核苷酸序列。该第二多核苷酸可以是与以下序列基本上一致的(a)选自下组的一个核酸序列，该组的组成为SEQ ID NO :3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124-919,SEQ ID NO 22 的核苷酸 146-694、以及 SEQ ID NO 32 的核苷酸 124-1014，(b) 对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为SEQ ID NO :5,6, 34-38、51、54、60、61、以及68，或(c)其一种片段。在其他的实施方案中，该第二异源多核苷酸是与以下序列基本上一致的(a)选自下组的一个核酸序列，其组成为SEQ ID N0:55、 56、57、58、以及59，(b)对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为=SEQ IDNO :62、63、64、65、以及66，或(c)其一种片段。该植物、植物组织、或种子可以显示对一种或多种生物性或非生物性胁迫(例如在此所说明的那些)增强的耐受性。在一个实施方案中，该植物是展示了对大豆锈病增强的耐受性的一种大豆植物、或来自这样一种植物的一种组织或种子。在又一方面，本发明的特征在于一种植物(例如大豆或在此所说明的任何一种植物)、植物组织、或种子，它们包括与对一种硅流入转运蛋白或其一种片段进行编码的一个核酸序列基本上一致的一种异源多核苷酸。该多核苷酸可以包括与以下序列基本上一致的(例如至少 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%、或 100% — 致性)一个核酸序列(a)选自下组的一个核酸序列，该组的组成为SEQ ID NO :55、56、57、 58、以及59，(b)对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为 SEQ IDN0:62、63、64、65、以及66，或(c)其一种片段。由该异源多核苷酸编码的多肽在表达时可以增加或能够增加进入该植物内至少一个组织或细胞(如根、茎、或叶细胞)的硅转运。该植物、植物组织、或种子可以进一步包括一种第二异源序列。该第二多核苷酸可以是硅流入转运蛋白(例如与以下序列基本上一致的一种多核苷酸(a)选自下组的一个核酸序列，该组的组成为SEQ ID NO :3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124-919、SEQ ID NO :22 的核苷酸 146-694、以及 SEQ ID NO :32 的核苷酸 124-1014， (b)对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为SEQ ID NO 5, 6、34-38、51、54、60、61、以及68，或(c)其一种片段)。在某些实施方案中，用一种第三异源多核苷酸转化该植物，例如对一种硅流出转运蛋白进行编码的一种多核苷酸。在其他的实施方案中，该第二异源多核苷酸编码硅流出转运蛋白。对一种硅流出转运蛋白进行编码的多核苷酸可以是与以下序列基本上一致的一种多核苷酸(a)选自下组的一个核酸序列， 其组成为SEQ ID NO :28、四、71、以及73，(b)对选自下组的一种氨基酸序列进行编码的一个核酸序列，该组的组成为=SEQ ID N0:30、31、72、以及74，或(c)其一种片段。本发明的特征还在于用于生成如上说明的这些植物、植物组织、或种子的任何一种的方法。在一方面，该方法包括(a)提供一种第一载体，该载体包括与一个核酸序列基本上一致的一种多核苷酸，该核酸序列对一种硅流入转运蛋白或其一种片段(例如如上说明的那些的任何一种)进行编码；(b)用该载体对一种植物细胞(例如一种大豆细胞或来自在此所说明的任何一种植物的一种细胞)进行转化；以及(c)从该细胞生长一种植物，其中该植物表达该多核苷酸，由此生成具有增加的硅吸收的一种植物。可以使用在本领域中已知的任何一种方法进行该转化(例如在此所说明的任何一种方法)。该载体可以包括一种第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括与一种硅流出转运蛋白(例如如上说明的那些的任何一种)或其一种片段基本上一致的一个核酸序列。在另一方面，本发明的特征还在于生成具有增加的硅转运的一种植物、植物组织、 或植物种子的一种方法。该方法包括(a)提供一种第一载体，该第一载体包括与对一种硅转运蛋白或其一种片段(例如一种流入转运蛋白(例如一种SIITl或SIIT2)或一种流出转运蛋白，例如以上所说明的那些的任何一种)进行编码的一个核酸序列基本上一致的一种多核苷酸；(b)用该载体对一种植物细胞(例如一种大豆细胞或来自在此所说明的任何一种植物的细胞)进行转化；以及(c)从该细胞生长一种植物，其中该植物表达该多核苷酸， 由此生成具有增加的硅转运的一种植物。该载体可以进一步包括一种第二多核苷酸，该第二多核苷酸与对一种硅流入转运蛋白(例如以上所说明的那些的任何一个)或其一种片段进行编码的一个核酸基本上一致。在这两种上述方法的任何一个中，该第二多核苷酸可以可替代地包含在一种第二载体中，将该第二载体转化为第一载体(例如同时地或顺序地)。在这上述的两种方法的任何一个中，该方法可以进一步包括步骤(d)从该植物生成种子或从该植物收获至少一个组织。在一个实施方案中，该第一多核苷酸是一种硅流出转运蛋白并且该第二多核苷酸是一种硅流入转运蛋白。在针对植物、植物组织、以及种子或相关方法的方面中，该植物组织可以是、例如 根、果实、胚珠、雄性组织、种子、珠被、块茎、柄、果皮、叶、柱头、花粉、花药、花瓣、萼片、花梗、长角果、以及茎。种子组织包括胚、胚乳、以及种皮。其中“基本上纯的多核苷酸”意思是指一个核酸(例如、一种DNA或一种RNA分子)，该核酸不含有在从中得到本发明的核酸分子的生物体的天然发生的基因组中位于该基因两侧的这些基因。因此，该术语包括，例如结合进入一种载体；进入一种自主复制质粒或者病毒；或进入一种原核生物或真核生物的基因组DNA的一种重组DNA ；或作为一种独立于其他序列的单独的分子存在(例如一种cDNA或由PCR或限制性核酸内切酶消化生成的一种基因组或cDNA片段)的一种重组DNA。此外，该术语包括一种RNA分子，该RNA分子是从一种DNA分子转录的；连同一种重组DNA，该重组DNA是对额外的多肽序列进行编码的一种杂合基因的一部分。其中“基本上纯的多肽”意思是指已经与自然伴随它的组分分离的一种多肽。典型地，当以重量计，该多肽至少是30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或甚至99%不含有这些蛋白以及与这些蛋白天然结合的天然发生的有机分子的时，该多肽基本上是纯的。 一种基本上纯的多肽可以通过从一种天然来源提取，通过在正常不表达该蛋白的一种细胞中表达一种重组核酸，或通过化学合成而获得。其中“转化的细胞”意思是指通过重组DNA技术已经将一种DNA分子(例如对一种硅流入或流出转运蛋白进行编码的一种DNA分子或在此所说明的这些核酸的任何一种) 的引入其中(或引入其一种祖细胞中)的一种细胞。其中一种多核苷酸或氨基酸序列的“片段”意思是指一种较长序列(例如在此所说明的一种序列)的任何一种的至少10、15、20、25、30、50、75、100、250、300、400、或500个
连续核酸或氨基酸。当用于氨基酸序列时，术语“基本上一致”表示多肽的一种特征，其中该肽包括与另一种序列(例如图ι这些序列的任何一种或其一种片段)具有至少eo^jo^^so^、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 序列一致性的一种序列。当用于核酸序列时，术语“基本上一致”表示多核苷酸序列的一种特征，其中该多核苷酸包括与一个参照相比(例如在此所说明的这些序列的任何一种)具有至少50%，优选地 50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 一致性的一种序列。核苷酸序列基本上一致的另一个指标是是否两个分子在严格条件下彼此杂交。严格条件是序列依赖性的并且在不同的情况下将是不同的。总体上，选择的严格条件是约5°C至约20°C，通常约10°C至约15°C，低于在一个定义的离子强度和pH下对于该特异的序列的热解链温度(Tm)。Tm是50%的目标序列杂交到一个匹配的探针上的温度 (在定义的离子强度以及PH下)。典型地，严格条件将是那些，其中在pH7下该盐浓度是约 0. 02摩尔并且该温度是至少约60°C。例如在一种标准的DNA杂交步骤中，严格条件将包括在42°C下在6x SSC中的一次初始洗涤，随后在至少约55°C的温度下(典型地约60°C并且经常地约65°C )在0. h SSC中的进行一次或多次额外的洗涤。为了本发明的目的当所述核苷酸序列编码基本上一致的多肽和/或蛋白时，核苷酸序列也是基本上一致的。因此，当一个核酸序列编码与一种第二核酸序列基本上相同的多肽时，这两个核酸序列基本上是一致的即使由于遗传密码允许的简并性在严格条件下它们可能不会杂交(参见Darnell等人的Molecular Cell Biology，第二版kientific American Books W. H. Freemanand Company New York，1990 对于密码子简并性禾口遗传密码的一种解释)。蛋白质的纯度或者均一性可以通过本领域中众所周知的多种方式表示，例如一种蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后通过染色显像。为了某些目的，高分辨率可能是需要的并且可以使用HPLC或一种类似的方法用于纯化。其中“增加(进入或离开一种细胞的)硅转运”的一种多肽意思是指一种多肽， 在那种细胞中该多肽的表达导致与缺乏该多肽的一种细胞相比较，穿过该细胞膜(例如进入或离开该细胞)的硅或锗转运速率增加(例如至少5%、10%、25%、50%、100%、200%、 300%、500%、1，000%、5，000%、或10，000% ),但基本上不破坏该细胞膜或以一种非特异性方式增加其他分子(例如甘油)的转运。一种“硅流入转运蛋白”或一种“硅流出转运蛋白”是对应地能够增加进入或离开一种细胞的硅转运一种多肽。本发明的其他特征与优点从以下详细说明、附图
以及权利要求中将会是清楚的。附图简要说明图Ia-Ivvv是在此所说明的序列(SEQ ID NO: 1-74)的列表。图2是预测的SIITl与SIIT2的氨基酸序列的一个比对。一致的氨基酸被标记为黑色；相似的氨基酸被标记为灰色。图3是预测的SIITl的氨基酸序列的一个比对。一致的氨基酸被标记为黑色；相似的氨基酸被标记为灰色。图4是一组图示，显示在一种无Si或具有1.7mM Si的溶液中孵育0、15、30、或60 分钟后在卵母细胞中量化的硅浓度。用水注入对照卵母细胞。对于水稻和小麦SIITl进行测试检测它们转运Si的能力。图5是一组图示，显示在一种无Si或具有1.7mM Si的溶液中孵育0、15、30、或 60分钟后在卵母细胞中量化的硅浓度。用水注入对照卵母细胞。“Lsi-”表示用突变的 SIITlcRNA注入的卵母细胞，并且“Lsi+”表示用野生型SIITlcRNA注入的卵母细胞。详细说明木贼与禾本科植物比如小麦、燕麦、高粱、以及大麦已知是硅的高度积聚植物。具体地说已知木贼非常有效地积聚硅，并且硅化合物可以占木贼干重的15%。因此我们猜测这些植物，由于它们的高的硅含量，将可能有效地转运硅，例如能够使高浓度的硅在该植物中积聚，能够快速转运硅、或两者都能够。因此，这些转运蛋白可以用于在一种异源的细胞中(例如在正常时具有较低的硅吸收或转运的一种植物中)通过表达在此所说明的一种转运蛋白，增加硅吸收。因为在植物中增加的硅含量与对生物性以及非生物性胁迫二者的增强的耐受性相关联，在一种植物中这些转运蛋白的表达可以增强对胁迫的耐受性。当由豆薯层锈菌真菌所引起的大豆锈病对大豆作物引起显著损害时，这样一种方法在大豆中可能是特别有用的。因此，本发明的特征在于具有与在此识别的这些硅转运蛋白序列一致的多核苷酸和多肽，包含这类多核苷酸的载体、细胞、以及植物(例如大豆)，以及用于制造这类植物的方法。表达硅转运蛋白的植物可以显示对真菌(例如锈菌)增强的耐受性。植物中的硅硅(Si)是以硅酸的形式通过根系吸收的，其中它可以以聚合硅的形式最终积聚在这些植物的嫩枝和叶中。然而，植物在它们吸收硅的能力上有很大的不同，由此引起它们从Si摄食受益的能力上的可变性。在接近500个植物物种的一项调查中，将这些植物按照它们的硅积聚情况分成三组1)高的Si积聚植物，包括禾本科(草)；2)中等积聚植物，包括葫芦科；以及幻低积聚植物，包括大多数其他植物物种(对于一个汇总，参见Ma and Takahashi， Soil， Fertilizer, and Plant Silicon Research in Japan， AmsterdamrElsevier Science, 2002)。例如，当在包含45ppm SiO2(在pH 6. 0下在溶液中)的土壤中生长时，禾本科植物例如燕麦、黑麦、以及黑麦草，包含2. 04%、2.41%、以及2. 34%的 SiO20相比之下，绛三叶草、豌豆、以及芥菜，在相同的土壤中对应地包含0. 12%,0. 25%、以及 0. 15% 的 SiO2 (Jones et al, Advances inAgronomy，107-149，1967)。在硅积聚上的差异已经归结于根吸收Si的能力，由此植物将具有以下三种吸收方式的一种主动的、被动的、 或拒绝吸收。硅是地球表面上最丰富的元素之一，但是其在植物生长中的本质还没有被清楚地证实(Epstein, Silicon in Agriculture. Datnoff et al. , eds. New York :Elsevier Science ；2001 :1-15 ；Epstein, Proc Natl Acad Sci USA 91 :11-17,1994 ；Epstein, Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol50 :641_664，1999)。虽然其在植物中营养作用似乎有限，有越来越多的证据表明硅吸收在保护使免受生物性以及非生物性胁迫中起一种重要的作用。许多报告已经隐含在营养缺乏或过剩的情况中硅改善植物生长。硅施肥也已经与植物对疾病的增强的耐受性相关联，这些疾病包括发生在小麦、大麦、玫瑰、黄瓜、甜瓜、西葫芦、南瓜、葡萄、以及蒲公英上的白粉病病原体，以及其他疾病(例如发生在水稻上的稻瘟病(灰梨孢菌)和褐斑病(稻平脐蠕孢菌)，发生在黄瓜上的由终极腐霉菌和瓜果腐霉菌所引起的灰葡萄孢、蔓枯病(Didymella bryoniae)、镰孢菌枯萎病(Fusarium wilt)、以及根腐病)。在水稻中已经识别了三种硅转运蛋白(Ma et al.，Nature 440 :688-691，2006 ； Ma et al.，Nature 448 :209-212,2007 ；Yamaji et al, The Plant Cell 20 :1381-1389, 2008)，包括两种硅流入转运蛋白(SIIT1、也称为Lsil，SEQ ID NO :3和5，以及SIIT2、也称为 Lsi6;SEQ ID NO :55 禾口 62)和一种 Si 流出转运蛋白(SIET1、也称为 Lsi2 ;SEQ ID NO :28 和30)。预测该流入转运蛋白SIITl和SIIT2是类似于水通道蛋白aquaporins的膜蛋白。这些蛋白属于NIP亚家族(Nod26-样主要内在蛋白)。该通道由六个跨膜区段(TM)、两个亲水性的环(在TM3与TM4之间的HL3 ；在TM4与TM5之间的HL4)、以及两个Asn-Pro-Ala (NPA) 基序，在aquaporins中保守的一种安排组成。一种孔结构和可能决定选择性的水渗透性的收缩是用HL3与在细胞外侧的该第二 NPA结构域(NPA2)以及用HL4与在该细胞质膜中该第一 NPA结构域(NPAl)装配的。该NPA盒子对于aquaporins的三维结构的正确装配可能是重要的，因为在NPA盒子附近具有突变的这类蛋白可能被不适当地折叠。该SIITl转运蛋白的表达似乎是位于具有通过硅水平调节的一种组成型表达的根中。该转运蛋白SIIT2 似乎是在该根尖中以及在叶鞘和叶片的木质部薄壁组织细胞中表达的。预测编码具有11个跨膜结构域的一种膜阴离子转运蛋白的水稻的硅流出基因与该硅流入转运蛋白SIITl没有相似性。SIETl是一种有活性的流出转运蛋白。在根中SIETl 的表达似乎遵循SIITl的一样的模式，但是位于外胚层和内胚层细胞的近端侧，然而SIITl 是位于根细胞的远端侧。SIIT2也显示在木质部薄壁组织细胞中在面对该木质部维管侧的极性的定位。SIIT2被认为涉及Si从该木质部转运出Si并且转运进入这些叶子中。多核苷酸我们已经从小麦、燕麦、大麦、高粱、以及木贼中识别并且克隆了硅转运蛋白。因此，本发明的特征在于具有与在此所说明的这些多核苷酸的任何一种基本上一致的多核苷酸、或这类多核苷酸的片段。在某些实施方案中，这些多核苷酸可以编码有功能的硅转运蛋白多肽(例如当在一种细胞中表达时能够增加硅流入或流出的多肽)。本发明的示例性的多核苷酸的识别在以下更详细地进行说明。本发明的特征还在于在此所说明的这些多核苷酸的片段。这类片段也可以编码有功能的硅转运蛋白多肽。较短的片段可以被用作为引物、或可以编码抗原性的多肽序列。片段可以包括该转运蛋白的跨膜区段、或亲水性的环。在植物中硅流入转运蛋白的识别通过BLAST搜索，我们已经在小麦、燕麦、大麦、以及木贼中识别了硅转运蛋白序列。使用小麦EST数据库，我们在小麦中识别了一种转运蛋白序列并且称这种序列为SIITl 小麦Si-转运基因(SEQ ID NO :2)。将该小麦cDNA、编码序列(SEQ ID N0:4)、以及该四6 个氨基酸的小麦多肽序列(SEQ ID NO 6)与对应的水稻序列(SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 5)进行比较揭示对应地70 %、84. 2 %、以及82 %的一致性。然后我们克隆了来自从水栽培养回收的小麦植物栽培品种HY644的一种SIITl基因。将根冷冻在液氮中，使用一种研钵压碎并且使用来自QIAGen的一种RNA纯化试剂盒提取总RNA并且储存在-80°C。使用逆转录酶(Superscript III，Invitrogen)用oligodT引物制备总cDNA。弓丨物 IF (TCCCTCCTCACCTCCTCAAGAAG (SEQ ID NO :7))以及 2R(AGCTTGAAGGAGGAGAGCTTCTG(SEQ ID NO :8))用于在小麦 cDNA 制品中通过 PCR 证实该转运基因的存在。在94°C下进行PCR持续120秒；随后94°C的30个循环持续30秒；62°C持续30秒；以及72°C 90秒；随后72°C 10分钟。IOOng的小麦cDNA与0. 2 μ M的每种引物一起使用。这种PCR反应扩增一种700bp片段，然后将它测序(SEQ ID NO 9)并且与该数据库EST序列进行比较。使用ClustalW程序SEQ ID NO 9的序列分析表明在659bp重叠的序列上有98. 9%的一致性。这些差异很可能通过用于获得在该数据库中SEQ ID NO :4的栽培品种与在我们的实验中使用的该栽培品种的种类来解释。然后我们设计了两个额外的反向引物3R(CGAAGATGGACGTAATGCAAACC (SEQ IDNO 10))以及m(CGCCCAGTAGAACGGAACCT(SEQ ID NO :11))以便识别在其他植物物种中的硅转运蛋白同系物。从包括Torka小麦栽培品种、ACCA大麦栽培品种、Rigodon燕麦栽培品种、以及木贼的植物中获得总cDNA。将植物生长在一个培养箱中在一个充满ftOmix PGX 生长培养基(Premier Horticulture，Riviere-du-Loup，Qi^bec，加拿大)6cm 的塑料盆中。 生长之后，将根回收、在蒸馏水中洗涤从而去除所有痕量的!fornix底物，在液氮中冷冻、 并且使用一种研钵压碎。使用来自QIAGen的一种RNA纯化试剂盒提取总RNA。使用来自 Invitrogen的Superscripts逆转录酶使用一种oligodT引物获得总cDNA。将所获得的 cDNA保存在-20°C下。使用表1所示的这些引物对在Torka小麦栽培品种、ACCA大麦栽培品种、Rigodon燕麦栽培品种、以及木贼中检出一种硅-转运基因的存在。表1:使用的引物
权利要求
1.一种基本上纯的多核苷酸，包括与选自下组的一种核苷酸序列具有至少85%—致性的一个核酸序列，该组的组成为SEQ ID NO :15、4、9、12、13、14、33、50、52、67、SEQ ID NO 21的核苷酸124-919、SEQ ID NO 22的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO 32的核苷酸 124-1014。
2.—种基本上纯的多核苷酸，包括与SEQ ID NO :56的核苷酸序列具有至少95%的一致性、或与SEQ ID N0:58或SEQ ID NO :59的核苷酸序列具有至少90%—致性的一个核酸序列。
3.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其中在一种细胞中由所述多核苷酸编码的该多肽的表达能够增加进入所述细胞的硅转运。
4.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述一致性是至少95%。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其中所述一致性是至少99%。
6.如权利要求5所述的多核苷酸，包括选自下组的一种核苷酸序列，该组的组成为 SEQID NO :4、9、12、13、14、15、33、50、52、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124_919、SEQID NO :22 的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO 32的核苷酸124-1014。
7.如权利要求5所述的多核苷酸，包括选自下组的一种核苷酸序列，该组的组成为 SEQID NO :56、58、以及 59。
8.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸在长度上小于20kB。
9.如权利要求1或2所述的多核苷酸，该多核苷酸被可操作地连接至一种启动子上。
10.如权利要求9所述的多核苷酸，其中所述启动子能够在一种植物细胞中表达。
11.如权利要求10所述的多核苷酸，其中所述植物细胞是一种根细胞。
12.—种载体，包括如权利要求9所述的多核苷酸。
13.如权利要求12所述的载体，进一步包括对一种硅流出转运蛋白进行编码的一种第二多核苷酸。
14.如权利要求13所述的载体，其中所述第二多核苷酸与选自下组的一个核酸序列具有至少80%的一致性，该组的组成为SEQ ID NO :28、29、71、以及73。
15.一种细胞，包括如权利要求12所述的载体。
16.如权利要求15所述的细胞，其中所述细胞是一种植物细胞。
17.如权利要求16所述的细胞，其中所述植物细胞是一种大豆植物细胞。
18.—种种子，包括如权利要求15所述的细胞。
19.一种基本上纯的多肽，该多肽由如权利要求1或2所述的多核苷酸编码。
20.—种基本上纯的多核苷酸，包括与选自下组的一种核苷酸序列具有至少80%—致性的一个核酸序列，该组的组成为SEQ ID N0d9、71、以及73。
21.如权利要求20所述的多核苷酸，其中在一种细胞中由所述多核苷酸编码的该多肽的表达能够增加离开所述细胞的硅转运。
22.如权利要求20所述的多核苷酸，其中所述一致性是至少95%。
23.如权利要求22所述的多核苷酸，其中所述一致性是至少99%。
24.如权利要求23所述的多核苷酸，包括选自下组的一种核苷酸序列，该组的组成为 SEQ ID NO :29、71、以及 73。
25.如权利要求20所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸在长度上小于20kB。
26.如权利要求20所述的多核苷酸，该多核苷酸被可操作地连接至一种启动子上。
27.如权利要求沈所述的多核苷酸，其中所述启动子能够在一种植物细胞中表达。
28.如权利要求27所述的多核苷酸，其中所述植物细胞是一种根细胞。
29.—种载体，包括如权利要求沈所述的多核苷酸。
30.如权利要求四所述的载体，进一步包括一种第二多核苷酸，该第二多核苷酸与选自下组的一个核酸序列具有至少80% —致性，该组的组成为SEQ ID N0:3、4、9、12、13、14、 15、33、50、52、53、55、56、57、58、59、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124-919、SEQ ID NO :22 的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO :32的核苷酸124-1014。
31.一种细胞，包括如权利要求四所述的载体。
32.如权利要求31所述的细胞，其中所述细胞是一种植物细胞。
33.如权利要求32所述的细胞，其中所述植物细胞是一种大豆细胞。
34.一种种子，该种子包括如权利要求31所述的细胞。
35.一种基本上纯的多肽，该多肽由如权利要求20所述的多核苷酸编码。
36.一种植物，包括一种异源的多核苷酸，该多核苷酸包括与选自下组的一个核酸序列具有至少85%—致性的一个核酸序列，该组的组成为=SEQ ID NO :4、9、12、13、14、15、33、 50、52、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124_919、SEQ ID NO :22 的核苷酸 146-694、以及 SEQ ID NO 32 的核苷酸 124-1014。
37.如权利要求36所述的植物，其中所述一致性是至少95%。
38.如权利要求37所述的植物，其中所述一致性是至少99%。
39.如权利要求38所述的植物，其中所述多核苷酸包括选自下组的一个核酸序列，该组的组成为:SEQ ID NO :4、9、12、13、14、15、33、50、52、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124-919、 SEQ ID NO 22 的核苷酸 146-694、以及 SEQ ID NO :32 的核苷酸 124-1014。
40.如权利要求36所述的植物，其中由所述异源的多核苷酸编码的多肽在表达时增加了进入所述植物内至少一种组织之中的硅转运。
41.如权利要求36所述的植物，进一步包括一种第二异源序列，该第二异源序列与对一种硅流出转运蛋白或一种第二硅流入转运蛋白进行编码的一种多核苷酸具有至少80% 的一致性。
42.如权利要求41所述的植物，其中所述第二序列与选自下组的至少一种序列具有至少 80% 的一致性，该组的组成为=SEQ ID NO :28、29、71、73、55、56、57、58、以及 59。
43.如权利要求36所述的植物，其中所述植物是一种大豆植物。
44.一种植物，包括一种异源的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与选自下组的一个核酸序列具有至少80%—致性，该组的组成为SEQ ID N0J9、71、以及73。
45.如权利要求44所述的植物，其中所述一致性是至少95%。
46.如权利要求45所述的植物，其中所述一致性是至少99%。
47.如权利要求46所述的植物，其中所述多核苷酸包括选自下组的一个核酸序列，该组的组成为=SEQ ID N0』9、71、以及73。
48.如权利要求44所述的植物，其中由所述异源的多核苷酸编码的多肽在表达时增加了离开所述植物内至少一种组织的硅转运。
49.如权利要求44所述的植物，进一步包括一种第二异源序列，该第二异源序列与对一种硅流入转运蛋白进行编码的一个核酸序列具有至少80 % 一致性。
50.如权利要求49所述的植物，其中所述第二异源的序列与选自下组的至少一种序列具有至少 80% 的一致性，该组的组成为=SEQ ID NO :3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、55、 56、57、58、59、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124-919,SEQ ID NO 22 的核苷酸 146-694、以及 SEQ ID NO 32 的核苷酸 124-1014。
51.如权利要求43所述的植物，其中所述植物是一种大豆植物。
52.一种植物，包括一种异源的多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID N0:56、58、或59的一个核酸序列具有至少90% —致性。
53.如权利要求52所述的植物，其中所述多核苷酸包括SEQID NO :56、58、或59的序列。
54.如权利要求52所述的植物，其中所述植物包括对一种硅流出转运蛋白进行编码的一种第二异源的多核苷酸。
55.如权利要求M所述的植物，其中所述第二异源的多核苷酸与选自下组的一种序列具有至少80%的序列一致性，该组的组成为SEQ ID N0:28、29、71、以及73。
56.如权利要求52所述的植物，其中所述植物包括对一种硅流入转运蛋白进行编码的一种第二异源的多核苷酸。
57.如权利要求56所述的植物，其中所述第二异源的多核苷酸与选自下组的至少一种序列具有至少80%的序列一致性，该组的组成为=SEQ ID NO :3、4、9、12、13、14、15、33、50、 52、53、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124_919、SEQ ID NO :22 的核苷酸 146-694、以及 SEQ ID NO 32 的核苷酸 124-1014。
58.如权利要求56所述的植物，其中所述植物包括对一种硅流出转运蛋白进行编码的一种第三异源的多核苷酸。
59.如权利要求58所述的植物，其中所述第三异源的多核苷酸与选自下组的一种序列具有至少80%的一致性，该组的组成为SEQ ID NO :28、29、71、以及73。
60.一种生成具有增加的硅吸收的植物的方法，所述方法包括(a)提供一种包括以下多核苷酸的第一载体，该多核苷酸包括与选自下组的一种序列具有至少85%—致性的一个核酸序列，该组的组成为=SEQ ID NO :4、9、12、13、14、15、33、 50、52、56、58、59、67、SEQ ID NO 21 的核苷酸 124-919、SEQ ID NO 22 的核苷酸 146-694、 以及 SEQ ID NO 32 的核苷酸 124-1014 ；(b)用所述载体转化一种植物细胞；并且(c)从所述细胞生长一种植物，其中所述植物表达所述多核苷酸，由此生成一种具有增加的硅吸收的植物。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述载体进一步包括对一种硅流出转运蛋白进行编码的一个第二序列。
62.如权利要求60所述的方法，其中用一种第二载体与所述第一载体同时地或顺序地将所述细胞进一步转化，该第二载体包括对一种硅流出转运蛋白进行编码的一个第二序列。
63.如权利要求61或62所述的方法，其中所述第二序列与选自下组的一种序列具有至少80%的一致性，该组的组成为SEQ ID NO :28、29、71、以及73。
64.如权利要求60所述的方法，其中所述植物细胞是一种大豆细胞。
65.一种生成具有增加的硅转运的植物的方法，所述方法包括(a)提供包括以下多核苷酸的一种第一载体，该多核苷酸包括与SEQID N0J9、71、以及73的一种核苷酸序列具有至少80% —致性的一个核酸序列；(b)用所述载体转化一种植物细胞；并且(c)从所述细胞生长一种植物，其中所述植物表达所述多核苷酸，由此生成一种具有增加的硅转运的植物。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述载体进一步包括对一种硅流入转运蛋白进行编码的一个第二序列。
67.如权利要求65所述的方法，其中将所述植物细胞用一种第二载体与所述第一载体同时地或顺序地进一步转化，该第二载体包括与一种硅流入转运蛋白具有至少80 % 一致性的一个第二序列。
68.如权利要求66或67所述的方法，其中所述第二序列选自下组，其组成为SEQ IDNO :3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、55、56、57、58、59、67、SEQ ID NO 21 的核苷酸 124-919、SEQ ID NO 22 的核苷酸 146-694、以及 SEQ ID NO 32 的核苷酸 124-1014。
69.如权利要求65所述的方法，其中所述植物细胞是一种大豆细胞。
全文摘要
基于我们在已知有效吸收硅的植物(包括小麦、木贼、燕麦、高粱、以及大麦)中对硅流入和流出转运蛋白基因的识别，本发明的特征在于对硅转运蛋白进行编码的多核苷酸；包括这类多核苷酸的载体、细胞、以及植物；以及用于制造这类植物的方法。本发明的特征还在于硅转运蛋白多肽以及它们的片段。表达异源的硅转运蛋白的植物可以显示增加的硅吸收以及对生物性和非生物性胁迫的增强的耐受性二者。具体而言，表达硅转运蛋白的植物例如大豆可以显示对病原体例如锈菌的增强的耐受性。
文档编号C12N15/29GK102177238SQ200980116389
公开日2011年9月7日 申请日期2009年3月24日 优先权日2008年3月24日
发明者卡洛琳·格莱戈瓦, 理查德·贝朗葛, 维尔弗雷德·雷穆斯-博雷尔 申请人:拉瓦尔大学