核酸的制备的制作方法

专利名称：核酸的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码靶蛋白的核酸的制备方法和由此能够获得的靶蛋白，所述靶蛋白 包括诸如核酸加工酶等酶，特别是逆转录酶。
背景技术：
蛋白进化是用于对来自大型文库的蛋白进行选择和定向进化的已知技术。选择的 基本原则是确保特定表型(蛋白)和编码其的基因型之间存在联系形式。可以以三种不同 的方式实现该表型-基因型联系形式·共价连接诸如mRNA展示，和在一定程度上噬菌体展示、细菌展示、酵母展示等， 利用亲和性相互作用的非共价连接。实例是核糖体展示、CIS展示、质粒展示等，·区室化(compartmentalization)例如体外区室化(IVC)、区室化自我复制 (CSR)、简单细菌筛选、高通量筛选等。如上述段落所指出，共价型表型-基因型连接的一个实例可以使用mRNA展示而实 现。根据Roberts和&OStak(1997)所述，mRNA和其编码的肽或蛋白之间的共价融合可以 通过合成的mRNA的体外翻译来产生，所述mRNA在其3 ‘末端处携带嘌呤霉素，一种肽基受 体抗生素。表型和基因型之间的非共价连接可以通过核糖体展示而实现。在核糖体展示中， 使包括一种或多种编码靶蛋白的RNA在内的RNA的阵列通过体外翻译系统形成核糖体、 mRNA和与tRNA偶联的蛋白的非共价三元复合物。三元复合物的这种阵列必须是稳定的。 因此，体外翻译过程中形成的各三元复合物使用末端缺乏终止密码子的mRNA。所述三元复 合物在低温)和高浓度的镁中(50mM)进一步得到稳定。在稳定的复合物中表型和基 因型之间的连接得以保持。随后进行选择步骤，由此基于仍附着到三元复合物的蛋白的性 质选择靶蛋白。然后可以使所选择的三元复合物解离，通过RT-PCR扩增与靶蛋白关连的 mRNA。通常，核糖体展示可成功地应用于肽(Mattheakis等，1994 ；Matsuura和 Pluckthun, 2003)和蛋白(Hanes 和 Pluckthun，1997 ；He 和 Taussig，1997 ；Irving等，2001) 的选择，所述肽和蛋白与不同的靶结合。在某些情况下，可以使用核糖体展示来选择酶促活 性、使用自杀性抑制剂(Amstutz等，200 或活性位点配体(Takahashi等，200 进行蛋白 的亲和选择。在体外区室化(IVC)中，通过对油包水乳液中的基因进行体外区室化而实现表型 和基因型联系形式。计算用于制备乳液的基因的数量，使得大多数水区室含有不超过一个 基因。使区室化的基因转录和翻译。然后评估所合成蛋白的活性。随后基于蛋白活性进行 的选择，可以扩增编码具有所需性质的活性蛋白的DNA。大多数IVC应用中所用的水滴的 尺寸为2 μ m 3 μ m，反应体积为 5飞升，并且相对于每Iml乳液，有 101°个油包水区 室(50 μ 1水相)。IVC选择系统的首个成功实例基于靶特异性DNA甲基化活性(Tawfik和 Griffiths，1998)。将HaeIII甲基转移酶的基因区室化、转录和翻译。在辅因子存在下，体外合成的甲基转移酶能够将其自身的DNA甲基化。由于甲基化DNA(反应产物)抗HaeIII 限制性内切核酸酶的消化，从IO7倍过量的其它DNA分子中选出了编码甲基转移酶的基因。迄今为止已经设计和实现了更多改进的IVC。进行IVC选择的最简单方式是使用 DNA修饰酶，特别是DNA甲基转移酶(Lee等，2002 ;Cohen等，2004)。类似的实验策略用于 选择限制性内切核酸酶i^okl的活性变体(Doi等，2004)。对区室化的编码活性限制性内切 核酸酶的DNA进行消化，并通过随后导入生物素-dUTP和与链亲和素结合来选择。对DNA聚合酶的进化应用不同的IVC选择策略((ihadessy等，2001 ；(ihadessy等， 2004 ;0ng等，2006)。这种新的选择方法基于编码活性DNA聚合酶的基因的‘区室化自我 复制’(CSR)。与其中目的蛋白原位表达的常用IVC相反，CSR通过表达嗜热性DNA聚合酶 的细菌细胞的区室化进行。对再悬浮于补充有引物和dNTP的PCR缓冲液中的细胞进行乳 化，产生尺寸为 15μπι的区室。每个微小水滴充当分离的PCR区室。起始PCR变性步骤 期间，使细菌细胞破碎，将所表达的嗜热性DNA聚合酶和其编码基因释放到反应混合物中， 使自我复制得以进行，同时其它细菌蛋白由于高温而变性。IVC的改进是使用水包油包水双乳液。可以对被油层包围的微小水滴用FACS以> IO4个变体每秒的速率进行分析和分选(Bemath等，2004 ；Mastrobattista等，2005)。还可以通过IVC对用于结合的蛋白进行选择。油包水区室中表达的目的蛋白与编 码其的基因共价偶联(Bertschinger和Neri，2004)或非共价偶联(Doi和Yanagawa，1999 ； Yonezawa 等，2003 ； Sepp 禾口 Choo，2005)。已知的IVC的其它应用有包埋在区室中的微珠用作蛋白和基因偶联的中间体。附 着在微珠上的单基因在微小水滴中进行转录和翻译。新合成的蛋白被捕获到反应区室内的 相同微珠上。将乳液破碎后，可以将分离的珠进一步用于亲和选择(kpp等，200 。通常使 用有机溶剂(己烷、醚、氯仿)破碎乳液，但这也会使得展示在所述珠上的某些酶的活性降 低，限制了该技术的应用。为了选择催化活性，可以对微珠简单地进行洗涤，使其再悬浮于 不同的反应缓冲液中，并通过第二乳化步骤再次进行区室化(Griffiths和Tawfik，2003)。 然而有时刚性酶-珠-基因复合物(由于空间位阻和酶移动性限制)不能满足基本的反应 要求，并且所附着的酶的活性可能低于游离酶的活性。另外，由于必须使用许多其它成分 (即，亲和标签、抗体和珠)，所述方法在技术上是复杂的。对IVC中所用乳液的组成进行设计，从而确保水区室的稳定性和mRNA体外转录以 及随后靶蛋白翻译的有效性。体外进化具有许多待改进的目标。一些目的蛋白和酶是稳健 的勤奋工作者，并且在不同的缓冲液中，特别在IVC所用的反应混合物中具有足够的活性。 然而，存在许多复杂的酶，这些酶仅在经优化的条件下或特定条件下才起作用。除此之外， 体外进化的第一定律称-“进化所要选择的(you will evolve whatyou are selecting for) ”。这就是说，转录/翻译反应混合物中进化和优化的酶会在该特定混合物中良好地起 作用，并且很有可能在其自身缓冲液中表现差的多。在某些情况下，酶工作条件与区室中用 于蛋白表达的体外转录和翻译混合物不相容。部分解决方案是用于将不同溶质运送到乳液 区室中的纳米微滴递送系统(Bernath等，2005)。使用微流控装置可以完成使用油包水区 室的甚至更为精密复杂的操作。可以以高达10000个水性微滴每秒钟的速率制备高度单分 散的单乳液或双乳液(Thorsen等，2001 ；Okushima等，2004)。可以将所产生的水区室运送 到微流控通道(microf luidic channel)中，使其融合、再分和分选(Song等，2003 ；Link等，2006)。但是区室中的全缓冲液交换仍然是个问题。逆转录酶是用于从mRNA靶合成cDNA的非常重要的商业化酶。为了改善逆转录酶 的性质，已经进行了大量研究。然而迄今为止适合于逆转录酶体外进化的合适的工作选择 系统还是未知的。几乎所有的改进和逆转录酶的突变体的选择都是使用高通量筛选和合理 设计而进行的。核糖体展示(RD)和体外区室化(IVC)都不能用于全活性逆转录酶的选择。用于 核糖体展示的三元复合物在进行逆转录选择所需的较高温度下通常是不稳定的，并且因而 会失去表型和基因型之间的连接。虽然使用合成的体外翻译提取物WakoPURE可以产生用 于核糖体展示的相对稳定的三元复合物(Matsuura等，2007)，但是固定在核糖体和mRNA上 的体外翻译的逆转录酶在全长cDNA的合成过程中会遭遇到明显的空间位阻。还存在一种 可能性，即固定的酶会反式以及顺式方式起作用，这会同样与蛋白进化策略不相容，原因在 于不能保留表型-基因型连接。IVC通常使用DNA作为遗传材料。体外的mRNA转录和靶蛋白翻译在DNA的存在下 于空间上分离的经乳化水区室中进行。在体外进化逆转录酶的情况下，编码DNA序列的存 在消除了选择逆转录酶活性的主要先决条件-必须从头合成cDNA。换言之，更好的逆转录 酶变体的选择是基于酶从mRNA合成其自身编码cDNA的能力。新合成的cDNA必须通过PCR 扩增，因此cDNA应该是反应中DNA的唯一来源。用于IVC选择的DNA会与cDNA —起扩增， 省略了基础选择方案。体外区室化的更复杂的变体方式，例如使用包埋在水区室中的微珠(kpp等， 2002 ；Griffiths和Tawfik，2003)，使得反应缓冲液完全交换。在该方法中，利用微珠实现 表型-基因型联系，产生刚性选择单元mRNA-微珠-蛋白，在逆转录酶选择的情况下，该刚 性选择单元mRNA-微珠-蛋白同样可以引起空间位阻，结果使得cDNA的合成效率差。使用噬菌体展示技术的改进方法选择能够合成 300个核苷酸长的cDNA的 TaqDNA聚合酶(Vichier-Guerre等，2006)。虽然该方法起作用，但具有以下缺点1)不是所 有蛋白都可以在噬菌体上展示；幻绝对需要使用生物素标记的核苷酸以进行选择；幻所展 示的酶能够以反式和顺式方式起作用；4)由于空间位阻和酶移动性限制，噬菌体-酶-DNA/ RNA复合物会干扰cDNA的有效合成。W00222869中也提到了对逆转录酶进行选择的可能性，该申请涉及区室化自我复 制(CSR)法。CSR技术用于选择嗜热性DNA聚合酶，特别是Taq DNA聚合酶((Shadessy等， 2001 ；Ghadessy等，2004 ；Ong等，2006)。将表达嗜热性DNA聚合酶的突变体文库的细菌细 胞悬浮于PCR混合物中并进行乳化，产生分离的用于体外选择更具活性的聚合酶的PCR区室。细菌RNA酶的存在会阻止逆转录酶活性的实时选择，所述细菌RNA酶在中等温度 下仍然有活性并会降解靶mRNA。还存在来自未经选择的质粒DNA (释放自细菌细胞)的DNA 污染，并且存在所有大肠杆菌酶、结构蛋白、核糖体、NTP、RNA酶、DNA酶和小分子量分子。

发明内容
本发明旨在提供蛋白进化的改进方法，该方法不具有现有技术方法的缺点。因此，在第一方面，本发明提供了编码靶蛋白的核酸的产生方法，所述方法包括
(a)提供包括一种或多种编码所述靶蛋白的RNA或DNA分子在内的RNA或DNA分 子的阵列；(b)从所述阵列产生靶蛋白，从而形成RNA-蛋白复合物或DNA-蛋白复合物，其中 所述RNA或DNA分子与所述复合物非共价或共价结合；(c)将所述复合物分隔到区室中，其中大多数或全部区室含有不超过一个复合 物；(d)使所述复合物处于允许靶蛋白具有活性的反应条件下；和(e)基于与靶蛋白相关的活性选择编码所述靶蛋白的核酸，其中当所述复合物是其中DNA非共价结合的DNA-蛋白复合物时，在不存在用于各 复合物的分离的区室的情况下进行步骤b)。本发明人已经设计了一种方法，该方法使用两种不同类型的表型-基因型联系形 式，并且获得了用于实验室内蛋白进化方法中使用的新型选择系统。下文进一步描述的该 方法的新特征使得其可以应用到与现有技术方法相比范围更宽的靶蛋白上，使用更加简 单，适应性增加。特别是，本发明首次提出了进化和改进逆转录酶性质的可能性，所述逆转 录酶是分子生物学家工具箱中最重要的酶类之一。在该方面的一个实施方式中，本发明提供了编码靶蛋白的核酸的产生方法，所述 方法包括(a)提供包括一种或多种编码所述靶蛋白的RNA或DNA分子在内的RNA或DNA分 子的阵列；(b)从所述阵列产生靶蛋白，从而形成RNA-蛋白复合物或DNA-蛋白复合物，(c)将所述复合物分隔到区室中，其中大多数或全部区室含有不超过一个复合 物；(d)使所述复合物处于允许靶蛋白具有活性的反应条件下；和(e)基于与靶蛋白相关的活性选择编码所述靶蛋白的核酸，其中在所述RNA-蛋白复合物中所述RNA与其非共价结合或共价结合，在所述 DNA-蛋白复合物中所述DNA与其共价结合。在该方面的第二实施方式中，本发明提供了编码靶蛋白的核酸的产生方法，所述 方法包括(a)提供包括一种或多种编码所述靶蛋白的RNA或DNA分子在内的RNA或DNA分 子的阵列；(b)从所述阵列产生靶蛋白，从而形成RNA-蛋白复合物或DNA-蛋白复合物，其中 所述RNA或DNA分子与所述复合物非共价或共价结合；(c)使所述复合物分隔到区室中，其中大多数或全部区室含有不超过一个复合 物；(d)使所述复合物处于允许靶蛋白具有活性的反应条件下；和(e)基于与靶蛋白相关的活性选择编码所述靶蛋白的核酸，其中在不存在用于各复合物的分离的区室的情况下进行步骤b)。可以通过本领域已知的任何技术，例如mRNA展示、噬菌体展示、细菌展示或酵母 展示，产生DNA或RNA与靶蛋白之间的共价连接。具体而言，使用mRNA展示技术可以产生共价RNA-蛋白连接，而使用共价抗体展示(CAD)技术可以产生共价DNA-蛋白连接(Reiersen 等，200 ，通过共价DNA展示(Bertschinger和Neri，2004)或使用类似的共价展示技术如 Mein等000 所述的技术进行区室内的翻译。也可以通过本领域已知的任何技术，例如核糖体展示、CIS展示或质粒展示产生 DNA或RNA与靶蛋白之间的非共价连接。具体而言，使用CIS展示在不存在区室时可以 产生非共价DNA-蛋白连接(Odergrip等，2004)，而使用核糖体展示技术可以产生非共价 RNA-蛋白连接。如上指出，当所述复合物是其中DNA为非共价结合的DNA-蛋白复合物时，在不存 在用于各复合物的分离的区室的情况下进行本发明方法中的步骤b)。换言之，步骤b)是非 区室化的。具体而言，当产生的复合物是其中DNA为非共价结合的DNA-蛋白复合物时，无 需将阵列的各成员彼此分隔即可进行产生步骤。特别是，无需通过体外区室化(IVC)将阵 列的各成员分隔即可进行产生步骤。在特别优选的实施方式中无需在油包水乳液中将阵列 的各成员分隔即可进行产生步骤。还可以通过本领域已知的任何方法进行区室化，这些方法能够使得所述复合物产 生或分离从而使得所有或基本上所有的区室含有不超过一个复合物。特别是，优选至少 70%、至少80%或至少90%的区室含有不超过一个复合物。例如，可以通过将阵列的成员 或各复合物分隔到位于微量滴定板或纳米滴定板(nanotiter plate)上的不同的孔中，或 通过体外区室化(IVC)进行区室化。具体而言，通过IVC进行的分隔可以包括分隔到油包 水乳液或水包油包水乳液中的水性微滴中。本发明方法组合了选自以下所列中的至少两种不同类型的基因型-表型联系形 式共价连接、非共价连接和区室化。在本发明的优选方面，所述方法利用这些联系形式中 的至多两种。因此在特别优选的实施方式中所述方法利用共价连接或非共价连接作为步骤 b)中的唯一表型-基因型联系形式。换言之，在该实施方式中步骤b)中不存在区室化。可以以许多不同的方式，例如通过核糖体展示、mRNA展示(Roberts和kostak， 1997)、CIS展示(Odergrip等，2004)或共价抗体展示(CAD) (Reiersen等，2005)在不存在 区室时建立DNA或RNA与蛋白之间的共价/非共价连接。具体而言，通过使用CAD技术可 以在不存在区室时实现共价DNA-蛋白连接，而通过mRNA展示和核糖体展示分别可以建立 共价RNA-蛋白连接和非共价RNA-蛋白连接。可以通过许多不同联系方式的组合实现本发明。例如，可以通过核糖体展示和体 外区室化的组合，或通过mRNA展示、CIS展示或CAD展示与IVC的组合实现本发明。在优选方面，通过核糖体展示和体外区室化的组合实现编码靶蛋白的核酸的产生 方法。具体而言所述方法包括(a)提供包括一种或多种编码所述靶蛋白的mRNA在内的mRNA的阵列；(b)在用于核糖体翻译的条件下对所述mRNA的阵列进行温育，从而产生三元复合 物的阵列，每个三元复合物包含mRNA、核糖体和由所述mRNA翻译的蛋白；(c)将三元复合物的阵列导入油包水或水包油包水乳液的水相微滴中，其中大多 数或所有的水相微滴含有不超过一个三元复合物；(d)使所述水相微滴处于允许靶蛋白具有活性的反应条件下；和(e)基于与靶蛋白相关的酶活性选择编码所述靶蛋白的核酸。
本发明的这种方法可以称为“区室化核糖体展示”(CRD)。CRD可应用于各种靶蛋 白，包括酶。CRD的优点在于所述酶和mRNA之间的联系方式是非共价的。因此如果步骤(d) 中所用的反应条件涉及增高的温度，步骤(b)中产生的三元复合物会解离，并且会释放所 述酶。这避免了所述酶固定在珠上的现有技术中上述与酶移动性相关的问题。在步骤(e)中可以以许多方式对内部具有核糖体展示复合物的乳液微滴进行分 选或选择。优选的是通过荧光激活细胞分选法(FACQ或使用微流控技术对它们进行分选。 两种技术主要利用了基于荧光的微滴分选。然而，取决于步骤(d)中所用的反应条件和要 选择的蛋白活性，还可以通过尺寸、光衍射或光吸收对微滴进行分离。当所述靶蛋白是酶时优选使用基于荧光的分选方法。在该实施方式中步骤(d)中 所用的反应条件包括能够转化成荧光产物的非荧光底物。所述酶的活性产生荧光产物，使 得可以使用FACs来区分含有活性酶的荧光微滴和不含有活性酶或含有较弱活性酶的非荧 光微滴或弱荧光微滴。尤其是，CRD可应用于诸如逆转录酶等核酸加工酶，并使得可以进行快速有效的体 外进化。在另一方面，本发明提供了编码靶蛋白的核酸的产生方法，所述方法包括(a)提供包括一种或多种编码所述靶蛋白的mRNA在内的mRNA的阵列，其中所述 mRNA包括酶的底物，所述酶包括靶蛋白或其辅酶；(b)在用于核糖体翻译的条件下对所述mRNA的阵列进行温育，从而产生三元复合 物的阵列，每个三元复合物包含mRNA、核糖体和由所述mRNA翻译的蛋白；(c)将三元复合物的阵列和可选的辅酶导入油包水或水包油包水乳液的水相微滴 中，其中大多数或所有的水相微滴含有不超过一个三元复合物；(d)使所述水相微滴处于允许靶蛋白具有活性的反应条件下；和(e)基于与靶蛋白相关的酶活性选择编码所述靶蛋白的核酸。在本发明该方面的一种实施方式中，当所述核酸加工酶是DNA依赖性DNA聚合酶 时，步骤(a)中的mRNA可以连接到双链DNA衔接体(adaptor)分子，从而提供底物。CRD多样性为 IO9至101°个变体，并且受到IVC步骤限制。该新方法与能够用于 筛选 IO5至IO6个逆转录酶的突变体的高通量筛选(HTQ相比，更加有效的多，耗时更少 和更加廉价。CRD多样性比HTS高约4个数量级，因此通过区室化核糖体展示选择可以容易 地寻找出被HTS错过的许多更有益的突变体。根据步骤(a)，提供通常是合成mRNA的mRNA的阵列，所述阵列包括编码所述靶蛋 白的一个或多个阵列成员。当靶蛋白是逆转录酶时，所述mRNA包含酶的底物，所述酶包含 靶蛋白或其辅酶。在随后的选择步骤(e)中，基于与靶蛋白相关的酶活性选择编码所述靶 蛋白的核酸。这样，涉及了本发明的两个实施方式一个实施方式中所述酶活性由靶蛋白提 供，一个实施方式中在靶蛋白的存在下所述酶活性由所述靶蛋白的辅酶提供。在需要辅酶 的实施方式中，与三元复合物的阵列一样，将辅酶导入步骤(c)的油包水乳液的水相微滴 中。当所述酶包括所述靶蛋白时，不必将另外的辅酶导入水相微滴中。在所述方法的步骤(b)中，用核糖体处理mRNA的阵列以产生三元复合物的阵列， 每个三元复合物包含mRNA、核糖体和由mRNA翻译的蛋白。可以在任何适合于通常的mRNA 体外翻译的条件下，例如于核糖体展示技术中所用的条件下进行该步骤。在这点上，可以对所述三元复合物进行纯化，虽然这不是必须的。在这点上可以对所述三元复合物补充任何 随后酶活性所需的辅助底物(co-substrate)，然后通常将反应混合物乳化以获得约101°个 油包水区室，各区室的平均直径通常为约2 μ m 3 μ m。即使是小体积05 μ 1)的体外翻译 反应也会产生约IO11 IO12个贮存核糖体复合物分子。通常的核糖体展示方法使用缺乏终 止密码子的mRNA，虽然也可以存在终止密码子(Matsuura等，2007)。为了获得其中大多数 或所有水相微滴含有不超过一个三元复合物的水相微滴，三元复合物的浓度与通常的核糖 体展示技术所用的相应浓度相比必须减少约两个数量级。在所述方法的该步骤中仅使用非 常低浓度的三元复合物。所述酶可以包括核酸加工酶，该核酸加工酶可以是RNA加工酶。所述核酸加工酶 可以包括靶蛋白，并且可以选自核酸聚合酶、核酸连接酶和末端脱氧核苷酸转移酶。如本文 进一步的详述，所述核酸聚合酶可以包括逆转录酶。在该实施方式中，编码逆转录酶的mRNA 自身是该逆转录酶的底物。选择编码靶蛋白的核酸的步骤(e)包括选择通过逆转录酶的作 用产生的cDNA，所述cDNA编码逆转录酶。当靶蛋白是核酸连接酶时，可以对能够连接RNA和RNA或连接DNA和DNA的 RNA(DNA)连接酶进行选择。优选的是，允许酶具有活性的反应条件包含含有核酸连接子 或衔接体的辅助底物，所述辅助底物还包括用于附着到配体结合伴侣的亲和配体或用于 RT-PCR中经加工的mRNA的特异性扩增的序列标签。在第一种情况下，编码靶蛋白的mRNA 与在导入有编码核酸连接酶的mRNA的水相微滴中的辅助底物连接。优选的是，所述亲和配 体包含生物素，并且所述配体结合伴侣包含链亲和素。对编码所述靶蛋白的核酸进行选择 的步骤包括通过附着到包含配体结合伴侣的固相而选择引入所述辅助底物的mRNA。在通常 的方法中，将连接酶的突变体文库进行体外翻译，将纯化的三元复合物稀释并且在具有生 物素标记的DNA/RNA连接子和/或衔接体的反应缓冲液中进行乳化。使乳液升温到37°C 后，核糖体三元复合物解体(disassemble)。连接酶将被释放，并且mRNA的3 ‘末端将可接 触生物素标记的衔接体并用于随后的连接反应。仅编码连接酶的具有活性(或活性更高) 的变体的生物素标记的mRNA在链亲和素珠上得到纯化并可以通过RT-PCR进行扩增。在第二种情况下，选择编码靶蛋白的核酸的步骤包括选择具有附着的序列特异性 标签的mRNA，所述序列特异性标签可用作用于逆转录和随后的PCR的引物的选择性退火位 点。在通常的方法中，将连接酶的突变体文库进行体外翻译，并且将纯化的三元复合 物稀释并且在具有DNA/RNA连接子和/或衔接体的反应缓冲液中进行乳化。将乳液升温到 37°C后，核糖体三元复合物解体。连接酶会被释放，并且mRNA的3'末端将可接触所述衔接 体并用于随后的连接反应。仅编码连接酶的具有活性(或活性更高)的变体的RNA会具有 在逆转录中所用引物的特异性退火所需的特异性连接子序列，并且可以通过RT-PCR进行 有效地进行扩增。还可以对末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)进行选择。该酶作用于RNA并且可引入脱 氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和核苷酸类似物等。在该实施方式中，允许酶具有活性的反应条 件包括含有dNTP的辅助底物，所述辅助底物还包括用于附着到配体结合伴侣的亲和配体。 与核酸连接酶一样，所述亲和配体可以是生物素，所述配体结合伴侣可以是链亲和素。对 编码靶蛋白的核酸的选择可以包括通过附着到包含配体结合伴侣的固相来选择引入辅助底物的mRNA。可以将TdT的突变体文库进行体外翻译，并且需要将纯化的核糖体三元复合 物进行稀释并且在具有生物素标记的核苷酸(例如生物素-dUTP)的反应缓冲液中进行乳 化。对于野生型酶最适的工作温度是37°C。在该温度下所述核糖体三元复合物会解体，并 且mRNA的3'末端将可用于模板非依赖性聚合反应。引入生物素标记的核苷酸的TdT-编 码mRNA在链亲和素珠上得到选择，并且随后可以进行逆转录和通过RT-PCR进行扩增。在另一个实施方式中，所述靶蛋白包括逆转录酶辅助酶(helper enzyme)，例如解 旋酶、焦磷酸酶、持续因子(processivity factor)、RNA结合蛋白或其它在逆转录酶存在下 能够改善逆转录反应的蛋白。在该实施方式中，所述核酸加工酶包括逆转录酶，所述逆转录 酶是导入油包水乳液的水相微滴中的辅酶。在选择编码靶蛋白的核酸的步骤(e)中，选择 通过逆转录酶的作用产生的并且编码逆转录酶辅助酶的cDNA。水相中逆转录酶辅助酶的存 在促进了编码所述辅助子的mRNA的逆转录。因此，被逆转录的mRNA形成编码所述辅助子 的cDNA，并且可以被PCR扩增。在另一实施方式中，所述靶蛋白包括RNA酶抑制剂。在该实施方式中，所述核酸加 工酶包含RNA酶。选择编码靶蛋白的核酸的步骤(e)包括选择未被RNA酶降解的mRNA。在 该实施方式中，将RNA酶作为辅酶导入油包水乳液的水相微滴中。一旦反应条件允许酶具 有活性，任何不含有有效RNA酶抑制剂的微滴会显示出RNA酶活性，由此会将mRNA降解。因 此，编码在所用的反应条件下有效的RNA酶抑制剂的mRNA会继续存在。一般而言，对RNA酶 抑制剂的突变体文库进行体外翻译，并将纯化的核糖体三元复合物稀释并在具有合适RNA 酶的反应缓冲液中进行乳化。在替代性方案中，可以通过乳化微滴稍后递送RNA酶。对仅 编码具有活性(或更稳定)的RNA酶抑制剂的mRNA进行纯化和通过RT-PCR进行扩增。区室化核糖体展示还可用于体外区室化中的反应缓冲液交换，所述外区室化中选 择缓冲液与体外翻译混合物不相容，并且底物到产物的转化必须在严格受控的反应条件下 进行。如本文讨论，基于与靶蛋白相关的酶活性而选择的编码靶蛋白的核酸可以是DNA 或RNA。可以对所述阵列进行转化或扩增，从而形成DNA或RNA。在优选的方案中，对所述 阵列进行转化或扩增，从而形成所述方法的步骤(a)中的mRNA的阵列，并进行一个或多个 另外的步骤(b) (e)的循环，从而进一步富集具有更大量的编码靶蛋白的mRNA的阵列。使水相微滴处于允许酶具有活性的反应条件的步骤(d)为选择步骤(e)提供了基 础，所述步骤(e)中选择编码靶蛋白的那些核酸。在步骤(d)中可以使用各种反应条件以 提供选择压力。在一个实例中，反应条件包括在野生型酶的最适温度之上的温度。这些反 应条件可以用于选择比野生型酶具有更高热稳定性的突变酶或在该温度下反应速率更高 的突变酶或温度-活性曲线发生改变的突变酶。突变酶可能需要以比野生型酶更高的敏感 性运行，因为水相微滴中mRNA的浓度是约400pM。突变酶还必须更精确地运行。所有这些 选择压力对于逆转录酶特别重要。像生理条件一样，反应条件可以包括缓冲液、诸如金属离 子等其它因子的浓度和PH的变化。在更好的逆转录酶的CRD选择中，可以施加许多更加不同的选择压力1)选择较 不易于聚集的溶解度更高的酶-必须将三元复合物(乳化之前)与疏水性材料预温育，从 而消除具有表面暴露的疏水性残基的蛋白；幻选择非常快速的酶-逆转录反应时间在选择 循环期间需要逐渐减少；3)选择合成长cDNA的酶-逐渐延伸CRD中使用的mRNA文库，结果合成更长的cDNA ；4)选择能够通过二级结构转录的酶-必须将二级结构形成序列导入到 CRD中使用的mRNA文库中；5)选择在不同于RT缓冲液的缓冲液中起作用的酶(例如在PCR 中，一步RT-PCR缓冲液或具有变性剂的缓冲液)_必须在我们选择的缓冲液中进行CRD选 择；6)选择能够导入核苷酸类似物的酶-必须在具有生物素标记的核苷酸类似物的RT缓 冲液中进行选择，并随后在链亲和素珠上进行cDNA纯化。区室化核糖体展示(CRD)还适合于许多荧光激活细胞分选(FACS)应用。必须以 核糖体展示形式展示目的蛋白。可选的是，应该对反应缓冲液中混合有非荧光底物(S)的 经纯化(或仅仅稀释许多倍)的包含mRNA-核糖体-蛋白(tRNA)的三元复合物进行乳化， 产生水包油包水双乳液(Bernath等，2004 ；MastrcAattista等，200 。区室化酶的活性变 体会将底物⑶转化成荧光产物(P)，从而能够以FACS区分荧光微滴(内部为活性酶)和 “暗”微滴(内部为失活酶)。与酶促反应必须在转录/翻译混合物中进行的之前公开的实 例相反，CRD允许在更天然(为所需要的)的条件下进行完全缓冲液交换和活性酶选择(图 10)。还可以使用CRD选择和进化热稳定性DNA聚合酶(图11)。必须以核糖体展示形 式展示目的聚合酶。可选的是，可以使用经纯化(或仅仅稀释许多倍)的包含mRNA-核糖 体-聚合酶的三元复合物来制备在PCR缓冲液中的具有逆转录酶(辅助酶)、dNTP和引物 组的反应混合物。应该对反应液进行乳化，产生油包水乳液。在第一步RT中-逆转录酶必 须合成cDNA，该cDNA随后用作第二步PCR的靶-利用核糖体展示的DNA聚合酶进行cDNA 扩增。PCR中所用的引物之一可以具有生物素和非互补性5'末端，所述生物素用于可选的 使用链亲和素珠的随后纯化。将RT-PCR乳液破乳后，新合成的DNA片段可通过生物素进行 纯化，并使用新引物组再次扩增，该新引物组含有的一个引物的序列与cDNA不互补、但与 第一次扩增反应中所用引物的5'部分相同(在cDNA背景下的DNA选择性扩增)。相对于 活性较低的变体，DNA聚合酶的活性更高的变体将得到富集，并可用于进一步分析或下一轮 选择(图11)。区室化核糖体展示技术的重要特征是1).通过mRNA文库维持基因型，这对于选择RNA加工酶特别有用；2).选择单元是mRNA-核糖体-蛋白(tRNA)三元复合物，并且可以通过超速离心、 凝胶过滤、亲和标签纯化和其它简单方法对其容易地进行纯化；3).可以交换反应缓冲液，由此能够将选择单元转移(经过纯化或未经纯化)到新 的反应混合物，并且同时被稀释100 200倍(从而将乳化后核糖体复合物的数量调整到 低于1个分子/反应区室)；4). CRD的mRNA文库多样性仅受体外区室化的多样性指数限制，并且低于101°的 不同变体；5). 一旦乳化，可以在4°C 94°C的宽范围的温度下进行选择反应，原因在于在这 些温度下乳液是稳定的；6).如果在较高温度(30°C以上)进行选择，三元复合物会解离，但保持区室化从 而不丧失基因型-表型联系，释放mRNA和体外翻译的蛋白。已经发现本发明的区室化核糖体展示方法对于促进新型逆转录酶的进化起特别 良好的作用。作为实例，M-MuLV逆转录酶(Gerard等，1986，pRT601)可用于选择(该酶包括用于纯化的N末端His标签)。该逆转录酶的活性最适的温度是42°C，并且在高达50°C的 温度下仍有活性。可以在本发明方法的步骤⑷中使编码M-MuLV逆转录酶的mRNA的阵列 处于温育温度为50°C 60°C并且包括cDNA合成所需的引物和dNTP的反应条件下。在这些 较高的温度下，在4°C下稳定的贮存的核糖体复合物迅速解离，释放逆转录酶底物(mRNA) 和酶到溶液中。在一个实施方式中，从核糖体复合物释放的体外翻译的逆转录酶M-MuLV具有作 为间隔子的与在核糖体展示构建中所用的λ噬菌体外表面蛋白D融合的C末端，从而保留 在核糖体隧道(Matsuura和Pluckthun，2003)和共价结合的tRNA中，原因在于翻译未正确 地终止。蛋白D是非常良好表达的可溶且稳定的蛋白，解折叠转变温度为 57°C (Forrer 和Jaussi，1998)，因此是用于选择热稳定性逆转录酶的良好融合伴侣。在区室化核糖体展示选择方法中，只有具有完全活性的逆转录酶的变体可以执行 cDNA的合成，该cDNA编码相同活性的酶。在1小时内，逆转录反应完成后，将乳液破乳，对 cDNA进行纯化并通过巢式PCR进行扩增。由于CRD的选择性质，只有编码能够执行全长 cDNA合成的逆转录酶的活性变体的cDNA会被扩增，并且必要的话可被转移到下一轮选择。 为了消除T7聚合酶启动子区域、核糖体结合位点(RBQ和蛋白D序列中不期望的突变，可 以将仅编码M-MuLV序列的扩增DNA连接到天然5'和3'末端片段，从而恢复最初的核糖 体展示构建体，并可以进行下一轮选择。在5轮选择中已经鉴定出在50°下具有比活性的酶变体，与用于文库制备的原 始酶的活性相比，该变体的活性高2倍至4倍。一些蛋白更快速，一些蛋白具有更高的热 稳定性。许多选择的M-MuLV变体具有D524G或D583N突变，这些突变关闭了逆转录酶的 RNA酶H活性，改善了 cDNA合成以及热稳定性(Gerard等，2002)。许多更多的所选择的 M-MuLV逆转录酶的变体具有之前提到和描述(US7056716 ；US20060094050A1 ；US7078208 ； US20050232934A1 ；W007022045A2)的其它不同的有益突变(H204R ；H638R ；T197A ；M289V ； E302K ；T306A ；N454K ；Y64C ；E69G ；Q190R ；V223M ；F309S ；L435P ；E562K)。除此之外，本发明 人还发现了逆转录酶氨基酸序列中的许多新的热点。一些突变的重复频率非常高，并且具 有非常重要的意义，这对经纯化的突变体进行分析时可以显示(实施例2)。因此本发明人 可以声明，本发明的CRD技术是非常快速而且稳健(fast and robust)的选择方法，通过直 接进化和M-MuLV逆转录酶的改进可以确认其有效性。作为原理的验证，我们已选择出在更 高温度下工作更好的M-MuLV逆转录酶的变体。在另一方面，本发明提供了通过本文所述方法可获得的逆转录酶。在另一方面，本发明提供了在超过42 0C，优选至少50 0C，更优选50°C 60 °C的温 度下具有最佳活性的逆转录酶。通过应用具有较高温度，优选至少50°C的反应条件根据本 文所述方法可以选择逆转录酶。在本发明的这一方面，可以选择与野生型酶相比活性-温 度曲线迁移的逆转录酶，所述活性-温度曲线迁移使观察到的最佳活性的温度升高。在另一方面，本发明提供了一种逆转录酶，该逆转录酶包含在以下氨基酸位置中 的一处或多处具有突变的MMLV逆转录酶氨基酸序列D200, D653, L603, T330, L139, Q221,T287，149，N479, H594, F625, H126,A502, E607, K658, P130, Q237, N249,
A307, Y344, Q430, D449, A644, N649,L671, E673, M39, Q91, M66, W388,1179 E302 L333 R390 Q374 和 E5当突变位于D653处时，优选该突变不是D653N。当突变位于L603处时，优选该突 变不是L603A。另外，当突变位于H594处时，优选该突变不是H594A。优选位于上述位置处的突变是点突变。优选的是，所述逆转录酶具有以下突变中的一个或多个突变D200N，A或G， D653N, G，A，H 或 V, L603W 或 Μ, T330P, L139P, Q221R, T287A, I49V 或 T, N479D, H594R 或 Q, F625S 或 L，H126S 或 R，A502V, E607K, G 或 A，K658R 或 Q P130S，Q237R，N249D，A307V，Y344H, Q430R,D449G 或 A，A644V 或 T，N649S,L671P,E673G 或 K，M39V 或 L，Q91R 或 L，M66L,W388R, I179T 或 V E302K L333Q R390W Q374R 和 E5K发现这些突变中的每个，例如使得突变酶在50°C时与相应的野生型酶相比具有更 高的活性。这些突变的进一步详细描述记载于具体实施例中。在本发明特别优选的方面，突变酶具有至少两个突变。在一个实施方式中所述两 个突变位于D200和L603处。例如所述突变为D200N和L603W。在替代性实施方式中所述 突变位于N479和H594。例如所述突变为N479D和H594R。在另一方面，本发明提供了在大于37°C的温度具有最佳活性的逆转录酶，其中 50°C下的活性是37°C下活性的至少120%。优选的是，50°C下的活性是37°C下活性的至少 130%，更优选至少160%。在另一方面，本发明提供了 50°C下活性为相应野生型酶活性的至少两倍的突变逆 转录酶。在另一方面，本发明提供了 37°C下比活性为相应野生型酶活性的至少130%的突 变逆转录酶。优选的是，所述突变逆转录酶的比活性是相应野生型酶比活性的至少140%， 更优选至少150%，特别优选至少160%。如本文所述已经发现部分纯化的野生型酶的37°C 的比活性为约200000U/mg。在具体实施例中会更详细地讨论根据本发明获得的具体突变逆 转录酶。在另一方面，本发明提供了热稳定性为相应野生型酶热稳定性的至少1. 5倍的突 变逆转录酶。本申请中根据在50°C下处理5分钟后在37°C下的残留活性来测定热稳定性。 优选的是，突变逆转录酶的热稳定性是相应野生型酶热稳定性的至少1. 5倍，更优选至少 2倍，还更优选至少2. 5倍。通常，野生型逆转录酶37°C下的残留活性是未经处理酶的约 11%。优选本发明的逆转录酶包括MMLV逆转录酶。在另一方面，本发明提供了编码本文所述逆转录酶的多核苷酸，例如mRNA或DNA。本发明的逆转录酶可以用于各种分子生物学技术，如RT-PCR(qRT-PCR等)。可以 提供一种用于RT-PCR的试剂盒，所述试剂盒中的逆转录酶是本发明的逆转录酶。


现在参考仅作为示例的附图和附录，更详细地描述本发明。图1.实施例1的实验流程图。使用两种质粒pET_his_MLV_pD(编码与蛋白D间隔子融合的莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶)和pET_his_del_pD(编码与蛋白D 间隔子融合的失活(pol结构域中57个氨基酸缺失)的莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆 转录酶)来合成PCR片段。PCR片段继续用于转录反应和合成3'末端缺少终止密码子的 mRNA。将经纯化的mRNA以1 50 = MLV (活性RT) del (失活RT)的比例混合并用于体 外翻译反应。翻译反应期间，核糖体复合物合成蛋白，并在缺少终止密码子的mRNA的末端 停止。通过蔗糖垫超速离心对三元复合物(TC)的混合物进行纯化。使用已经含有与体外 翻译的MLV逆转录酶相连的mRNA的经纯化三元复合物(取< 3 X IO9个分子)来制备逆转 录反应混合物，该逆转录反应混合物补充有用于RT反应的外部dNTP组和引物。对冰冷的 RT反应混合物进行乳化，产生 IX 101°个大小为 2μπι的油包水区室。为了进行RT反 应，对乳化RT反应混合物(低于一个TC(mRNA+MLV RT)/区室)于42°C下温育1小时。区 室化RT反应混合物的温度升高后，大多数TC解离，释放mRNA和逆转录酶。仅在含有活性 MLV逆转录酶(MLV_pD)的区室中才进行成功的RT反应，在具有失活逆转录酶(del_pD)的 区室中未合成cDNA。随后PCR扩增cDNA，并观察到活性逆转录酶(MLV_pD)基因相对于失 活逆转录酶(del_pD)的富集。图 2. pET_his_MLV_pD 质粒的示意图。图3.实施例1-对CRD选择期间合成的cDNA进行的第一次PCR的琼脂糖凝胶电 泳。所用引物:RD_Nde(SEQ ID No 9)和 pD_55 (SEQ ID No :10)。对于 MLV_pD，PCR 片段的 预期长度是2185bp，对于del_pD是2014bp。在每孔加载10 μ 1 PCR混合物的1 %琼脂糖凝 胶上进行扩增分析。图4.实施例1-对第一次PCR产物进行的用于部分基因扩增的巢式PCR的琼脂糖 凝胶电泳。所用引物:M_F(SEQ ID No :11) _2R(SEQ ID No :12)。对于 MLV_pDa，PCR 片 段的预期长度是907bp，对于del_pD是736bp。在每孔加载10 μ IPCR混合物的1 %琼脂糖 凝胶上进行扩增分析。图5.实施例1-对第一次PCR产物进行的用于全基因扩增的巢式PCR的琼脂糖凝 胶电泳。所用引物M_Esp(SEQ ID No :13)和 M_Eri (SEQ ID No :14)。对于 MLV_pDa，PCR 片段的预期长度是2077bp，对于del_pD是1906bp。在每孔加载10 μ 1 PCR混合物的琼 脂糖凝胶上进行扩增分析。图6.实施例2中CRD选择的实验流程图。使用编码逆转录酶(与蛋白D融合) MLV_pD的突变体文库的PCR片段来合成mRNA。经纯化的mRNA用于体外翻译反应。在翻 译混合物中形成mRNA-核糖体-MLV_pD (tRNA)的三元复合物(TC)，并通过低温和高浓度的 Mg2+离子将其稳定。通过蔗糖垫超速离心对TC的混合物进行纯化。将沉淀的TC溶解于冰 冷的缓冲液(50mM Mg2+)中并用于制备逆转录反应混合物，该逆转录反应混合物补充有用 于RT反应的外部dNTP组和引物。对冰冷的RT反应混合物进行乳化，产生 1X 101°个大 小为 2μπι的油包水区室。MLV RT的最适反应温度是 42°C。为了选择在更高温度下工 作更好的逆转录酶变体，使乳化的RT反应混合物(低于一个TC(mRNA+MLV RT)/区室)于 50°C下温育1小时。在该温度下在含有更具活性或热稳定性的MLV逆转录酶变体的区室 中全长cDNA的成功合成进行地更好。随后的PCR用于扩增全长cDNA，并进行更具活性和 热稳定性的逆转录酶基因的富集。通过PCR，将扩增的基因回复到CRD形式，通过连接PCR 恢复完整的5'(起始片段-T7聚合酶启动子、SD和his-标签编码序列)和3'(末端片16段_gs连接子、蛋白D和第二 gs连接子)序列。含有逆转录酶基因的富集文库的重建PCR 片段被用于随后的mRNA转录和下一轮CRD选择。在温度越来越高的RT反应中进行各轮选 择50°C (第一轮)；52.5°C (第二轮)；55°C (第三轮)；57. 5°C (第四轮)和60°C (第五 轮)。图7.新一轮CRD选择之前PCR片段的重建流程图。用(NcoI相容末端 (compatible end))和EcoRI消化突变的MLV RT文库，并将其与起始片段Q44bp)和末 端片段(398bp)连接，从而获得适合CRD选择的PCR片段。通过对最初的983bp起始片段 (靶-质粒 pET_his_del_pD(SEQ ID No :2)、引物-pro-pIVEX(SEQ ID No 3)禾口 M_1R(SEQ ID No 15))进行PCR扩增和随后用NcoI (识别序列C丨CATGG)消化，构建起始片段(含 有T7聚合酶启动子、SD和his-标签编码序列)，产生M4bp的DNA片段。通过对最初的 1039bp 末端片段(靶-质粒 pET_his_del_pD(SEQ ID No 2)，引物-M_3F (SEQ ID No :16) 和pD-ter(SEQ ID No :4))进行PCR扩增和随后用EcoRI (识别序列G丨AATTC)消化，构建 末端片段(含有gs连接子、蛋白D和第二 gs连接子序列)，产生398bp的DNA片段。图8. 37°C、50°C下测定的突变RT变体的逆转录酶活性和50°C下温育5分钟后在 37°C下的残留活性。将37°C下的逆转录酶活性标准化成总是100%并且将其省略。因此仅 显示两种类型的柱(50°C下RT活性的百分比和50°C下温育5分钟后在37°C下的残留RT活 性的百分比)。作为对照，给出用于突变体文库构建的wt M-MuLV逆转录酶。该起始酶在与 RT突变变体相同的载体中表达并以相同的方式进行纯化。对于所有测试突变体50°C下的 突变RT活性的平均值约为 92%，超过wt酶(45% )的2倍以上。50°C下预温育5分钟 后在37°C下突变RT变体的平均残留活性为12% (wt酶 11% )。图9. 37°C下10分钟测定的部分纯化的wt和突变RT变体的比活性(u/mg蛋白)。图10.所提出的使用FACS进行CRD选择的实验流程图。以核糖体展示形式展示 目的蛋白。使包含mRNA-核糖体-蛋白(tRNA)的经纯化(或仅仅稀释许多倍)的三元复 合物与非荧光底物( 在反应缓冲液中混合，并随后进行乳化，产生水包油包水双乳液。区 室化酶的活性变体会将底物( 转化成荧光产物(P)，使得FACS得以区分荧光微滴(内部 为活性酶)和“暗”微滴(内部为失活酶)。图11.所提出的使用CRD对热稳定性DNA聚合酶进行选择和进化的实验流程图。 必须以核糖体展示形式展示目的蛋白。可选经纯化(或仅仅稀释许多倍)的包含mRNA-核 糖体-聚合酶的三元复合物可用来制备在PCR缓冲液中的具有逆转录酶(辅助酶)、dNTP 和引物组的反应混合物。应该对反应液进行乳化，产生油包水乳液。在第一步RT中-逆转 录酶必须合成cDNA，该cDNA随后用作第二步PCR的靶-利用核糖体展示的DNA聚合酶进 行cDNA扩增。PCR中所用的引物之一可以具有生物素和非互补性5'末端，所述生物素用 于可选的使用链亲和素珠进行的随后纯化。将RT-PCR乳液破乳后，新合成的DNA片段经由 生物素进行纯化，并使用新引物组再次扩增，该新引物组含有序列与cDNA不互补、但与第 一扩增反应(DNA相对于cDNA背景的选择性扩增)中所用的引物的5'部分相同的一种引 物。相对于活性较低的变体，DNA聚合酶的活性更高的变体会得到富集，并可用于进一步分 析或下一轮选择。图12.实施例4的实验流程图。在该实验计划中将M-MuLV逆转录酶用作DNA依 赖性DNA聚合酶。使用两种质粒，pET_his_MLV_D583N_pD (编码减去RNA酶H的与蛋白D间隔子融合的莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶)和pET_his_del_pD(编码与蛋 白D间隔子融合的失活逆转录酶-在pol结构域中57个氨基酸缺失，并且在RNA酶H结构 域中存在点突变D583N)，来合成PCR片段。PCR片段继续用于转录反应。将经纯化的mRNA 以1 20 = MLV_D583N_pD (活性RT) del_pD (失活RT)的比例混合，并用于通过使用 T4 DNA连接酶将dsDNA连接到mRNA混合物上来制备mRNA/dsDNA复合物。mRNA/dsDNA复 合物用于体外翻译反应。翻译反应期间，核糖体复合物合成蛋白，并在mRNA的末端(位于 mRNA/DNA杂交物的开始)处停止。通过蔗糖垫超速离心对三元复合物(TC)的混合物进行 纯化。使用已经含有与体外翻译的聚合酶(M-MuLV逆转录酶)连接的mRNA/dsDNA的经纯 化三元复合物(取< 3X IO9个分子)来制备补充有外部生物素-dUTP的延伸反应混合物。 对冰冷的反应混合物进行乳化，产生 1 X 101°个大小为 2 μ m的油包水区室。为了导入 生物素化核苷酸，将乳化延伸反应混合物(低于一个TC (mRNA/dsDNA+聚合酶)/区室)于 37°C下温育30分钟。区室化反应混合物的温度升高后，大多数TC解离，释放mRNA/dsDNA 复合物和聚合酶。仅在含有活性聚合酶(逆转录酶_MLV_D583N_pD)的区室中才进行成功 的导入dsDNA底物中的反应，在具有失活聚合酶(del_pD)的区室中未合成cDNA。将乳液 破乳后，使用凝胶过滤微柱除去过量的生物素-dUTP。在链亲和素珠上对生物素化的mRNA/ dsDNA复合物进行纯化并将其用于合成cDNA。随后PCR扩增cDNA，观察到活性聚合酶(逆 转录酶-MLV_D583N_pD)基因相对于失活聚合酶(del_pD)的富集。图13.确定生物素-dUTP导入到mRNA/dsDNA复合物和导入到自为引物的mRNA中 的效率。对导入 dTTP 或生物素-dUTP 后的 mRNA/dsDNA (MLV_D583N_pD)和 mRNA(del_pD) 样品进行的RT-PCR的图像。对于MLV_D583N_pD，预测的扩增子大小为907bp，对于del_pD cDNA为736bp。在每孔加载10 μ 1 PCR混合物的1 %琼脂糖凝胶上分析PCR产物。图14.通过导入dTTP (生物素-dUTP)和[α -P33] dATP进行的mRNA/dsDNA复合物 存在的一般对比。在导入最初的dTTP或生物素-dUTP后，应该将放射性dATP导入到dsDNA 底物中。A-用溴化乙锭可视化的琼脂糖凝胶(mRNA或mRNA/dsDNA带-2. 5kb)。B-滤纸上 干燥的与 A 相同凝胶，并且使用 Cyclone PhosphorImager (Perkin-Elmer, ffellesley, ΜΑ) 使其可视化。观察到标记的mRNA/dsDNA复合物和/或仅观察到dsDNA带。C-mRNA/dsDNA 复合物中dsDNA对应物(counterpart)的结构和序列。图15.实施例4的所得最终RT-PCR片段的分析。对于MLV_D583N_pD，预测的扩 增子大小为907bp，对于del_pD cDNA为73^ρ。在每孔加载10 μ 1 PCR混合物的琼脂 糖凝胶上分析PCR产物。进行链亲和素珠纯化前的RT-PCR样品相当于活性聚合酶基因与 失活聚合酶基因的比例为1 20(几乎只有del_pD片段 736bp可见)。在链亲和素珠 上纯化后的RT-PCR样品相当于活性聚合酶基因与失活聚合酶基因的一轮选择后的比例为 1 1。在该轮选择中观察到 20的富集倍数。图16.用于确定11Λ和4. 5kb cDNA合成反应的最高温度的碱性琼脂糖凝胶的一 些实例。PCR 仪-Eppendor Mastercycle Gradient。A-D-lkb cDNA 合成(M-MuLV(wt) > D200N、L603W 和 Q221R)；温度梯度 41. 9 "C>43. 6 "C>45. 5 "C>47. 8 "C>50. 4 "C>53. 1 "C、 55. 8°C、58. 1°C、60. 1°C、62. 1°C ；尺寸标准(size s tan dart)-DNA Fast Ruler 中等范围 (Fermentas)。E-G-4. 5kb cDNA 合成(M2、M3 禾口 M4)；温度梯度 49. 8 °C、51· 5 °C、53· 4 °C、 55. 7°C、58. 3°C、61. 0°C、63. 7°C、66. 1°C、68. 0°C、70. 0°C ；尺寸标准-Zip Ruler ExpressDNA ladder 2 (Fermentas)。附录1.起始MLV RT文库(NcoI和EcoRI限制性位点之间的序列-SEQ ID No. 24) 中发现的突变的概览。于10个测序基因中发现23个核苷酸突变(1个颠换、20个转换-突 变位置加下划线，在序列之上标出突变，2个缺失-加下划线并在序列之上标示为虚线)，产 生15个氨基酸交换、6个沉默突变、1个终止密码子和2个编码框的移码-平均每个基因1 至2个氨基酸取代。附录2.为了与文献中通常所用的氨基酸编号相同，对所有104个蛋白序列进行不 带N末端His标签的CLUSTALW比对。表示为MLV(SEQ ID No 25)的野生型序列总是以第 一序列给出(按照显示顺序突变序列表示SEQ ID Nos J6 128)。使用于黑色背景中的白 色字体标记突变。发生了某种程度上改善M-MuLV逆转录酶性质和描述于不同的专利申请 中的突变处的氨基酸位置在比对中标记为以灰色突出显示的氨基酸(白色字体)的柱。源 自我们的选择并且位于灰色柱中的突变表明，我们的选择方法精确地靶向有益的热点或甚 至别处所述的确切氨基酸突变。与初始wt M-MuLV相比50°C下的活性实质上更好(与wt 活性的45%相比，为70%以上)的所分析蛋白的序列用灰色突出显示。附录3.所有选择的RT变体中发现的突变的列表。按照突变数量的递减对蛋白进 行排列。附录4.所选择RT变体的突变频率(降序)。与初始wt M-MuLV相比50°C下的活 性实质上更好(与wt活性的45%相比，为70%以上)的所分析蛋白的名称用灰色突出显7J\ ο附录5.关于M-MuLV(wt)逆转录酶和单突变体的数据的总结表，所述表包含蛋白 名称；选择频率(具有确切突变的测序突变体的数量，括号中的数字表示选择中发现的具 体氨基酸突变的总数)；蛋白浓度(mg/ml) ；37°C下的逆转录酶比活性(u/mg) ；50°C下的相 对活性(％)；在50°C下酶温育5分钟后在37°C下的相对残留活性(％)；蛋白的RNA酶H 比活性(u/mol)；相对RNA酶H活性(％ )以及11Λ cDNA合成反应的最高温度。附录6.关于M-MuLV(wt)逆转录酶和单突变体的数据的总结表，所述表包含蛋白 名称；蛋白浓度(mg/ml) ；37°C下的逆转录酶比活性(u/mg) ；50°C下的相对活性(％ )以及 Ikb和4. 5kb cDNA合成反应的最高温度。附录7. SEQ ID Nos :1 23相关的序列和信息。
具体实施例方式实施例I-CRD-原理验证为了提供区室化核糖体展示选择系统的原理验证，进行测试选择。通常的原理验 证实验对于活性酶(对于我们的情况是起始MLV逆转录酶的RT-PCR片段)应该给出阳性 信号和对于失活酶没有信号(对于失活的MLV逆转录酶没有RT-PCR片段)。更复杂的实验 使用编码活性酶和失活酶的基因的规定比例的混合物。作为成功实验的结果，编码活性酶 的基因应该相对于编码失活酶的基因富集。实验的一般流程图示于图1。使用两种质粒，pET_his_MLV_pD(编码与蛋白D间 隔子融合的莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶)和pET_his_del_pD(编码与蛋白D 间隔子融合的失活(pol结构域中57个氨基酸缺失)的莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶)来合成PCR片段。进而PCR片段用于合成mRNA的转录反应，所述mRNA的3'末 端缺少终止密码子。将从两个上述PCR片段产生的经纯化的mRNA以1 50 =MLV(活性 RT) del (失活RT)的比例混合并用于体外翻译反应。翻译反应期间，核糖体复合物合成 蛋白，并在缺少终止密码子的mRNA的末端停止。通过用冰冷的含有50mM Mg2+的缓冲液进 行稀释来终止翻译反应。低温、高浓度的Mg2+离子和在mRNA的末端不存在终止密码子使 得mRNA-核糖体-蛋白(tRNA)的三元复合物(TC)稳定化。通过蔗糖垫超速离心对三元复 合物(TC)的混合物进行纯化。对超速离心进行优化，以使TC (-3. 5MDa)沉淀于超速离心管 的底部，同时小分子量的分子、蛋白和大多数游离mRNA( 0.9MDa)留在上清液中。将沉淀 的TC溶解于冰冷的缓冲液(50mM Mg2+)中。使用已经含有与体外翻译的MLV逆转录酶相连 的mRNA的经纯化三元复合物(取< 3 X IO9个分子)来制备逆转录反应混合物，该逆转录 反应混合物补充有用于RT反应的外部dNTP组和引物。对冰冷的RT反应混合物进行乳化， 产生 1 X 101°个大小为 2 μ m的油包水区室。为了进行RT反应，对乳化RT反应混合物 (低于一个TC(mRNA+MLV RT) /区室)于42°C下温育1小时。区室化RT反应混合物的温度 升高后，大多数TC解离，释放mRNA和逆转录酶。仅在含有活性MLV逆转录酶(MLV_pD)的 区室中才进行成功的RT反应，在具有失活逆转录酶(del_pD)的区室中未合成cDNA。随后 的PCR确保了所合成的cDNA的扩增，并且观察到活性逆转录酶(MLV_pD)基因相对于失活 逆转录酶(del_pD)的富集。方法和材料通过对pET型质粒的T7聚合酶启动子和Siine-Dalgamo序列区域进行修饰，并 且插入具有N末端His-标签(SEQ ID No 1的258-30 和与甘氨酸-丝氨酸(gs)连接 子(SEQ ID No 1的2364-2393)、来自λ噬菌体的蛋白D的部分(pD) (SEQ ID No 1的 2394-2669)和第二甘氨酸-丝氨酸(gs)连接子(SEQ ID No 1的沈70_2759)融合的C末 端的MLV H+逆转录酶编码序列(SEQ ID No 1的306-2363)，构建起始质粒pET_his_MLV_ pD(SEQ ID No :1和图幻。N末端His-标签用于蛋白表达纯化。在蛋白体外翻译和形成 mRNA-核糖体-MLV (tRNA)三元复合物期间C末端融合必须保留在核糖体隧道中。M-MuLV逆转录酶具有两种主要的酶促活性RNA依赖性DNA聚合酶和RNA酶H。导 入点突变D583N(在质粒pET_his_MLV_pD，SEQ ID No :1中的2055位处单核苷酸G交换为 A)使逆转录酶RNA酶H活性关闭。天冬氨酸583位于RNA酶H活性位点，参与Mg离子结合 并且对于RNA酶H活性是关键的。新质粒鉴定为pET_his_MLV_D583N_pD，并进一步用于下 一质粒pET_his_del_pD(SEQ ID No 2)的构建，所述下一质粒编码失活的逆转录酶。用限 制性内切核酸酶XmaJI (识别序列C丨CTAGG-SEQ ID No 1的1047和1218位)消化质粒 pET_his_MLV_D583N_pD。除去长度为171bp的基因片段，使经消化的质粒自连接，产生pET_ his_del_pD(SEQ IDNo :2)，pET_his_del_pD编码缩短171个核苷酸或57个氨基酸的逆转 录酶基因，在蛋白翻译框上未发生移码。重要的是使得相同的逆转录酶基因具有以下特征1)长度缩短(用于容易PCR检 测)；幻失活(实验上确认聚合酶结构域中的57个氨基酸的缺失使聚合酶活性完全失活， 以及突变D583N使RNA酶H活性失活)和幻没有移码(任何移码会导致终止密码子的出 现，这与核糖体展示形式不相容)。用于体外转录的PCR片段的制备。在冰上制备PCR混合物20 μ 1-10Χ具有 KCl 的 Taq 缓冲液(Fermentas) ； 20 μ l-2mM 的各 dNTP (Fermentas)； 12 μ l-25mMMgCl2 (Fermentas) ； 16 μ 1-DMS0 (D8418_Sigma) ；4 μ I-Iu/ μ 1 LC (重 组 Raq DNA 聚合酶(Fermentas) ；1 μ 1-100 μ M pro-pIVEX 弓丨物(SEQ ID No :3)； 1 μ 1-100 μ MpD-ter 引物(SEQ ID No :4) ；122 μ 1 水-将混合物分成 2χ 98 μ 1 的两试管。 向 2χ 98 μ 1 PCR主混合物(master mix)中添力卩 2 μ 1 pET_his_MLV_pD (稀释到 lng/μ 1) 或2 μ lpET_his_del_pD (稀释到 lng/ μ 1)。循环方案为在94°C下进行起始变性步骤3 分钟，30个循环(94°C下45秒钟，53°C下45秒钟和72°C下2分钟)和最后在72°C下延伸 5分钟。从2ng质粒(7873bp)至 5 μ g(50ng/ μ 1)扩增产物(对于pET_his_MLV_pD为 2702bp PCR 片段；对于 pET_his_del_pD 为 2531bp PCR 片段)，扩增了 7000 倍。制备转录混合物40 μ 1-5χ Τ7转录缓冲液(ρΗ为7. 6的IM HEPES-K0H ； 150mM乙 酸镁；IOmM 亚精胺；0. 2M DTT) ；56 μ l_25mM 各 NTP (Fermentas) ；8μ l-20u/y 1 I7RNA 聚合 酶(Fermentas) ；4 μ l-40u/y 1 RiboLock RNA 酶抑制剂(Fermentas) ；52 μ 1 不含核酸酶的 水-将混合物分成h 80 μ 1的两试管，并且添加20 μ l-50ng/ μ 1的MLV_pD (pro-pIVEX// pD-ter)或 20 μ l-50ng/ μ 1 的 del_pD (pro-pIVEX//pD_ter) PCR 混合物。转录在 37°C下进 行3小时。用冰冷的不含核酸酶的水将两种转录混合物都稀释到200 μ 1，并且添加200 μ 16Μ LiCl溶液。将混合物在+4°C下温育30分钟，在+4°C下于冷却的离心机中以最大速度 (25' OOOg)离心30分钟。弃去上清液，用500 μ 1冰冷的75%乙醇洗涤RNA团块。再次将 试管在+4°C下于冷却的离心机中以最大速度离心5分钟，并弃去上清液。在室温下对RNA 团块进行干燥12分钟，并随后通过在+4°C和1400rpm下振摇15分钟使其再悬浮于200 μ 1 不含核酸酶的冰冷水中。再次将试管在+4°C下于冷却的离心机中以最大速度离心5分钟， 从而分离未溶解的RNA。将约180 μ 1的上清液移到具有20 μ 1 10XDNA酶I缓冲液(Mg2+) (Fermentas) ；1μ I-Iu/μ 1 的 DNA 酶 I (不含 RNA 酶)(Fermentas)的新试管中，并且在 37 °C 下温育20分钟，从而降解DNA。向各试管添加20 μ 1 ρΗ为5. 0的3Μ乙酸钠溶液和500 μ 1 冰冷的96%乙醇。最后通过在_20°C下温育30分钟，并在+4°C下于冷却的离心机中以最大 速度(25 ‘ OOOg)离心30分钟使RNA沉淀。弃去上清液，用500 μ 1冰冷的75 %乙醇洗涤 RNA团块。再次将试管在+4°C下于冷却的离心机中以最大速度离心5分钟，并弃去上清液。 在室温下对RNA团块进行干燥12分钟，并随后通过在+4°C和1400rpm下振摇15分钟使其 再悬浮于43 μ 1不含核酸酶的冰冷水中。将RNA溶液等分为虹10μ1，并用液氮冷冻。分 光光度法测定mRNA的浓度，并在使用RiboRuler RNA Ladder，高范围(i^ermentas)的琼 脂糖凝胶上进行复核 _MLV_pD mRNA 1. 2 μ g/ μ 1 ； del_pD mRNA 1. 2 μ g/ μ 1。将经纯化mRNA以1 50 = MLV (活性RT) de 1 (失活RT)的比例混合。将 MLV_pD mRNA 稀释 25 倍至 48ng/ μ 1，使 1 μ 1 ( 48ng)与 2 μ 1 1· 2 μ g/ μ 1 的 del_ pDmRNA(2. 4yg)混合，得到 0. 8 μ g/μ 1比例为1 50的mRNA混合物。使用两种翻译系统 RTS 100 大肠杆菌 HY 试剂盒(03186148001-Roche)和合成型 WakoPURE (295-59503-ffako) 进行体外翻译。给出蛋白翻译序列，对于MLV_pD为SEQ ID No :6，对于del_pD为SEQ ID No :7。用于RTS HY系统的翻译混合物(25 μ 1) :6 μ 1_大肠杆菌裂解物(Roche)； 5 μ 1-反应混合物(Roche) ；6 μ 1-氨基酸(Roche) ；0. 5 μ I-IOOmM 蛋氨酸(Roche)；0.5μ l-40u/y IRiboLock RNA 酶抑制剂(Fermentas) ；0.4 μ 1-200 μ M assrA 寡核苷酸 (SEQ ID No 5) ；0. 25 μ I-IM DTT ；2. 5μ 1 重建缓冲液(Roche) ；2. 5μ 1 不含核酸酶的水和1.5 μ 1-0. 8 μ g/ μ ImRNA 混合物 1 50 = MLV_pD del_pD ( 1200ng)。在 30°C下进行 体外翻译20分钟。用于WakoPURE系统的翻译混合物(25 μ 1) :12. 5 μ I-A溶液(Wako) ；5 μ I-B溶液 (Wako) ；0. 5μ l-40u/y 1 RiboLock RNA 酶抑制剂(Fermentas) ；0.4 μ 1-200 μ M α ssrA 寡 核苷酸(SEQ ID No 6) ；0. 25 μ I-IM DTT ；5 μ 1 不含核酸酶的水和 1. 5 μ 1-0. 8 μ g/μ ImRNA 混合物1 50 = MLV_pD del_pD( 1200ng)。在37°C下进行体外翻译30分钟。通过添加155 μ 1冰冷的终止缓冲液WBK5QQ+DTT+triton (25°C下pH为7. 5的50mM tris-乙酸盐(tris-acetate) ；50mM NaCl ；50mM 乙酸镁；5OOmM KCl ；IOmMDTT ；0. 1% (ν/ ν) -triton χ-100 (T8787-Sigma))并在+4°C和25' OOOg下离心5分钟来终止两个翻译体 系( 25 μ 1)。非常仔细地将160 μ 1经离心的翻译混合物移液到840 μ 135% (w/v)蔗糖 在 WBK5(l(l+DTT+triton 中的溶液(50mM在 25°C下 pH为 7. 5 的 tris-乙酸盐；50mM NaCl ；50mM 乙酸镁；500mM KCl ；IOmM DTT ；0. 1% (v/v)-triton x-100 (T8787_Sigma) ；35% (w/v)-蔗 糖(84097-Fluka))的顶部。为了对mRNA-核糖体-蛋白(tRNA)的三元复合物(TC)进行 纯化，使用TL-IOOBeckman超速离心机；TLA100. 2固定角转头(Beckman)；透明的Iml超速 离心管C343778-Beckman)在+4°C和100' OOOrpm下进行超速离心9分钟。为了将小的透 明TC团块保持在超速离心管的底部，小心地处理完整的试管。最初从离心管的最上部除去 750 μ 1溶液。然后(非常仔细地)用750 μ 1 WBK5QQ(50mM在25°C下pH为7. 5的tris-乙 酸盐；50mM NaCl ；50mM乙酸镁；500mM KCl)洗涤管壁。最后从离心管的最上部开始处除 去所有溶液，并且将团块溶解于30 μ 1冰冷的终止缓冲液WBK.+DTT+triton (50mM在25°C 下 pH 为 7· 5 的 tris-乙酸盐；50mM NaCl ；50mM 乙酸镁；500mM KCl ； IOmM DTT ；0. 1% (ν/ ν) -triton χ-100 (T8787_Sigma))中。如超速离心后使用放射性标记的mRNA所确定，5 %至30 %的输入的mRNA位于三元 复合物团块中。因此预期在30 μ 1缓冲液中具有低于360ng (翻译反应中所用的1200ngmRNA 的30 % )的mRNA ( Ung/ μ 1或9 X IO9个分子/ μ 1的三元复合物)。在冰上制备用于选择的逆转录反应混合物60 μ 1-5Χ用于逆转录酶的反应缓冲液 (Fermentas) ；7. 5 μ l-40u/y 1 RiboLock RNA 酶抑制剂(Fermentas) ； 15 μ 1-20 μ MpD_42 寡核苷酸(SEQ ID No 8) ； 188 μ 1不含核酸酶的水-将混合物分成h 135 μ 1的两试管， 添加0. 9 μ 1经纯化的TC (< 8 X IO9个分子)(在Roche-RTS HY试剂盒中翻译)或0. 9 μ 1 经纯化的TC (< 8 X IO9个分子)(在Wako-WakoPURE翻译)。将各反应混合物( 135 μ 1) 再次分成45 μ 1和90 μ 1的两试管。向第一部分-45 μ 1的RT混合物中添加5 μ 1不含核 酸酶的水。认为该样品为阴性选择对照(无dNTP)，和必须证明在反应混合物中无DNA污 染，并且cDNA合成与来自三元复合物中的MLV RT的逆转录酶功能活性严格关联。向第 二部分-90 μ 1的RT混合物中添加10 μ I-IOmM各dNTP混合物(Fermentas)，并且将反应 混合物再次分为用于选择对照的50 μ 1和用于阳性选择对照的补充有1 μ 1-200ιι/μ 1的 RevertAid H-M-MuLV逆转录酶(Fermentas)的50 μ 1两试管。根据所述方案，各逆转录反 应混合物在50 μ 1体积中含有< 2. 7X IO9个分子的三元复合物。通过将ABILEM 90 (Goldschmidt)混入矿物油(M5904_Sigma)至终浓度4% (ν/ν)22来制备乳化用油类表面活性剂混合物((ihadessy和HolIiger，2004 ；US2005064460)。通过 将950 μ 1油类表面活性剂与50 μ 1 RT混合物混合在+4°C下在5ml冷冻小瓶(cryogenic vial) (430492-Corning)中制备乳液。使用速度控制在 2100rpm的MS-3000磁力搅拌器、 具有中心环的R0tilabo -(3x8mm)磁性随动装置(1489. 2-Roth)进行混合；每30秒钟向水 相添加10 μ 1等分试样，继续混合另外2分钟(总混合时间-4分钟)。根据光学显微镜数 据，本发明乳液中的区室大小为0. 5 μ m 10 μ m，平均直径为 2 μ m。因此预期对50 μ 1 逆转录反应混合物进行乳化后具有 1 X IO10个油包水区室，含有低于2. 7 X IO9个分子的 三元复合物(每3至4个区室约1个mRNA和逆转录酶分子)。对所有6种乳液在+42°C下温育一小时，所述6种乳液代表在Roche-RTS HY试 剂盒中翻译的具有TC的RT混合物(阴性选择对照、选择对照和阳性选择对照)和在 Wako-WakoPURE中翻译的具有TC的RT混合物(阴性选择对照、选择对照和阳性选择对照)。为了回收反应混合物，将乳液移至1. 5ml的试管，在室温和25' OOOg下离心1分 钟。除去油相，在试管底部留下浓缩(但仍完整)的乳液，并添加250μ 1 PB缓冲液(Qiagen PCR纯化试剂盒)。最后通过用0. 9ml水饱和的醚提取；0. 9ml水饱和的乙酸乙酯(为了除 去ABIL EM 90洗涤剂)提取；并再次用0. 9ml水饱和的醚提取将乳液破乳。在室温下于真 空中对水相干燥5分钟。对所合成的cDNA用Qiagen PCR纯化试剂盒进行纯化，并在30 μ 1 EB缓冲液Oliagen PCR纯化试剂盒)中洗脱。通过巢式PCR进行cDNA的扩增。在冰上制备起始的PCR混合物 16 μ 1-10Χ 具有 KCl 的 Taq 缓冲液(Fermentas) ；16 μ l_2mM 的各 dNTP (Fermentas)； 9. 6 μ l-25mMMgCl2 (Fermentas) ；3. 2 μ I-Iu/ μ 1 LC (重组)Taq DNA 聚合酶(Fermentas)； 0. 8μ 1-100 μ M RD_Nde 引物(SEQ ID No :9) ；0· 8 μ 1-100 μ M pD_55 引物(SEQ ID No 10)； 74 μ 1 7jC -将混合物分成6个15 μ 1的样品(6x15 μ 1)禾口 30 μ 1的样品。向6χ 15 μ 1 PCR 主混合物中添加5 μ 1 cDNA (RT样品1至6)；向30 μ 1 PCR主混合物中添加9 μ 1水，并再 次将混合物分成h 19. 5 μ 1的两试管以用于阴性PCR对照(加0. 5 μ 1水)和阳性PCR对 照(力卩 0. 5 μ l-pET_his_MLV_pD 和 pET_his_del_pD 质粒的 1 1 混合物( Ing))。循 环方案为在94。°C下进行起始变性步骤3分钟，25个循环(94°C下45秒钟，58°C下45秒 钟和72°C下2分钟)和最后在72°C下延伸5分钟。对于MLV_pD，PCR片段的预期长度是 2185bp，对于del_pD是2014bp。在每孔加载10 μ 1 PCR混合物的1 %琼脂糖凝胶上对扩增 分进行析。使用两组不同的引物进行巢式PCR，导致部分基因扩增(以更好的分辨RT样品中 的MLV del cDN比例)或全基因扩增(以证明全基因恢复的可能性)。在冰上制备用于部分基因扩增的巢式PCR混合物 μ 1-10Χ具有KCl的Taq缓 冲液(Fermentas) ；28 μ l_2mM 的各 dNTP(Fermentas) ； 16. 8 μ l-25mM MgCl2(Fermentas)； 5. 6 μ I-Iu/μ 1 LC (重组 Raq DNA 聚合酶(Fermentas) ； 1. 4 μ 1-100 μ MM_F 引物(SEQ ID No 11) ； 1· 4 μ 1-100 μ M M_2R 引物(SEQ ID No :12) ； 185 μ 1 水-将混合物分成 2x 19 μ 1 和6χ 38 μ 1。向2χ 19 μ 1的PCR主混合物中添加1 μ 1第一次PCR物的阳性对照或阴性对 照(引物组RD_Nde//pD_55) -30个PCR循环扩增；向6x38 μ 1的PCR主混合物中添加2 μ 1 第一次PCR(引物组RD_Nde//pD_55)(样品1至6)-将各样品再次分成h 20 μ 1的两部分 以用于23或30个PCR循环扩增。循环方案为在94°C下进行起始变性步骤3分钟，23或30个循环(94°C下45秒钟，57°C下45秒钟和72°C下1分钟)和最后在72°C下延伸5分钟。 对于MLV_pD，PCR片段的预期长度是907bp，对于del_pD是73^ρ。在每孔加载10 μ 1 PCR 混合物的琼脂糖凝胶上对扩增进行分析(图4)。在冰上制备用于全基因扩增的巢式PCR混合物 μ 1-10Χ具有KCl的Taq缓 冲液(Fermentas) ；28μ1-2πιΜ 各 dNTP (Fermentas) ； 16. 8 μ l-25mM MgCl2 (Fermentas)； 5. 6 μ I-Iu/μ 1 LC (重组 Raq DNA 聚合酶(Fermentas) ； 1. 4 μ 1-100 μ MM_Esp 引物(SEQ ID No 13) ；1. 4μ 1-ΙΟΟμΜ M_Eri 引物(SEQ ID No :14) ； 185 μ 1 水-将混合物分成 2x 19 μ 1禾口 6x 38 μ 1。向2χ 19 μ 1 PCR主混合物中添加1 μ 1第-次PCR物的阳性或阴性对 照(引物组RD_Nde//pD_55) -30个PCR循环扩增；向6x 38 μ IPCR主混合物中添加2 μ 1首 次PCR(引物组RD_Nde//pD_55)(样品1至6)-将各样品再次分成h 20 μ 1的两部分以用 于23或30个PCR循环扩增。循环方案为在94°C下进行起始变性步骤3分钟，23或30个 循环(94°C下45秒钟，55°C下45秒钟和72°C下2分钟)和最后在72°C下延伸5分钟。对 于MLV_pD，PCR片段的预期长度是2077bp，对于del_pD是1906bp。在每孔加载10 μ 1 PCR 混合物的琼脂糖凝胶上对扩增进行分析(图5)。结果为了证明区室化核糖体展示(CRD)法的原理验证，使用与蛋白D间隔子融合的编 码活性(MLV)和失活(del)逆转录酶的两种mRNA的1 50 = MLV del起始混合物进行 选择。使用两种不同的翻译系统Roche-RTS 100大肠杆菌HY或Wako-WakoPURE进行体外 翻译，以了解在本发明的实验方案中哪一种翻译系统更好。对于各翻译系统进行三种区室 化RT反应无dNTP的阴性选择对照，其需要证明在反应混合物中无DNA污染；选择对照，其 需要证明编码活性(MLV)逆转录酶的基因相对于编码失活酶(del)的基因的富集，原因在 于仅活性酶可以合成cDNA ；以及补充有外部RevertAidH-商业逆转录酶的阳性选择对照， 其必须充当在所有区室中合成来自MLV_pD和del_pD mRNA的cDNA的阳性RT对照，以表明 不施加选择压力时反应混合物中基因的真实比例。通过巢式PCR对合成的cDNA进行扩增。起始PCR(25个循环)的琼脂糖凝胶电泳 图像(图3)仅在两个阳性选择对照(翻译系统-Roche和Wako)的情况下显示了弱的PCR 片段带。这是正常的，原因在于这些样品含有外部RT酶，该酶与每区室含有仅一个体外合 成的逆转录酶分子的反应相比，合成cDNA的效率高得多。巢式PCR(部分基因扩增)琼脂糖凝胶电泳的图像示于图4。23和30个PCR循环后扩增结果一致1)在阴性选择对照(w/o dNTP)中无扩增(无DNA污染)；2)在阳性选择对照(外部RT酶)中观察到del_pD cDNA(736bp DNA片段)的非 常有效的扩增，并且未见到MLV_pD cDNA的扩增，原因在于MLV_pD与del_pDmRNA的起始比 例为1 50 ；3)在选择对照的情况下观察到cDNA MLV_pD (907bp DNA片段)和del_pD (736bp DNA片段)的扩增；4)在由Roche体外翻译系统所合成的逆转录酶的情况下观察到 1 1的MLV_ PD del_pD的比例，这意味着MLV_pD基因相对于del_pD基因从起始的1 50比例开始 富集了 50倍；
5)在由Wako体外翻译系统所合成的逆转录酶的情况下观察到 1 3的MLV_ PD del_pD的比例，这意味着MLV_pD基因相对于del_pD基因从起始的1 50比例开始 富集了 16倍；巢式PCR(全基因扩增)琼脂糖凝胶电泳的图像示于图5。在23和30个PCR循环 的结果之间，以及与用于部分基因扩增的巢式PCR(图5)的结果相比，23和30个PCR循环 后的扩增结果一致1)在阴性选择对照(w/o dNTP)中无扩增(无DNA污染)；2)在阳性选择对照(外部RT酶)中观察到del_pD cDNA(1906bp DNA片段)的非 常有效的扩增，并且未见到MLV_pD cDNA的扩增，原因在于MLV_pD与del_pDmRNA的起始比 例为1 50 ；3)在选择对照的情况下观察到cDNA MLV_pD (2077bp DNA片段)和del_pD (1906bp DNA片段)的扩增；4)在全基因扩增的情况下难以确定MLV_pD del_pD的比例，原因在于 2077bp (MLV_pD)和1906bp (del_pD) DNA片段之间的相对差不够大，但是通常比例与用于部 分基因扩增的巢式PCR的结果相似。作为该实施例的结果，可以总结出在以CRD形式进行的逆转录反应期间，相对于 编码失活酶的基因富集了编码活性MLV逆转录酶的基因，在Roche翻译系统的情况下富集 倍数为50，在用于体外合成酶的Wako翻译系统的情况下富集倍数为16。实施例2-CRD-选择在更高温度下性能改善的逆转录酶为了了解区室化核糖体展示(CRD)选择如何有效地起作用，进行莫洛尼氏鼠白血 病病毒逆转录酶(M-MuLV RT)的进化实验。实验的一般流程图示于图6。通过使用核苷酸 类似物dPTP和8-氧-dGTP的易错PCR构建逆转录酶的起始突变体文库。进行全基因( 2kb)诱变，每个基因引入2至3个核苷酸或1至2个氨基酸突变。使用编码逆转录酶(与蛋 白D融合)MLV_pD的突变体文库的PCR片段来合成mRNA。经纯化的mRNA用于体外翻译反 应。在翻译混合物中形成mRNA-核糖体-MLV_pD (tRNA)的三元复合物(TC)，并通过低温和 高浓度的Mg2+离子将其稳定。通过蔗糖垫超速离心对TC的混合物进行纯化。将沉淀的TC 溶解于冰冷的缓冲液(50mMMg2+)中并用于制备逆转录反应混合物，该逆转录反应混合物补 充有用于RT反应的外部dNTP组和引物。对冰冷的RT反应混合物进行乳化，产生 1X 101° 个大小为 2μπι的油包水区室。MLV RT的最适反应温度是 42°C。为了选择在更高温度 下工作更好的逆转录酶变体，使乳化RT反应混合物(低于一个TC (mRNA+MLV RT) /区室) 于50°C下温育1小时。在该温度下在含有更具活性或热稳定性的MLV逆转录酶变体的区室 中，全长cDNA的成功合成进行地更好。随后的PCR用于扩增全长cDNA，并进行更具活性和 热稳定性的逆转录酶基因的富集。通过PCR，将扩增的基因回复到CRD形式，通过连接-PCR 恢复完整的5'(起始片段-T7聚合酶启动子、SD和his-标签编码序列)和3'(末端片 段_gs连接子、蛋白D和第二 gs连接子)序列。含有逆转录酶基因的富集文库的重建PCR片段用于随后的mRNA转录和下一轮 CRD选择。以温度越来越高的RT反应进行各轮选择50°C (第一轮)；52.5°C (第二轮)； 550C (第三轮)；57. 50C (第四轮)和60°C (第五轮)。将第五轮选择后逆转录酶基因的扩增文库(无C末端pD连接子)克隆到质粒载体。对个体克隆进行测序和分析。使用亲和色谱通过his-标签对进化蛋白以及个体突变 体的库进行纯化。确定37°C、50°C下MLV逆转录酶的比活性和在50°C下酶温育5分钟后在 37°C下的残留活性。方法和材料使用起始质粒pET_his_MLV_pD(SEQ ID No :1和图2、作为易错PCR的起始材料。 使用核苷酸类似物dPTP和8-氧-dGTP引入突变。在冰上制备用于易错PCR的PCR混合物 10 μ 1-10Χ 含有 KCl 的 Taq 缓冲液(Fermentas) ；10 μ l_2mM 各 dNTP (Fermentas) ；6μ l-25mM MgCl2 (Fermentas) ；2 μ I-Iu/ μ 1 LC (重组)Taq DNA 聚合酶(Fermentas) ；0. 5 μ 1-100 μ M M_Esp 弓 I 物(SEQ ID No :13) ；0. 5μ 1-100 μ MM_Eri 弓 | 物(SEQ ID No :14) ；1 μ 1—10 μ M dPTP (TriLink BioTechnolgies) ；5 μ 1-100 μΜ8-氧-dGTP(TriLink BioTechnolgies)； 3. 75μ l-40ng/y 1 (总共 150ng)的 pET_his_MLV_pD 质粒；61. 25 μ 1 水。循环方案为在 94°C下进行起始变性步骤3分钟，30个循环(94°C下30秒钟，55°C下30秒钟和72°C下2 分钟)和最后在72°C下延伸5分钟。从150ng质粒(787;3bp)到 6至12 μ g的扩增产 物(对于 pET_his_MLV_pD 为 2077bp PCR 片段)，扩增了 150 至 300 倍。使用 Qiagen PCR 纯化试剂盒对PCR片段进行纯化，用Esp3I (识别序列CGTCTC (1/5))和EcoRI (识别序列 G I AATTC)进行消化，最后使用Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中进行纯化，得到的 DNA浓度为 50ng/y 1。通过对亚克隆回用NcoI和EcoRI消化的起始pET_his_MLV_pD质粒中的个体克隆 进行测序，从而检查突变发生效率和文库质量。据预期突变随机分布在整个MLVRT基因的 扩增序列中(附录1)。在10个测序基因中，发现23个核苷酸突变(1个颠换、20个转换、 2个缺失-在附录1中用红色标记)，产生15个氨基酸交换、6个沉默突变、1个终止密码子 和2个编码框的移码-平均每个基因1至2个氨基酸取代。将突变文库与起始片段(M4bp)和末端片段(398bp)连接，从而获得适合CRD选 择的PCR片段(图7)。通过对最初的983bp起始片段(靶-质粒pET_his_del_pD(SEQ IDNo :2)、引物-pro-pIVEX(SEQ ID No :3)禾口M_1R(SEQ ID No 15))进行的PCR扩增和随后 用NcoI (识别序列C丨CATGG)进行的消化，构建起始片段(含有T7聚合酶启动子、SD和 his-标签编码序列)，获得M4bp的DNA片段。通过对最初的1039bp末端片段(靶-质粒 pET_his_del_pD(SEQ ID No :2)、引物 _M_3F (SEQ ID No :16)和 pD_ter(SEQ ID No :4))的 进行PCR扩增和随后用EcoRI (识别序列G丨AATTC)进行的消化，构建末端片段(含有gs 连接子、蛋白D和第二 gs连接子序列)，获得398bp的DNA片段。在室温下制备连接反应物(150μ1) :15111_1(^用于1140嫩连接酶的连接 缓冲液(Fermentas) ； 15 μ I-Iu/μ 1 T4DNA 连接酶(Fermentas) ；26 μ l-50ng/ μ 1 用 Esp3I (NcoI相容末端)和EcoRI消化的突变MLV RT文库( 1300ng或 5. 9 X IO11 个分子)；9· 4 μ l-35ng/ μ 1用NcoI消化的起始片段( 329ng或 1. 2 X IO12个分 子)；15. 7μ l-;35ng/y 1用EcoRI消化的末端片段( M8ng或 1.2X1012个分子)； 68. 9 μ 1-水。在+4°C下进行连接过夜。将反应混合物用苯酚处理1次，并用氯仿处理2次， 使其沉淀并溶解于53 μ 1的水。比较连接混合物和已知量的质粒pET_his_MLV_pD的扩增 效率，确定连接产率为约 20%。考虑到20%的连接产率，将MLV RT突变体文库的多样性 定为 1.2 X IO11个分子(50 μ
通过PCR扩增连接的MLV RT文库(Iml-在冰上制备)100 μ 1-10Χ含有KCl的 Taq 缓冲液(Fermentas) ； 100 μ l_2mM 各 dNTP (Fermentas) ；60 μ l-25mMMgCl2 (Fermentas)； 80 μ 1-DMS0 (D8418-Sigma) ；20 μ I-Iu/μ 1 LC (重组)Taq DNA 聚合酶(Fermentas)；5μ 1-100 μ M pro-pIVEX 引物(SEQ ID No :3) ；5 μ 1-100 μ MpD-ter-引物(SEQ ID No :17)； 20 μ 1-连接的MLV RT文库( 5X101Q个分子)；610μ1-水。循环方案为在94°C下进 行起始变性步骤3分钟，15个循环(94°C下30秒钟，53°C下30秒钟和72°C下3分钟)和最 后在72°C下延伸5分钟。从 5X 101°个分子(相当于 150ng)的大小为2702bp的最终 连接片段至 30yg(30ng/y 1)的扩增产物Q702bp PCR片段)，扩增了 200倍。第1轮选择制备转录混合物(100 μ 1) 20 μ 1_5χ Τ7转录缓冲液(ρΗ为7. 6的1MHEPES-K0H ； 150mM 乙酸镁；IOmM 亚精胺；0. 2M DTT) ；28 μ l_25mM 各 NTP(Fermentas) ；4 μ l_20u/ μ 1 I7RNA 聚合酶(Fermentas) ；2 μ l-40u/y 1 RiboLock RNA 酶抑制剂(Fermentas)； 30 μ l-30ng/ μ 1 突变体文库(pro-pIVEX//pD-ter-)PCR 混合物( 900ng 或 3 X IO11 个 分子)；16 μ 1不含核酸酶的水。在37°C下转录进行3小时(文库多样性 5Χ101(Ι个分 子)。用冰冷的不含核酸酶的水将转录混合物稀释到200μ 1，并添加200μ 1 6Μ LiCl溶液。将混合物在+4°C下温育30分钟，在+4°C下于冷却的离心机中以最大速度 (25' OOOg)离心30分钟。弃去上清液，用500 μ 1冰冷的75%乙醇洗涤RNA团块。再次将 试管在+4°C下于冷却的离心机中以最大速度离心5分钟，并弃去上清液。在室温下对RNA 团块进行干燥12分钟，并随后通过在+4°C和1400rpm下振摇15分钟使其再悬浮于200 μ 1 不含核酸酶的冰冷的水中。再次将管在+4°C下于冷却的离心机中以最大速度离心5分钟， 从而分离未溶解的RNA。将约180 μ 1的上清液移到具有20 μ 1 10XDNA酶I缓冲液(Mg2+) (Fermentas) ；1μ I-Iu/μ 1 的 DNA 酶 I (不含 RNA 酶)(Fermentas)的新试管中，并且在 37 °C 下温育30分钟，从而降解DNA。向反应混合物添加20 μ 1 ρΗ为5.0的3Μ乙酸钠溶液和 500 μ 1冰冷的96%乙醇。最后通过在-20°c下温育30分钟，并在+4°C下于冷却的的离心机 中以最大速度(25 ‘ OOOg)离心30分钟使RNA沉淀。弃去上清液，用500 μ 1冰冷的75% 乙醇洗涤RNA团块。再次将管在+4°C下于冷却的离心机中以最大速度离心5分钟，并弃去 上清液。在室温下对RNA团块进行干燥12分钟，并随后通过在+4°C和1400rpm下振摇10 分钟再悬浮于33 μ 1不含核酸酶的冰冷的水中。将RNA溶液等分为3χ 10μ1，并用液氮冷 冻。分光光度法测定mRNA的浓度，并在使用RiboRuler RNA Ladder，高范围(i^ermentas) 的琼脂糖凝胶上进行复核-MLV RT文库mRNA-2. 1 μ g/ μ 1。使用RTS 100大肠杆菌HY(03186148001-Roche)翻译系统进行体外翻译(25μ 1)6μ 1-大肠杆菌裂解物(Roche) ；5 μ 1-反应混合物(Roche) ；6 μ 1_氨基酸(Roche)； 0. 5μ I-IOOmM 蛋氨酸(Roche) ；0. 5μ l-40u/ μ 1 RiboLock RNA 酶抑制剂(Fermentas)； 0. 4 μ l-200uM assrA 寡核苷酸(SEQ ID No 5) ；0. 25 μ I-IM DTT ；3 μ 1 重组缓冲液 (Roche) ；2. 5μ 1 不含核酸酶的水和 0. 6 μ 1-2. 1 μ g/ μ 1 mRNA (_1200ng)。在 30°C 下使反 应混合物温育20分钟。通过添加155 μ 1冰冷的终止缓冲液WBK5(1(1+DTT+triton(25°C下 PH 为 7. 5 的 50mM tris-乙酸盐；50mM NaCl ；50mM 乙酸镁；500mM KCl ；IOmM DTT ；0. 1 % (v/v) -triton χ-100 (T8787_Sigma))来终止翻译，并在 +4°C和 25' OOOg 下离心 5 分钟来27终止翻译。非常仔细地将160 μ 1经离心的翻译混合物移液到840 μ 1 35% (w/v)蔗糖在 WBKsoo+DTT+triton 中的 35% (w/v)蔗糖溶液(50mM在 25°C下 pH 为 7. 5 的 tris-乙酸盐； 50mM NaCl ；50mM 乙酸镁；500mMKCl ； IOmM DTT ；0. 1% (v/v) -triton χ-100 (T8787_Sigma)； 35% (w/v)-蔗糖(84097-Fluka))的顶部。为了对mRNA-核糖体-MLV(tRNA)的三元复合 物(TC)进行纯化，使用TL-IOOBeckman超速离心机、TLA100. 2固定角转头(Beckman)、透明 的Iml超速离心管C343778-Beckman)在+4°C和100，OOOrpm下进行超速离心9分钟。为了 将小的透明TC团块保持在超速离心管的底部，小心地处理完整的试管。最初从离心管的最 上部除去750 μ 1溶液。然后(非常仔细地)用750 μ 1 WBK5QQ(50mM在25°C下pH为7. 5的 tris-乙酸盐；50mM NaCl ；50mM乙酸镁；500mM KCl)洗涤管壁。最后从离心管的最上部开 始除去所有溶液，并且将团块溶解于30 μ 1冰冷的终止缓冲液WBK5QQ+DTT+triton (50mM在 25°C下 pH 为 7. 5 的 tris-乙酸盐；50mM NaCl ；50mM 乙酸镁；500mM KCl ； IOmM DTT ；0. 1% (v/v) -triton χ-100 (T8787_Sigma))中。使用放射性标记的mRNA通过实验确定超速离心在三元复合物团块中得到输入 mRNA的5%至30%。因此据预测在30 μ 1缓冲液中具有低于360ng (翻译反应中所用的 1200ng mRNA的30% )的mRNA( l&ig/ μ 1或9X IO9个分子/ μ 1的三元复合物)。在冰上制备用于选择的逆转录反应混合物60 μ 1-5Χ用于逆转录酶的反应缓冲液 (Fermentas) ；7. 5 μ l-40u/y 1 RiboLock RNA 酶抑制剂(Fermentas) ； 15 μ 1-20 μ MpD_42 寡核苷酸(SEQ ID No 8) ；186μ 1不含核酸酶的水和1.8μ 1经纯化(< 1.8X IOltl个分 子)TC (在Roche-RTS HY试剂盒中翻译)。将反应混合物分成45 μ 1和225 μ 1的两试管。 向第一部分-45 μ 1的RT混合物中添加5 μ 1的不含核酸酶的水。该样品作为阴性选择对 照(无dNTP)，并且需要证明在反应混合物中无DNA污染，并且cDNA合成与来自三元复合 物中的MLV RT的逆转录酶功能活性严格关联。向第二部分_225μ1的RT混合物中添加 25 μ I-IOmM各dNTP混合物O^rmentas)，并且将反应混合物再次分为两试管用于选择 对照的200 μ 1 (4χ 50 μ 1)(总共< 1. 2X1010个分子的TC)和用于阳性选择对照的补充有 1 μ l-200u/y 1 的 RevertAid H-M-MuLV 逆转录酶(Fermentas)的 50 μ 1。根据方案，各逆 转录反应混合物在50 μ 1体积中含有< 3Χ109个分子的三元复合物。通过将ABILEM 90 (Goldschmidt)混入矿物油(M5904_Sigma)至终浓度4% (v/v) 来制备乳化用油-表面活性剂混合物(Ghadessy和Holliger，2004 ；US2005064460)。通过 将950 μ 1油-表面活性剂混合物与50 μ 1 RT混合物混合，从而在+4°C下在5ml冷冻小瓶 (cryogenic vial) (430492-Corning)中制备乳液。使用速度控制在 2100rpm 的 MS-3000 磁力搅拌器、具有中心环的R0tilab0 -(3X8mm)磁性随动装置(1489. 2-Roth)进行混合；每 30秒钟向水相添加10 μ 1等分试样，继续混合另外2分钟(总混合时间-4分钟)。根据光 学显微镜数据，本发明乳液中的区室大小为0. 5 μ m 10 μ m，平均直径为 2 μ m。因此据 预期对50 μ 1逆转录反应混合物进行乳化后具有 1 X 101°个油包水区室，含有低于3 X IO9 个分子的三元复合物(每3至4个区室约1个mRNA和逆转录酶分子)。使所有乳液在+50°C下温育1小时，以选择在更高温度下工作更好的逆转录酶变 体。为了回收反应混合物，将乳液移至1.5ml的试管，在室温和25' OOOg下离心10分钟。 除去油相，在试管底部留下浓缩(但仍完整)的乳液。通过用0. 9ml水饱和的醚提取；0. 9ml 水饱和的乙酸乙酯(为了除去ABIL EM 90洗涤剂)提取；并再次用0. 9ml水饱和的醚提取将乳液破乳。在室温下于真空中对水相进行干燥5分钟，并且添加250 μ 1的PB缓冲液 (Qiagen PCR纯化试剂盒)。将四个选择样品合并到两个试管中。用Qiagen PCR纯化试 剂盒将所合成的cDNA进一步纯化，并在阴性和阳性选择对照的情况下在30 μ 1 EB缓冲液 (Qiagen PCR纯化试剂盒)中洗脱，在选择对照的情况下用h 30 μ 1的EB缓冲液洗脱。通过巢式PCR进行cDNA的扩增。首先进行小PCR扩增，以检查阴性和阳性选择 对照，并确定对于选择样品中的cDNA进行有效扩增所需的PCR循环的最小数量。在冰上 制备 PCR 混合物 QOO μ 1) 20 μ 1-10Χ 含有 KCl 的 Taq 缓冲液(Fermentas) ；20 μ l_2mM 各 dNTP (Fermentas) ； 12 μ l_25mM MgCl2 (Fermentas) ；2. 5 μ I-Iu/μ ILC (重组)Taq DNA 聚合 酶(Fermentas) ；1 μ 1-2. 5u/μ 1 Pfu DNA 聚合酶(Fermentas) ；1 μ 1-100 μ M RD_Nde 弓丨物 (SEQ ID No 9) ；1μ 1-100 μ M pD_55 引物(SEQ ID No :10) ；50 μ 1_ 选择对照的纯化 cDNA ； 92μ1水。用于2185bp PCR片段的循环方案为在94°C下进行起始变性步骤3分钟，25个 循环(94°C下45秒钟，58°C下45秒钟和72°C下2分钟)和最后在72°C下延伸5分钟。在冰上制备用于全基因扩增的巢式PCR混合物(500 μ 1) 50 μ 1-10Χ含有KCl的 Taq 缓冲液(Fermentas) ；50 μ l_2mM各 dNTP (Fermentas) ；30 μ l-25mM MgCl2 (Fermentas)； 6. 25 μ I-Iu/ μ 1 LC (重组)iTaq DNA 聚合酶(Fermentas) ；2. 5 μ 1-2. 5u/ μ IPfu DNA 聚合 酶(Fermentas) ；2. 5 μ 1-100 μ M M_Esp 引物(SEQ ID No :13) ；2· 5 μ 1-100 μ M M_Eri 引物 (SEQ ID No 14) ；50 μ 1 第一次 PCR 物(引物组 RD_Nde//pD_55) ；306 μ 1 水。用于 2077bp PCR片段的循环方案为在94°C下进行起始变性步骤3分钟，22个循环(94°C下45秒钟， 55°C下45秒钟和72°C下2分钟)和最后在72°C下延伸5分钟。使用Qiagen凝胶提取试剂盒对选择样品的最终PCR片段进行琼脂糖凝胶纯化 (在60 μ 1中洗脱 50ng/ μ 1)。在37°C下用EcoRI和Esp3I对经纯化的PCR片段消化1 小时，并再次进行琼脂糖-凝胶纯化(在30 μ 1中洗脱 50ng/ μ 1)。将第一轮选择后回收的MLV逆转录酶文库与起始片段和末端片段(在本实施例 中之前已描述构建)连接，从而获得适合第二轮CRD选择(图6)的PCR片段(图7)。在 室温下制备连接反应物(40 μ 1) :4μ 1-10Χ用于T4DNA连接酶的连接缓冲液O^rmentas)； 2 μ I-Iu/ μ 1 T4DNA 连接酶(Fermentas) ；4 μ l_50ng/ μ 1 用 Esp3I 和 EcoRI 消化的选择文 库( 200ng或0.9\10"个分子)；1. 1 μ l_:35ng/μ 1用NcoI消化的起始片段( !35ng 或 1. 5 X IO11分子)；1. 76μ l-35ng/y 1用EcoRI消化的末端片段( 61ng或 1. 5 X IO11 个分子)；27.2 μ 1-水。在室温下进行连接1小时。通过PCR对连接的MLV RT文库进行扩增(300 μ 1_在冰上制备) 30 μ 1-10Χ 含有 KCl 的 Taq 缓冲液(Fermentas) ；30 μ l-2mM 各 dNTP (Fermentas)； 18 μ l-25mMMgCl2 (Fermentas) ；24 μ 1-DMS0 (D8418_Sigma) ；3. 7 μ l-lu/μ 1 LC (重 组)TaqDNA 聚合酶(Fermentas) ；1. 5μ 1-2. 5u/μ 1 Pfu DNA 聚合酶(Fermentas)； 1· 5μ l-lOOyMpro-pIVEX 引物(SEQ ID No :3) ； 1· 5 μ 1-100 μ M pD-ter-引物(SEQ ID No: 17) ；25. 5 μ 1-连接的 MLV RT 文库( · 6 X 101° 个分子)；164. 3 μ 1_ 水。用于 2702bp PCR 片段的循环方案为在94°C下进行起始变性步骤3分钟，15个循环(94°C下45秒钟，53°C 下45秒钟和72°C下3分钟)和最后在72°C下延伸5分钟。使用Qiagen凝胶提取试剂盒 对PCR片段进行琼脂糖凝胶纯化(在30 μ 1中洗脱 IOOng/ μ 1)。第2轮选择
第2轮选择按照第1轮选择实验流程的一般设置进行，不同之处在于PCR循环、乳 化RT反应温度和几个其它细节上的微小改动。所有改动如下给出 转录-取10 μ I-IOOng/ μ 1 ( IOOOng)的琼脂糖凝胶纯化的PCR片段，第2轮 选择中所用的mRNA的终浓度为1. 5 μ g/ μ 1 ；·翻译-取 0. 8 μ 1-1. 5 μ g/ μ 1 ( 1. 2 μ g)的 mRNA ；·乳化RT反应在52. 5°C进行1小时；·第一次 PCR (RD_Nde//pD_55)-进行 24 个循环；·第二次(巢式)PCR(M_Esp//M_Eri)-进行 23 个循环；
·经消化PCR片段的终浓度-SOng/ μ 1 ；·连接-取200ng ( 0. 9 X IO11个分子)的MLV RT文库；· PCR(对连接混合物进行)_取< 0. 6X 101°个分子的经选择文库，并进行15个 PCR循环；最终琼脂糖凝胶纯化的PCR片段的浓度为200ng/y 1。第3轮选择第3轮选择按照第1轮选择实验流程的一般设置进行，不同之处在于PCR循环、乳 化RT反应温度和几个其它细节上的微小改动。所有改动如下给出 转录-取5μ l-200ng/y 1( IOOOng)的琼脂糖凝胶纯化的PCR片段，第3轮选 择中所用的mRNA的终浓度为1. 5 μ g/ μ 1 ；·翻译-取 0. 8 μ 1-1. 5 μ g/ μ 1 ( 1. 2 μ g)的 mRNA ；·乳化RT反应在55°C下进行1小时；·第一次 PCR (RD_Nde//pD_55)-进行 25 个循环；
·第二次(巢式)PCR (M_Esp//M_Eri)-进行 22 个循环；·经消化PCR片段的终浓度-70ng/ μ 1 ；·连接-取200ng ( 0. 9 X IO11个分子)的MLV RT文库；· PCR (对连接混合物进行)_取< 0. 6 X 101°个分子的所选择文库，并进行15个 PCR循环；最终琼脂糖凝胶纯化的PCR片段的浓度为lOOng/μ 1。第4轮选择第4轮选择按照第1轮选择实验流程的一般设置进行，不同之处在于PCR循环、乳 化RT反应温度和几个其它细节上的微小改动。所有改动如下给出 转录-取10 μ I-IOOng/ μ 1 ( IOOOng)的琼脂糖凝胶纯化的PCR片段，第4轮 选择中所用的mRNA的终浓度为1. 8 μ g/ μ 1 ；·翻译-取 0. 67 μ 1-1. 8 μ g/ μ 1 ( 1. 2 μ g)的 mRNA ；·乳化RT反应在57. 5°C下进行1小时；
·第一次 PCR (RD_Nde//pD_55)-进行 25 个循环；·第二次(巢式)PCR (M_Esp//M_Eri)-进行 M 个循环；·经消化PCR片段的终浓度-50ng/ μ 1 ；·连接-取200ng ( 0. 9 X IO11个分子)的MLV RT文库；
· PCR(对连接混合物进行)_取< 0. 6 X 1010个分子的所选择文库，并进行15个 PCR循环；最终琼脂糖凝胶纯化的PCR片段的浓度为lOOng/μ 1。第5轮选择第5轮选择按照第1轮选择实验流程的一般设置进行，不同之处在于PCR循环、乳 化RT反应温度和分析最终阶段上的一些改动。所有改动如下给出 转录-取10 μ I-IOOng/ μ 1 ( IOOOng)的琼脂糖凝胶纯化的PCR片段，第5轮 选择中所用的HlRNA的终浓度为1. 1 μ g/ μ 1 ；·翻译-取 1. 1 μ 1-1. 1 μ g/ μ 1 ( 1. 2 μ g)的 mRNA ；
·乳化RT反应在60 V下进行1小时；·第一次 PCR (RD_Nde//pD_55)-进行 25 个循环；·第二次(巢式)PCR (M_Esp//M_Eri)-进行 33 个循环；在冰上制备用于全基因扩增的巢式PCR混合物(500 μ 1) 50 μ 1-10Χ含有KCl的 Taq 缓冲液(Fermentas) ；50 μ l_2mM各 dNTP (Fermentas) ；30 μ l-25mM MgCl2 (Fermentas)； 6. 25 μ I-Iu/ μ 1 LC (重组)iTaq DNA 聚合酶(Fermentas) ；2. 5 μ 1-2. 5u/ μ 1 PfuDNA 聚合 酶(Fermentas) ；2. 5 μ 1-100 μ M M_Esp 引物(SEQ ID No :13) ；2· 5 μ 1-100 μ MM_Hind3+引 物(SEQ ID No 18) ；50 μ 1 的第一次 PCR 物(引物组 RD_Nde//pD_55) ；306 μ 1 水。用于 2077bp PCR片段的循环方案为在94°C下进行起始变性步骤3分钟，22个循环(94°C下45 秒钟，55°C下45秒钟和72°C下3分钟)和最后在72°C下延伸5分钟。使用Qiagen凝胶提取试剂盒对选择样品的最终PCR片段进行琼脂糖凝胶纯化 (在60 μ 1中洗脱 60ng/y 1)。经纯化的PCR片段在37°C下用HindIII和Esp3I消化1 小时，并再次进行琼脂糖凝胶纯化(在40 μ 1中洗脱 50ng/ μ 1)。将第5轮选择后将回收的MLV逆转录酶文库连接到从用NcoI和HindIII消化的 pET_his_MLV_pD(SEQ ID No:l和图2)制备的质粒载体中，得到编码MLV RT的新的7474bp 质粒pET_his_MLV (SEQ ID No 19)，该MLV RT具有N末端his-标签，并且在C末端上没有 PD融合以用于使用亲和色谱的快速蛋白纯化。将第5轮选择后的连接的MLV RT文库电穿孔到T7表达株ER2566中。对个体克隆 进行测序和分析。使在相同构建中进化蛋白的库以及个体突变体和初始WtM-MuLV逆转录 酶在200ml LB中生长至A590为 0. 7，并使用2ml Qiagen-Ni-NTASuperf low树脂利用his 标签进行纯化(根据供应商建议在天然条件下进行所有纯化)。在Iml EB(50mM-NaH2P04, 300mM-NaCl，pH为 8. 0 的 250mM-咪唑，10福-3-巯基乙醇和0. 1% triton X-100)中进行洗 脱。以 50 倍过量的贮存缓冲液(50mM Tris-HCl (在 25°C下 pH 8. 3) ,0. IM NaCl, ImM EDTA, 5mM DTT, 0. 1% (v/v) Triton X-100 和 50% (v/v)甘油)对所有蛋白进行透析。在 SDS-PAGE 上检查蛋白纯度(通常 40%至80%的靶蛋白)。使用基于Bredford法的Bio-Rad蛋白 检测(500-0006)确定蛋白浓度。在37°C、50°C下测定MLV逆转录酶的比活性(将酶稀释于特定的稀释缓冲液 30mM 25°C下 pH 为 8. 3 的 Tris-HCl，IOmM DTT, 0. 5mg/ml BSA)，以及在 50°C下使酶温育 5 分钟后在37°C下测定残留活性(将酶稀释，并在Ix RT反应缓冲液50mM25°C下pH为8. 3 的Tris-HCl，4mM MgCl2, IOmM DTT,50mM KCl中测定其稳定性)。在以下最终混合物中检测31所有情况下的酶活性50mM Tris-HCl (25°C下 pH 为 8. 3)，6mM MgCl2, IOmM DTT,40mM KCl, 0. 5mM dTTP，0. 4MBq/ml[3H]-dTTP，0. 4mM polyA ·寡(dT)12_18。确定活性单位，测定在特定 反应温度下在10分钟内dTMP在多核苷酸级分(在DE-81上吸收)中的导入，并且与已知 量的商业酶比较。结果在选择数据进行的分析的期间，我们已经累积了 104个表达全长M-MuLV逆转录酶 的序列。为了与文献中通常所用的具有相同的氨基酸编号相同，使将对所有蛋白(附录2) 进行的全部总CLUSTALW比对以编译成无不带N末端His标签的方式汇编记。表示为MLV的 野生型序列总是作为第一序列给出。使用于黑色背景中的白色字体标记突变(附录幻。其 处发生的突变某种程度上改善M-MuLV逆转录酶性质并和描述于不同的专利申请中的突变 处的氨基酸位置，在比对中标记为以灰色突出显示的氨基酸(白色字体)的柱。源自我们的 选择并且位于灰色柱中的突变作为证明表明，我们的选择方法精确地靶向有益的热点或甚 至别处所述的准确确切氨基酸突变。从104个测序克隆中我们发现了 98个独特序列和1个 wt (L5_87)序列。5 个序列重复两次(L5_21 和 L5_lll ；L5_43 和 L5_112 ；L5_49 和 L5_63 ； L5_64和L5_93 ；L5_85和L5_96)。我们总共随机表达了 55个蛋白。从在55个所表达蛋白 中，根据SDS-PAGE，将40个M-MuLV逆转录酶的40个酶促活性突变变体(包括对照wt)利 用SDS-PAGE成功纯化到40%至80%均勻性均一性(homogeneity)。纯化RT样品中的总蛋 白浓度为0. 6mg/ml-至5. 5mg/ml。在37°C，50°C下测试突变RT变体在37°C、50°C下的逆转 录酶活性和在50°C下温育5分钟后在37°C下的残留活性(图8)。将37°C下的逆转录酶活 性标准化成100%并且在图8中省略。因此仅显示两种类型的柱(50°C下RT活性的百分比 和50°C下温育5分钟后在37°C下的残留RT活性的百分比)。作为对照，显示了提出用于突 变体文库构建的wt M-MuLV逆转录酶。该起始酶在与RT突变变体相同的载体中表达并以相 同的方式进行纯化。50°C下wt酶RT活性的平均值为37°C下活性的约45%。除了少量例 外，几乎所有测试蛋白在50°C下具有高于45%的活性。对于所有测试突变体50°C下的RT 活性的平均值约为 92%，超过wt酶(45% )的2倍。一些变体在50°C下的活性是37°C下 活性的 100 % 或甚至更高20、23、L5_16、L5_24、L5_30、L5_35、L5_37、L5_43、L5_46、L5_47、 L5_49、L5_52、L5_55、L5_64、L5_65、L5_68、L5_72。发现的最佳突变体在 50°C下具有的 RT 活性是约 140% 以上(比 wt 的 45%高 3 倍):20(165% ),L5_37 (162% )、L5_43 (156% )、 L5_46(135% ),L5_47(179% )、L5_52(137% )、L5_64(142% )和 L5_68(153% )。即使大多数的突变体在50°C下具有非常高的RT活性，它们仍然不是热稳定的。Wt 对照的50°C下温育5分钟后在37°C的残留RT活性为 11 %。所选择酶的相同平均残留活 性为类似的 12%。虽然一些所测试的RT变体实质上热稳定性更高，并且具有的残留活 性比 wt 酶(11% )高 2 至 3 倍:L5_8(25% ),L5_43(32% )、L5_46(27% ) ,L5_64(28% )、 L5_65(25% )、L5_68(31% )。部分经纯化wt酶的比活性(u/mg蛋白)是 200 ‘ 000u/mg(图9)。以各种方 式表达和纯化所选择的RT变体，并且平均比活性( 155' 000u/mg)稍微低于wt对照 (图9)。比活性在某些情况下减少，在某些情况下增加OO- 274' 000u/mg ；L5_ll- 273' 000u/mg ;L5_28- 230' 000u/mg ;L5_30_ 224' 000u/mg ;L5_35_ 316 ‘ OOOu/ mg ；L5_43- 328 ‘ 000u/mg ；L5_46- 304 ‘ 000u/mg ；L5_52- 310 ‘ 000u/mg ；L5_64- 256 ‘ 000u/mg ；L5_65- 247 ‘ OOOu/mg)。显然我们的选择系统运行良好。使用RT反应的温度升高作为选择压力因子，我们 成功地进化了更快(50°C下的RT比活性更高)和热稳定性(50°C下预温育5分钟后在37°C 的残留RT活性)更高的逆转录酶。有价值信息的来源是所选择蛋白序列的比对(附录2、。与初始wt M-MuLV相比 50°C下的活性实质上更好(与wt活性的45%相比，为70%以上)的所分析蛋白的序列用 灰色突出显示(附录2)。发生突变的氨基酸数量为O (wt或L5_87) 12(L5_9)。在所有 所选择RT变体中发现的突变的列表如附录3所示。蛋白按突变数量递减排序。大多数突 变体(104个中的53个)具有4至6个突变/序列。显然逆转录酶序列具有一些热点，这 些热点通常对于RT反应和对于酶的热稳定性是重要和有益的。作为特定位置处的突变集 合，这些热点可以在多序列比对(附录2)中容易鉴定。特别重要的是M-MuLV逆转录酶的 运行更好的变体中发现的突变(序列以灰色突出显示-附录幻。关于频率最高的突变的总 结信息(以降序)示于附录4。如之前附录一样，在50°C下具有实质上更高活性的突变蛋 白用灰色突出显示。如果相同突变重复许多次并且具有该突变的测试逆转录酶在50°C下运 行更好，这意味着该突变以某种方式对逆转录反应有益。根据突变的发现频率，可以将它们分成5类21至31个重复；14至18个重复；4 至7个重复；2至3个重复和1个重复。第一组频率最高的突变包括四个氨基酸D5M (31个 重复)；D200 (30个重复)；D653 (23个重复)和D583 (21个重复)。已知两个氨基酸(D5M 和D58;3)在核糖核酸酶H结构域的活性中心络合镁离子。使用突变D524G、D583N和E562Q 来关闭M-MuLV逆转录酶的RNA酶H活性(Gerard等，2002)，这改善cDNA的合成。我们的 选择结果惊人地相似。在98个序列中的31个内发现天冬氨酸5 的突变。另外，D524N取 代发现1次，D524A发现10次以及最后D524G发现20次。因此我们的选择不仅精确靶向 重要的氨基酸，还靶向已知为最佳的相同的氨基酸取代。完全相同的情况是天冬氨酸583 的突变，其在104个所选择蛋白中的21个中重复。取代D583E发现1次，D583A发现3次， D583G发现7次以及最后D583N发现10次。再次，选择频率最高的是已知为最佳的相同氨基 酸和相同取代(D583N)。来自hvitrogen的商业酶SUPERSCRIPT II具有3个突变D524G， D583N和E562Q(W020040M749)。令人感兴趣的事情是第3个氨基酸取代E562的突变在我 们选择中仅发现一次(在L571中的E562K)。该结果表明，很有可能谷氨酸562不如天冬氨 酸5M和583那样重要，或出于某些原因该氨基酸的交换可能引起某些副作用，并且对于在 较高温度(> 50°C )下进行的RT反应不利。对经选择蛋白序列的进一步分析可以鉴定更多热点氨基酸位置，这些热点 氨基酸的突变在改善的M-MuLV逆转录酶的其它专利申请中有所描述H204R-7个重 复(US7078208) ；H638R-4 个重复(US20050232934A1) ；T197A-2 个重复(US7056716)； M289V (L)、T306A (M) -2 个重复(US7078208) ；E302K、N454K-2 个重复(W007022045A2)； E69G、L435P-1 个序列(W007022045A2) ；Y64C、Q190R、V223M、F309S_1 个序列(US7056716)； E562K-1个序列(US7078208)。还存在两个经选择的逆转录酶序列，所述序列具有文献中所 述的 3 个氨基酸取代的组合(30-D200N、T306M、D524N、D583G ;L5 28_T306A、F309S、D524A、 H594R、F625S)。除了已知的突变之外，我们还鉴定出许多经常发生突变的其它氨基酸位置D200N(A, G) -30 个重复；D653N(G、A、H、V) -23 个重复；L603ff(M)-18 个重复；T330P-15 个 重复；L139P-14 个重复；Q221R-6 个重复； ^87Α_6 个重复；I49V(T)_5 个重复；N479D-5 个重复；H594R (Q) -5个重复；F625S (L) _5个重复；P65S-4个重复；H126S (R) _4个重复； L333Q(P)-4 个重复；A502V-4 个重复；E607K(G，A)_4 个重复；K658R(Q)-4 个重复；H8P(R)_3 个重复；P130S-3个重复；E233K-3个重复；Q237R-3个重复；拟49D-3个重复；A^3D(T)_3 个重复；A307V-3个重复；Υ;344Η-3个重复；P407S(L)_3个重复；M^8L_3个重复；Q430R-3 个重复；D449G (A) -3个重复；A644V (T) _3个重复；N649S-3个重复；L671P-3个重复； E673G(K) -3个重复；N678I-3个重复(附录4)。表现最佳的RT变体通常具有被修饰最频繁的氨基酸的突变20 (50 0C -123% )~Ρ200Ν(30 个重复)，L603ff(18 个重复)和稍微修饰的 C 末 端-N678I, S679P, R680A ；L5 35 (50°C -125% )~Ρ200Ν(30 个重复),Τ330Ρ(15 个重复),N479D (5 个重复)；L5_37(50°C -162% )~H123S(4 个重复)，L149F(1 个序列)，D200N(30 个重复)， N454K (2 个重复),D583N(21 个重复)；L5_43(50°C -160% )~Ρ200Ν(30 个重复),Q237R(3 个重复),T330P(15 个重复), D524G (31 个重复)，F625S(5 个重复)，D653N(23 个重复)；L5_46(50°C -135% )-D200N(30 个重复),T330P(15 个重复),D583N(21 个重复), T644TC3个重复)；L5_47 (50 °C -179% )_N107S(1 个重复)，H126R(4 个重复)，TU8A(1 个重复)， II79V(2 个重复)，D200N(30 个重复)，H642Y(2 个重复)，D653N(23 个重复)；L5_52(50°C -137% )-D200N(30 个重复)，T330P(15 个重复)，Q374R(2 个重复)， D583N(21 个重复)；L5_64(50°C -142% )~Ρ200Ν(30 个重复)，D216G(2 个重复)，D524G(31 个重复)， EM5GQ个重复)；L5_65(50°C -127% )~Ρ200Ν(30 个重复)，Q238H(1 个重复)，L570I (1 个重复)， L603ff(18 个重复)；L5_68 (50°C -153%) -M39V(2 个重复)，I49V(2 个重复)，Q91R(2个重复)，H204R(7 个重复)，T287AC6个重复)，N454K(2个重复)，F625L(5个重复)，D653H(23个重复)。突变蛋白的所测定RT活性和序列比对分析的组合数据组允许我们确定M-MuLV逆 转录酶序列中的许多有益突变(和其组合)。实施例3-莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体的分析实施例2中所述的体外进化实验是非常有效的。利用温度逐渐增加的逆转录反应 作为选择压力并且产生M-MuLV RT的大量不同突变变体。与最初的酶相比，它们中的大多数 在升高的温度下能够表现地更好。所进化的逆转录酶的序列分析指明了热点和负责酶性质 的复杂改善的最重要的氨基酸位置(置换)。为了阐明不同突变的个体影响，构建M-MuLV RT的单突变体和多突变体，并对其部分纯化和进行分析。突变体构建的起点是编码M-MuLV RT的7474bp质粒pET_his_MLV(SEQ ID No :19)，具有用于使用亲和色谱进行快速蛋白纯化 的N-末端标签。确定37°C下M-MuLV逆转录酶的比活性、50°C下的相对活性和在50°C下使 酶温育5分钟后在37°C下的相对残留活性。在某些情况下检查RNA酶H活性，并在不同温度下对11Λ或4. 5kb RNA进行cDNA合成反应。方法和材料使用起始质粒pET_his_MLV(SEQ ID No :19)作为用于突变发生PCR的起始材料。 使用突变发生引物引入突变。对个体克隆进行测序和分析。在T7表达菌株ER2566中表达 M-MuLV RT突变体。使相同构建中个体蛋白和起始wt M-MuLV逆转录酶在200ml LB中生长 至A590为 0. 7，并通过使用anl Qiagen-Ni-NTA Superf low树脂的亲和色谱利用his-标 签进行纯化(根据供应商建议在天然条件下进行所有纯化)。在Iml EB(50mM-NaH2P04, 300mM-NaCl, pH 为 8· 0 的 250mM_ 咪唑，IOmM- β -巯基乙醇和 0. 1 % triton X-100)中 进行洗脱。以50倍过量的贮存缓冲液(50mMTris-HCl (在25°C下pH 8. 3),0. IM NaCl, ImM EDTA, 5mM DTT, 0. 1% (v/v) TritonX-100 和 50 % (ν/ν)甘油)对所有蛋白进行透析。 在SDS-PAGE上检查蛋白纯度(通常为靶蛋白的 40%至80% )。使用Bradford试剂 (Fermentas#R1271)确定蛋白浓度。在37°C、50°C下测定MLV逆转录酶的活性(将酶稀释于特定的稀释缓冲液中 30mM 25°C下 pH 为 8. 3 的 Tris-HCl，IOmM DTT, 0. 5mg/ml BSA)，以及在 50°C下使酶温育 5 分钟后在37°C下测定残留活性(将酶稀释，并在Ix RT反应缓冲液50mM25°C下pH为8. 3 的Tris-HCl，4mM MgCl2, IOmM DTT,50mM KCl中测定其稳定性)。在以下最终混合物中检测 所有情况下的酶活性50mM Tris-HCl (25°C下 pH 为 8. 3)，6mM MgCl2, IOmM DTT,40mM KCl, 0. 5mM dTTP，0. 4MBq/ml[3H]-dTTP，0. 4mM polyA ·寡(dT)12_18。确定活性单位，测定在特定 反应温度下在10分钟内dTMP在多核苷酸级分(在DE-81上吸收)中的导入，并且与已知 量的商业酶比较。根据美国专利US5405776测定M-MuLV逆转录酶变体的RNA酶H活性。 在含有 PH 为 8. 3 的 50mM Tris-HCl,2mM MnCl2, ImM DTT 禾口 [3H] (A)η* (dT)η (5 μ M[3H] (A) n,35cpm/pmol ；20 μ M(dT) η)的反应混合物(50 μ 1)中检测经纯化酶的RNA酶H活性。使 反应在37°C下进行温育10分钟，并通过添加10 μ 1的tRNA(lmg/ml)和20 μ 1的冷50% TCA而终止。在冰上10分钟后，在Eppendorf离心机中使混合物离心10分钟Q5000g)。 在 LSC-通用鸡尾酒式混合物(LSC-universal cocktail) (Roth-Rotiszint ecoplus)中对 40 μ 1上清液进行计量。1单位的RNA酶H活性为[3Η] (A)n*(dT)n中，在37°C下在10分 钟内使1摩尔[3H] (A)n溶解所需的酶的量。使用〃RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit" (#K1622-Fermentas) 及其对照1. Ikb具有3' -poly (A)尾的RNA和寡(dT) w引物来检查经纯化逆转录酶在不 同温度下合成cDNA的能力。作为选择，使用4. 51Λ RNA (从Eco31I线性化的pTZ19R质粒 合成，其另外含有λ噬菌体DNA 5505-8469bp的碎片)来测试逆转录反应。按照所提供 的策略使用试剂盒组分1 μ g的合成RNA，在20 μ 1反应体积中进行1小时的cDNA合成，不 同之处在于仅一些小的改动(没有在37°C下预温育5分钟)。在EppendorfMastercycler gradient PCR仪上使用相应的温度梯度在96孔PCR板上进行逆转录反应。通过碱性琼脂 糖凝胶电泳(用溴化乙锭染色)分析所合成的cDNA。在碱性琼脂糖凝胶上cDNA合成分析 的样品示于图16。结果根据M-MuLV逆转录酶进化期间的突变发现的频率，将突变分成5类21至31个 重复；14至18个重复；4至7个重复；2至3个重复和1个重复。通常根据该信息进行个体逆转录酶突变体的构建。首先测试发现频率最高的突变。确定37°C下逆转录酶的比活性、 50°C下的相对活性和在50°C下使酶温育5分钟后在37°C下的相对残留活性。在某些情况 下检查RNA酶H活性，并在不同温度下对11Λ或4. 51Λ RNA进行cDNA合成反应。关于个体 突变体的所有实验数据示于附录5。第二列(“选择频率”)表示具有确切突变的测序突变 体的数量，括号中的数字表示在选择中发现的特定氨基酸突变的总数。例如D200N-25(30) 表示该天冬氨酸200替换成天冬酰胺在全部30个D200突变中发现25次。37°C下测定的 逆转录酶比活性的以单位/mg蛋白给出。50°C下的相对酶活性和在50°C下温育5分钟后在 37°C下的相对残留RT活性以相对于37°C下测定的相同酶的比活性(100%)标准化的百分 比给出。作为对照(第1行)给出用于突变体文库构建的wt M-MuLV逆转录酶。该起始酶 在与RT突变变体相同的载体中表达并以相同的方式进行纯化。Wt酶在37°C下的比活性为 约200' 000u/mg，在50°C下的相对活性(相对于37°C下的活性)-45-50% (90' 000u/mg 至100' 000u/mg)，在50°C下温育5分钟后在37°C下的相对残留RT活性(相对于37°C下 的活性)为约11 % ( 22 ‘ 000u/mg)。野生型酶的RNA酶H活性为约160u/mol至200u/ mol，并且在48°C下可以合成全长11Λ cDNA。已知的是，M-MuLV逆转录酶通过与模板-引物 底物结合而避免热失活，反之酶仅在溶液中的热稳定性较差(Gerard等，200 。在50°C下 温育5分钟后在37°C下的相对残留RT活性直接表明在不含底物的溶液中的酶的热稳定性。 同时50°C下的相对活性表示在具有RNA/DNA底物的复合物中酶的热稳定性和cDNA合成的 速度。逆转录酶的速度快的突变变体会在50°C下产生数量增加的聚合酶单位，即使其热稳 定性与野生型酶相同。cDNA合成(在我们的情况下为11Λ或4. 5kb)的最高温度是最全面的 参数，其表示酶于较高的温度下合成cDNA的一般能力。在37°C下的比活性(彡220' OOOu/ mg,200' 000u/mg-wt)、相对于37°C下的突变活性的在50°C下的相对活性(彡，45% 至50% -wt)或相对于37°C下的突变活性的在50°C下温育5分钟后在37°C下的相对残留 活性(彡13%,11% -wt)增加至少10%的逆转录酶突变体，以灰色阴影表示，并认为是显 著改善的酶。能够在高于48°C的温度下合成全长11Λ cDNA的突变体也以灰色阴影表示。
37°C下具有更高比活性(彡220' 000u/mg)的逆转录酶是(附录5)D200(D200N-254' 000u/mg ；D200G-276' 000u/mg ；D200H-234' 000u/mg)， T330(T330N-223' 000u/mg ；T330D-240' 000u/mg), Q221(Q221R-268' OOOu/mg), H594(H594K-270' OOOu/mg ；H594Q-231' OOOu/mg), D449(D449E-224' OOOu/mg ；D449N-221' OOOu/mg), 139 (M39N-349' OOOu/mg)，M66 (M66L-237’ OOOu/mg ；M66V-227' OOOu/mg ；M66I-240' OOOu/mg), H126 (H126R-227' OOOu/mg)， ff388 (W388R-266' OOOu/mg)， I179(I179V-251' OOOu/mg).50°C下具有更高相对活性(> )的逆转录酶(与37°C下的活性相比)是(附


录5)
D200(D200N-84% ；D200A-87% ；D200Q-103% ；D200E-79% ；D200V-131% ； D200ff-103% ；D200G-88% ；D200K-102% ；D200R-68% ；D200H-54% )，
L603(L603ff-105% ；L603F-104% ；L603Y-95% ；L603M-77% )，D653(D653N-93% ；D653K-106% ；D653A-99% ；D653V-98% ；D653Q-93% ；D653L-83% ；D653H-116% ；D653G-90% ；D653ff-93% ；D653E-80% )，T330(T330P-80% ；Τ330Ν-69% ；T330D-55% ；T330V-65% ；T330S-67% )，Q221(Q221R~94% ；Q221K-77% ；Q221E-64% ；Q221M-58% ；Q221Y-77% )，E607(E607K-84% ；E607A-98% ；E607G-72% ；E607D-69% )，L139(L139P~59% )，T287(T287S~68% )，N479(N479D~81% ),H594(H594R-69% ；H594K-80% ；H594Q-75% ；H594N-61% )，D449 (D449G~79% ；D449E-77% ；D449N-75% ；D449A-99% ；D449V-83% )，M39 (M39V-54 % ；M39N-71% ),M66(M66L-79% ；M66V-73% ；M66I-80% )，L333(L333Q~54% )，H126(H126R~58% ),P130(P130S-70% ),Q91(Q91R~56% ),ff388 (W388R-72 % )，R390(R390ff~64% ),0374(Q374R~56% )，E5(E5K-67% ).在50°C下温育5分钟后在37°C下具有增加的相对残留RT活性(彡13% )的逆转 录酶(与37°C下的活性相比)是(附录5)D200(D200N-15% ；D200A-18% ；D200Q-23% ；D200R-27% ；D200H-27% )，L603(L603ff-23% ；L603Y-13% ；L603P-15% )，D653(D653N~21% ；D653K-15% ；D653A-18% ；D653V-16% ；D653Q-18% ；D653H-13% ；D653G-13% ；D653ff-13% ；D653E-19% )，T330(T330P-21% ；Τ330Ν-13% ；T330D-16% ；T330S-15% )，T287 (T287A-13% ；T287F-13% )，H594(H594R-14% ；H594Q-13% )，D449 (D449G~13% )，M39(M39V-13% )，M66(M66L~13% )，Y344 (Y344H~13% )，Q91(Q91R~13% )，N649 (N649S~16% )，ff388(ff388R~14% ).能够在高于48°C的温度下合成全长11Λ cDNA的突变体是(附录5)D200 (D200N-50. 4°C ；D200H-50· 4°C )，37
L603 (L603W-53. 1°C ；L603F-50. 4°C ；L603Y-47. 8°C 至 50. 4°C )，D653 (D653N-50. 4 V 至 53. 1 V ；D653K-50. 4 V 至 53. 1 V ；D653A-50. 4 V ； D653V-50. 4 V ；D653Q-50. 4 V ；D653L-50. 4 V ；D653H-50. 4 °C 至 53. 1 V ；D653G-50. 4 V ； D653W-50. 40C ),Q22KQ221R-50. 4°C )，E607 (E607K-47. 8°C 至 50. 4°C )，H594 (H594K-47. 8°C至 50. 4°C ；H594Q-47. 8°C至 50. 4°C )在碱性琼脂糖凝胶上进行的11Λ cDNA合成分析的样品示于图16A-D。根据收集的生化数据，M-MuLV逆转录酶序列中可以影响较高温度下cDNA合成的 最重要的位置是:D200、L603、D653、T330、Q221、E607、L139、T287、N479、H594、D449、M39、 M66、L333、H126、Y344、P130、Q91、N649、W388、R390、1179、Q374、E5。通常，可以对目的突变进行组合，进一步改善具有或不具有底物的M-MuLV逆转录 酶热稳定性结合、速率、持续性和较高温度下合成cDNA的总体能力。表明通过组合途径改 善酶的一些数据示于附录6。单突变D200N和L603W在50°C下具有的相对活性为84%和 105%。Ikb cDNA合成的最高温度为50. 4°C和53. 1°C。双重突变体D200N ;L603W在50°C 下的相对活性为131%，并且可以在56°C下合成Ikb cDNA。三重突变体D200N ;L603W ； T330P(在50°C下相对活性为80% ；在47. 8°C下合成IlibcDNA)得到进一步改善并在50°C 下具有175%的相对活性，并且可以在56°C至58°C下合成11Λ cDNA。四重突变体D200N ； L603W ；T330P ；E607K(在 50°C下相对活性为 84% ；在 47. 8°C至 50. TC合成下 Ikb cDNA) 在50°C下具有174%的相对活性，并且可以在60°C至62°C下合成Ikb cDNA。五重突变 体 D200N ；L603W ；T330P ；E607K ；L139P(在 50°C下相对活性为 59% ；在 47. 8°C下合成 Ikb cDNA)在50°C下具有176%的相对活性，并且可以在62°C下合成11Λ cDNA，该温度比野生型 M-MuLV逆转录酶(在47.8°C下合成11Λ cDNA)的温度高约14°C。在以下情况下也观察到 热稳定性的加和特征N479D，H594R 突变体(D200N ；L603W_50°C下相对活性为 131 %，在 56°C下合成 Ikb cDNA,而 D200N ；L603W ；N479D ；H594R-在 50°C下相对活性为 182%，在 56°C至 58°C下合成 Ikb cDNA，在 56°C 至 58°C 下合成 4. 5kb cDNA)，T330P 突变体(D200N ；L603W ；D653N ；D524G-在 50°C下相对活性为 155%，在 58°C 至 60°C 下合成 Ikb cDNA,而 D200N ；L603W ；D653N ；D524G ；T330P-在 50 °C 下相对活性为 180%，在 60°C至 62°C下合成 Ikb cDNA)。在碱性琼脂糖凝胶上进行的4. 5kb cDNA合成分析的样品示于图16E-G。
实施例4-CRD的改进-使用生物素dUTP选择DNA依赖性DNA聚合酶活性(原理 证明) 该实施例阐释了作为DNA依赖性DNA聚合酶的逆转录酶的基于活性的选择策略， 该酶能够将修饰的核苷酸引入到DNA-DNA底物中。选择的原理性示意示于图12。使用 两个质粒pET_his_MLV_D583N_pD (编码减去RNA酶H的与蛋白D间隔子融合的莫洛尼氏鼠 白血病病毒)及其衍生物pET_his_del_pD(编码失活的逆转录酶；pol结构域中57个氨基 酸缺失，并且RNA酶H结构域中存在突变D583N，实施例1，SEQ ID No⑵作为该实施例的起 始材料。使用质粒pET_his_MLV_D583N_pD和pET_his_del_pD作为靶，在两个单独的聚合酶链式反应中合成起始的编码活性逆转录酶和失活逆转录酶的DNA片段。所合成的PCR片 段用于合成mRNA的转录反应，所述mRNA的3'末端缺乏终止密码子。将经纯化的mRNA以 1 20 =MLV (活性RT) :del (失活RT)的比例混合。通过T4DNA连接酶将双链DNA衔接体 (选择DNA依赖性DNA聚合酶活性所需)连接到3 ‘ mRNA。该mRNA/dsDNA复合物用于体外 翻译反应。沿着mRNA移动的核糖体在RNA-DNA杂交的位点停止翻译(Tabuchi等，2001)。 通过用冰冷的含有50mM Mg2+的缓冲液稀释翻译混合物，从而使核糖体-mRNA/dsDNA-蛋白 复合物稳定化(与常规的核糖体展示一样)。通过蔗糖垫超速离心对三元复合物(TC)的 混合物进行纯化。使用含有与体外翻译的M-MuLV (RNA酶H-)逆转录酶连接的mRNA-dsDNA 的经纯化的三元复合物(取<3X109个分子)来制备反应混合物，该反应混合物另外补 充有生物素-dUTP和反应缓冲液。对冰冷的RT反应混合物进行乳化，产生 1 X 101°个大 小为 2 μ m的油包水区室。在37°C下使乳化的反应混合物(小于一个TC，核糖体-mRNA/ dsDNA-蛋白/区室)温育30分钟。区室化反应混合物的温度升高后，大多数TC解离，释放 mRNA/dsDNA和逆转录酶。仅在含有活性M-MuLV(RNase H-)逆转录酶的区室中可以发生成 功的引入反应，导致mRNA/dsDNA复合物的生物素化。使生物素化的复合物选择性地固定于 链亲和素包被的磁珠上，并通过RT-PCR特异性扩增。作为成功实验的结果，编码活性酶的 基因(在我们的情况下为MLV_D583N_pD逆转录酶的RT-PCR片段)应该相对于编码失活酶 (del_pD)的基因富集。方法和材料mRNA/dsDNA复合物的制备(1)连接效率的确定。通过使用ddC-Long2引物(SEQ ID No 22)引物作为夹板序 列(splint)将MLV_pD mRNA (从pET_his_VlLV_pD质粒合成，实施例 1)与引物 Long+Tb (SEQ ID No 23)连接，从而确定连接反应的效率。预先使用T4多核苷酸激酶(i^rmentas)将 Long+Tb的5'末端磷酸化。通过将8. 5pmol ( 10 μ g)的经纯化MLV_pD mRNA与摩尔数4倍过量的 Long+Tb (SEQ ID No :23)以及摩尔数 4. 2 倍过量的 ddC_Long2 (SEQ ID No :22)于不含核酸 酶的水中混合，制备36 μ 1的退火混合物。在70°C下使混合物温育5分钟，然后冷却至室温 20分钟。添加连接反应组分之前，将混合物移到冷却台2分钟。向36 μ 1的退火混合物中添加4. 5 μ 1的IOx连接缓冲液和4. 5 μ 1的T4DNA连接 酶(5ν/μ 1) (Fermentas)。在37°C下使连接反应进行30分钟，随后用等体积的Roti 苯酚 /氯仿(ROTH)提取1次，并用等体积的氯仿提取两次。假设mRNA的量接近于为连接反应 而取的起始量，利用不含核酸酶的水将 5μ g的连接产物混合物稀释到43μ 1。在固定于 Dynabeads Μ-280 链亲和素珠(Dynabeads kilobase BINDER Kit(DYNALBiotech))上之 前，留出2μ 1所得混合物的等分试样以用于在琼脂糖凝胶上的分析。将10 μ 1再悬浮的Dynabeads转移到1. 5ml微量离心管中，用50 μ 1试剂盒中所提 供的结合溶液洗涤。将试管置于磁体上1分钟至2分钟直到珠于所述试管中沉淀，并且除 去溶液。通过吹吸在38 μ 1的补充有2μ 1 tRNA (来自酵母的tRNA (Roche))水溶液(1 μ g/ μ 1)的结合缓冲液中温和地使Dynabead再悬浮，从而使得非特异性mRNA结合最小化。向 含有连接产物混合物的溶液( 40 μ 1)中添加40 μ 1在结合溶液中的Dynabead。在+22°C 下在热混合器(Eppendorf)中振摇60分钟，对试管进行温育。与所连接的mRNA/dsDNA结合后，除去上清液，并将所述珠用50 μ 1洗涤液(试剂盒中提供)洗涤3次。使得所收集的 具有固定物(连接mRNA/dsDNA复合物)的Dynabead再悬浮于沈μ 1不含核酸酶的水，随 后用40 μ 1的Rati 苯酚/氯仿(ROTH)提取1次，并用40 μ 1体积的氯仿提取两次，从而 使mRNA/dsDNA复合物从磁珠释放。将1、2和5 μ 1最终混合物与进行固定之前留出的样品 (2μ 1)和Mass Ruler 高范围DNA ladder—起在琼脂糖凝胶上分析。确定在链亲和素珠 上纯化的mRNA/DNA复合物中mRNA的量，比较固定前后的mRNA的量。mRNA的回收率为 60%,这意味着至少60%的mRNA与DNA双链成功连接，产生mRNA/dsDNA复合物。(2)确定生物素-dUTP导入到mRNA/dsDNA复合物和导入到自引导mRNA中的效率。 如第一次mRNA与dsDNA连接实验所示，连接反应效率为 60%以上。连接混合物中剩下的 游离mRNA可以自引导，并参与使用M-MuLV逆转录酶和生物素-dUTP的延伸反应。进行该 实验，从而证明mRNA/dsDNA复合物(连接产物)是比游离的自引导mRNA更好的底物。按照上述方法将MLV_D583N_pD_mRNA与long+寡核苷酸(SEQ ID No 21)连接(起 始质粒pET_his_MLV_D583N_pD和pET_his_del_pD的构建详细地描述于实施例1)。将 12，5ng制备的(MLV_D583N_pD mRNA/long+)底物与预先在70°C下温育5分钟的 12，5ng ng的del_pD mRNA混合，然后在不含核酸酶的水中冷却至室温20分钟，总体积为12. 5 μ 1。 制备用于通过逆转录酶导入dTTP或生物素-dUTP的第二混合物8 μ 1切用于逆转录酶的 反应缓冲液；ι μ l-40u/ μ 1 RiboLock RNA酶抑制剂(Fermentas) ；18. 6μ 1不含核酸酶 的水；0. 4μ 1-200ιι/μ 1 RevertAid Minus M-MuLV 逆转录酶(Fermentas)。将所制备的 混合物分成h 15 μ 1两试管，并添加1 μ 1的ImM dTTP (Fermentas)或1 μ 1的ImM生物 素-dUTP (Fermentas)。随后向含有dTTP和生物素-dUTP的混合物中添加5 μ 1底物(来自 第一混合物)。在37°C下使反应进行60分钟。然后向两个样品添加1 μ 1 0. 5Μ EDTA(ρΗ 8. 0)，对反应混合物用等体积的R0ti 苯酚/氯仿(ROTH)提取1次，用等体积的氯仿提取1 次，然后在G-50微柱(GE Healthcare)上进行纯化。留下2 μ 1所得反应产物用于直接RT 反应(无进行链亲和素珠纯化)，并将剩余部分的溶液用于生物素化mRNA-dsDNA复合物在 Dynabeads M-280链亲和素珠(Dynabeads kilobase BINDER Kit(DYNAL Biotech))上的 固定。将10 μ 1再悬浮的Dynabead转移到1. 5ml微量离心管，用25 μ 1所提供的结合缓冲 液洗涤。将试管置于磁体上1分钟至2分钟直到珠沉淀在所述试管的底部，并且除去溶液。 通过吹吸在90 μ 1结合缓冲液中温和地使Dynabead再悬浮，并添加2 μ 1 tRNA(来自酵母的 tRNA(Roche))水溶液(1 μ g/μ 1)，从而使得非特异性mRNA结合最小化。向含有延伸有通 过dTTP和生物素-dUTP延伸的RNA-DNA片段的溶液( 40 μ 1)中添加40 μ 1在结合溶液 中的40 μ 1 Dynabead0通过振摇(HOOrpm)，使得试管在+22°C下在热混合器(Eppendorf) 中温育40分钟。结合步骤后，除去上清液，并用50 μ 1洗涤液(试剂盒中提供)在+22°C下 振摇(HOOrpm) 5分钟，对所述珠进行洗涤3次。使所收集的具有固定物(延伸mRNA-dsDNA 复合物)的延伸mRNA-dsDNA复合物的Dynabead再悬浮于逆转录反应混合物中。在冰上 制备逆转录反应混合物20μ 1-5X用于逆转录酶的反应缓冲液(i^rmentas) ；10 μ I-IOmM dNTP (Fermentas) ；2. 5 μ l-40u/ μ 1 RiboLock RNA 酶抑制齐[J (Fermentas) ；5 μ 1-20 μ M pD_42 寡核苷酸(SEQ ID No :8) ；2，5 μ IRevertAid Minus M-MuLV 逆转录酶 QOOu/μ 1) (Fermentas) ；55 μ 1不含核酸酶的水。将所制备的混合物分成5个19 μ 1 (5x19 μ 1)的等分 试样。两个用于再悬浮使具有固定的延伸的mRNA/dsDNA复合物或mRNA的Dynabead再悬40浮，将另两个转移到具有未进行链亲和素珠纯化的所留样品的试管，向剩下的19μ 1等分 试样中添加ι μ 1不含核酸酶的水-阴性反应对照，用于证明反应混合物未受到DNA污染。 通过在+42°C下在热混合器(Eppendorf)中振摇(IOOOrpm) 1小时，使对所有反应混合物进 行温育，直到cDNA合成反应结束。通过巢式PCR进行cDNA的扩增。在冰上制备起始PCR混合物 14 μ 1-10Χ 含有 KCl 的 Taq 缓冲液(Fermentas) ； 14 μ l_2mM 各 dNTP (Fermentas)； 8. 4 μ l-25mMMgCl2 (Fermentas) ；2. 8 μ I-Iu/ μ 1 LC (重组)Taq DNA 聚合酶(Fermentas)； 0. 7μ 1-100 μ MM_F 弓 I 物(SEQ ID No :11) ；0· 7 μ 1-ΙΟΟρΜ M_2R 弓 | 物(SEQ ID No :12)； 92. 4 μ 1 7jC -将混合物分成7个19 μ 1的样品(7x19 μ 1)。向5χ 19 μ 1的PCR主混合物中 添加1 μ 1的eDNA (RT样品1至5)；向第6管PCR主混合物中添加1 μ 1的水-阴性PCR对 照；向第7管(阳性PCR对照)-添加1 μ 1的pET_his_MLV_D583N_pD质粒( Ing)。循 环方案为在94°C下进行起始变性步骤3分钟，25个循环(94°C下45秒钟，57°C下45秒钟 和72°C下1分钟)和最后在72°C下延伸3分钟。对于MLV_D583N_pD，预测的扩增子大小为907bp，对于del_pD cDNA,预测的大小 为736bp。在每孔加载10 μ 1 PCR混合物的1 %琼脂糖凝胶上分析PCR产物(图13)。如所预期的，仅在使用生物素-dUTP的延伸反应中观察到有效的cDNA扩增。在使 用dTTP的延伸反应中可以检测到所扩增cDNA的非常微弱的带，并且可以解释为mRNA与链 亲和素珠的弱的非特异性结合。在链亲和素珠上纯化后，编码MLV_D583N_pD基因(907bp) 的DNA相对于del_pD(73m3p)的DNA富集。这意味着mRNA/dsDNA复合物通过生物素-dUTP 的延伸比自引导del_pD_mRNA要有效的多。(3)mRNA 混合物(MLV_D583N_pD del_pD = 1 20)和 RNA/dsDNA 复合物的制 备。用于体外转录的PCR片段的制备。在冰上制备PCR混合物20 μ 1-10Χ 含有 KCl 的 Taq 缓冲液(Fermentas) ； 20 μ l-2mM 的各 dNTP (Fermentas)； 12 μ l-25mMMgCl2 (Fermentas) ；16 μ 1-DMSO (D8418_Sigma) ；4 μ I-Iu/μ 1 LC (重组)Taq DNA 聚合酶(Fermentas) ；1 μ 1-100 μ M pro-pIVEX 弓| 物(SEQ ID No :3) ；1 μ 1-100 μ M pD-ter引物(SEQ ID No :20) ；122 μ 1水-将混合物分成h 98 μ 1的两试管。向h 98 μ 1 的 PCR 主混合物中添加 2μ 1 pET_hisJViLV_D583N_pD (稀释至 lng/μ 1)或 2 μ 1ρΕΤ_ his_del_pD(稀释至 lng/μ 1)(起始质粒 pET_his_MLV_D583N_pD 和 pET_his_del_pD 的 构建详细地描述于实施例1)。循环方案为在94°C下进行起始变性步骤3分钟，30个循环 (94°C下45秒钟，53°C下45秒钟和72°C下2分钟)和最后在72°C下延伸5分钟。从2ng 质粒(7873bp)至 5μ g(50ng/y 1)扩增产物(来自 pET_his_MLV_pD 的 2702bp PCR 片段 MLV_D583N_pD ；来自 pET_his_del_pD 的 2531bp PCR 片段)，扩增效率为 7000 倍。制备转录混合物80μ 1- T7转录缓冲液(1M HEPES-KOH pH 7. 6;150mM乙酸 镁；IOmM 亚精胺；0. 2M DTT) ；56 μ 1-112mM 各 NTP (Fermentas) ；16 μ 1_20ιι/μ 1 T7RNA 聚合 酶(Fermentas) ；8μ l-40u/ μ 1 RiboLock RNA 酶抑制剂(Fermentas) ； 114 μ 1 不含核酸酶 的水-将混合物分成h 165 μ 1两试管，并且添加35 μ l-20ng/ μ 1的PCR片段MLV_D583N_ pD (未经纯化的PCR混合物)或35 μ l-20ng/ μ 1的PCR片段del_pD PCR (未经纯化的PCR 混合物)。转录在37°C下进行2小时。
用冰冷的不含核酸酶的水将两种转录混合物都稀释到200 μ 1，并且添加200 μ 1 的6Μ LiCl溶液。将混合物在+4°C下温育25分钟，在+4°C下于冷却的离心机中以最大速 度OOOg)离心25分钟。弃去上清液，用500 μ 1冰冷的75%乙醇洗涤RNA团块。再 次将试管在+4°C下以最大速度离心5分钟，并弃去上清液。在室温下对RNA团块干燥5分 钟，并随后通过在+4°C和1400rpm下振摇15分钟使其再悬浮于400 μ 1不含核酸酶的冰冷 的水中。再次将试管在+4°C下以最大速度离心5分钟，以分离未溶解的RNA。将约380μ1 的上清液移到具有42 μ 1 IOX DNA酶I缓冲液(Mg2+) (Fermentas) ；3 μ I-Iu/ μ 1的DNA酶 I (不含RNA酶)(i^rmentas)的新试管中，并且在37°C下温育20分钟，从而降解DNA。对反 应混合物用等体积的Roti 苯酚/氯仿(ROTH)提取1次，用等体积的氯仿提取2次，从而除 去DNA酶I。向各试管添加43 μ 1 ρΗ为5. 0的3Μ乙酸钠溶液和1075 μ 1冰冷的96%乙醇。 最后通过在_20°C下温育30分钟，并在+4°C下以最大速度OOOg)离心25分钟使RNA 沉淀。弃去上清液，用500μ 1冰冷的75%乙醇洗涤RNA团块。再次将试管在+4°C下以最 大速度离心4分钟，并弃去上清液。在室温下对RNA团块干燥5分钟，并随后通过在+4°C下 振摇(HOOrpm) 15分钟使其再悬浮于150 μ 1不含核酸酶的冰冷的水中。将RNA溶液等分 为10 μ 1，并用液氮冷冻。用分光光度法测定mRNA浓度，并在与RiboRuler RNA Ladder, 高范围(i^rmentas) —同进行的琼脂糖凝胶上复核。通过使用ddC-Long2寡脱氧核苷酸作为夹板将long+寡脱氧核苷酸与mRNA连接， 从而产生mRNA/dsDNA复合物。使用T4多核苷酸激酶O^ermentas)使Long+的5'末端预 先磷酸化。寡脱氧核苷酸ddC-Long2具有3'末端修饰(ddC)，从而防止逆转录酶对其天然 RNA-DNA底物的3 ‘末端延伸的可能性。通过将17pmol 比例为 1 20 = MLV_D583N_pD (活性 RT) :del_pD (失活 RT)的经 纯化mRNA混合物与在不含核酸酶的水中的摩尔数4. 3倍过量的long+和摩尔数4. 1倍过 量的ddC-Long2混合，制备50 μ 1的退火混合物。在70°C下使所述混合物温育5分钟，然后 冷却至室温20分钟。添加连接反应组分之前，将混合物移到冷却台2分钟。向40 μ 1的退火混合物中添加5 μ 1的IOx连接缓冲液和5 μ 1的T4DNA连接酶 (5ν/μ 1) (Fermentas)。使用在无T4DNA连接酶的Ix连接缓冲液中的相同退火混合物进行 阴性连接反应。在37°C下使制备的连接反应混合物温育30分钟。为了终止连接，向两个试 管添加1 μ 1的0. 5M EDTA (ρΗ 8. 0)，并对反应混合物用等体积的Roti 苯酚/氯仿(ROTH) 提取1次，并用等体积的氯仿提取两次，然后在30°C下在真空浓缩器5301 (EppendOrf)中 对反应产物浓缩10分钟。使用illiustra ProbeQuant G-50微柱(GEHealthcare)进行脱 盐。通过利用RiboRuler RNA Ladder，高范围(i^rmentas)进行的琼脂糖凝胶确定连接产 物的浓度-与long+/ddC-Long2寡脱氧核苷酸连接的mRNA混合物(MLV_D583N_pD del_ PD = 1 20) 0. M μ g/ μ 1 (具有T4DNA连接酶的样品)，和具有long+/ddC-Long2寡脱 氧核苷酸的简单mRNA混合物 0. 06 μ g/ μ 1 (无T4DNA连接酶的样品)。
(4)通过引入[α -P33] dATP获得的mRNA/dsDNA复合物的一般对照。测试所 制备的mRNA/dsDNA复合物(底物)的通过逆转录酶进行的dTTP(或生物素-dUTP) 以及随后[a_P33]dATP导入。反应混合物16μ1切用于逆转录酶的反应缓冲液； 4 μ l-40u/y IRiboLock RNA 酶抑制剂(Fermentas) ；2 μ 1 [ α _P33] dATP (IOmCi)/ml, SRF-203 (HartmannAnalytic)) ；35 μ 1 不含核酸酶的水；1μ l-200u/ μ 1 RevertAid MinusM-MuLV逆转录酶(i^rmentas)。将所制备的混合物分成h 28 μ 1的两试管，并添加2 μ 1 ImMdTTP (Fermentas)或 2 μ 1 ImM 生物素-dUTP (Fermentas)。将所得混合物分成 h 15 μ 1 的两试管。向第一管添加1. 25 μ 1 ( 0. 3 μ g)连接产物和3. 75 μ 1不含核酸酶的水。向第 二管添加5μ1( 0.3yg)阴性连接反应产物。使反应混合物在37°C下温育30分钟。然 后，向所有试管添加1 μ 1 0. 5Μ EDTA(pH 8. 0)，对反应混合物用等体积的Roti 苯酚/氯仿 (ROTH)提取1次，用等体积的氯仿提取1次，然后在illiustra G-50微柱(GE Healthcare) 上进行纯化。在利用RiboRuler RNA Ladder，高范围(i^rmentas)进行的琼脂糖凝胶上分 析反应产物(图14A)。在所有样品(具有或不具有连接酶)中我们可以看到del_pDmRNA 的离散的带( 2500b)(比在mRNA混合物中存在的不能被区分的MLV_D583N_pD mRNA 2700b的量小20倍)。随后在滤纸上对琼脂糖凝胶进行干燥，并且仅在阳性连接样品(具 有连接酶)的情况下检测放射性标记的mRNA/dsDNA复合物(在与mRNA相同的位置)，而在 阴性连接样品(不具有连接酶)的情况下不进行检测(图14B)。(5)使用生物素-dUTP对DNA依赖性DNA聚合酶活性进行的选择。将之前制备的 mRNA/dsDNA 复合物(mRNA 混合物 MLV_D583N_pD (活性 RT) del_pD (失活 RT) = 1 20) 用于使用合成WakoPURE系统O95-59503-Wako)的体外翻译。用于WakoPURE的翻译混合 物(25 μ 1) :12，5 μ I-A 溶液(Wako) ；5 μ I-B 溶液(Wako) ；0，5 μ l_40u/ μ 1 RiboLock RNA 酶抑制剂(Fermentas) ；0. 25 μ I-IM DTT ;1，75 μ 1 不含核酸酶的水和 5 μ 1-0. M μ g/μ 1 mRNA/dsDNA底物( 1200ng)。在37°C下进行体外翻译120分钟。通过添加155 μ 1冰 冷的终止缓冲液 WBK5QQ+DTT+triton(25°C下 pH 为 7. 5 的 50mM tris-乙酸盐；50mM NaCl ； 50mM 乙酸镁；500mM KCl ； IOmM DTT ；0. 1 % (v/v) -Triton x-100 (T8787_Sigma))终止翻 译物( 25 μ 1)，并在+4°C和25' OOOg下离心5分钟。非常仔细地将160 μ 1经离心的 翻译混合物转移到透明的Iml超速离心管(343778-Beckman)中至840 μ 1 35%的蔗糖在 WBK500+DTT+Triton X-100 中的溶液(50mM 在 25°C下 pH 为 7. 5 的 Tris-乙酸盐；50mMNaCl ； 50mM 乙酸镁；500mMKCl ；IOmM DTT ；0. 1 % (v/v) -Triton χ-100 (T8787_Sigma) ；35 % (w/ ν)-蔗糖(84097-Fluka))的顶部。通过在+4°C下以 100，OOOrpm 在 TL-IOOBeckman 超速 离心机中用TLA100. 2固定角转头(Beckman)进行超速离心9分钟，对由mRNA/dsDNA-核 糖体-蛋白(tRNA)组成的三元复合物(TC)进行纯化。最初从离心管的最上部移出 750 μ 1溶液。然后(非常仔细地使位于超速离心管底部的TC的小透明团块保持完整) 用 750 μ lWBK5QQ(50mM 在 25°C下 pH 为 7. 5 的 tris-乙酸盐；50mMNaCl ；50mM 乙酸镁；500mM KCl)洗涤管壁。最后从离心管的最上部开始移出所有溶液，并且将团块溶解于30 μ 1冰冷 的终止缓冲液 WBK5QQ+DTT+triton(50mM 在 25°C下 pH 为 7. 5 的 tris-乙酸盐；50mM NaCl ； 50mM 乙酸镁；500mM KCl ； IOmM DTT ；0. 1% (v/v) -Tritonx-100 (T8787-Sigma))中。如超速离心后使用放射性标记的mRNA所确定，5%至30%输入的mRNA位于三元 复合物团块中。因此据预测在30 μ 1缓冲液中具有低于360ng (翻译反应中所用的1200ng mRNA的30 % )的mRNA ( Ung/ μ 1或9 X IO9个分子/ μ 1的三元复合物)。在冰上通过将以下成分混合而制备导入经修饰核苷酸的反应混合物5μ 1-5Χ 用于逆转录酶的反应缓冲液(Fermentas) ;1. 25 μ l-40u/μ 1 RiboLock RNA酶抑制剂 (Fermentas) ；2. 5 μ I-ImM 生物素-dUTP (Fermentas) ；40. 95 μ 1 不含核酸酶的水和 0. 3 μ 1 经纯化的(<2. 7 X IO9个分子)TC。根据所述方案，50 μ 1的核苷酸导入反应混合物含有< 2. 7 X IO9个分子的三元复合物。通过将ABIL EM 90 (Goldschmidt)混入矿物油(M5904_Sigma)至终浓度 4% (ν/ ν)来制备油-表面活性剂混合物(Ghadessy和HolIiger，2004 ;US2005064460)。通过 将950 μ 1油-类表面活性剂混合物与50 μ 1 RT混合物混合，在+4°C下在5ml冷冻小瓶 (cryogenic vial) (430492-Corning)中制备乳液。使用速度控制在 2100rpm 的 MS-3000 磁力搅拌器、具有中心环的Rotilabo -(3x8mm)磁棒(1489. 2-Roth)进行混合；每30秒钟向 水相添加10 μ 1等分试样，继续混合另外2分钟(总混合时间-4分钟)。根据光学显微镜 数据，所制备乳液中的区室大小为0. 5 μ m 10 μ m，平均直径为 2 μ m。因此据预期对含有 低于2. 7X IO9个分子的三元复合物的50 μ 1逆转录反应混合物进行乳化后具有 1 X 101° 个油包水区室(约1个mRNA-dsDNA复合物和逆转录酶分子/3至4个区室)。使所制备的乳液在+37°C下温育30分钟。为了从乳液中回收反应混合物，向乳液添加20 μ 1 0. IM EDTA，搅拌10秒钟，然后 添加50 μ 1苯酚/氯仿混合物，并搅拌另外10秒钟。然后，将乳液转移到1. 5ml微量离心 管，添加0.5ml水饱和的醚，通过涡旋混合，并在室温下以16' OOOg离心10分钟。除去 油-醚相，在试管底部留下浓缩(但仍完整)的乳液。最后通过用0. 9ml水饱和的醚提取；0.9ml水饱和的乙酸乙酯(为了除去ABIL EM 90洗涤剂)提取；用0. 9ml水饱和的醚提取 2次将乳液破乳。在室温下对水相真空干燥12分钟，然后在illiustraProbeQuant G-50微 柱(GE Healthcare)上除去导入的核苷酸。留出所得混合物的2 μ 1等分试样用于直接RT 反应(未进行链亲和素珠纯化)，并将溶液的其余部分用于生物素化mRNA-dsDNA复合物在 Dynabeads M-280 链亲和素珠(DYNAL Biotech)上的固定。根据所提供的产品说明书，使用Dynabeads kilobase BINDER Kit (DYNALBiotech)来分离生物素化mRNA-dsDNA复合物。将5 μ 1再悬浮的Dynabead转 移到1. 5ml微量离心管，用20 μ 1所提供的结合缓冲液洗涤。将试管置于磁体上1分钟至 2分钟直到珠在所述试管中沉淀，并且除去溶液。通过移液在50 μ 1结合缓冲液中温和地 使Dynabead再悬浮，并添加1 μ 1 tRNA (来自酵母的tRNA (Roche))水溶液(1 μ g/ μ 1)，从 而使得非特异性mRNA结合最小化。向含有生物素化RNA-DNA片段的溶液( 50 μ 1)中添 加50μ 1在结合缓冲液中的Dynabead。使试管在+22°C下在热混合器(Eppendorf)中振摇 温育1小时。mRNA/dsDNA结合后，从所述珠中除去上清液，并在+22°C下用50 μ 1的洗涤液 (试剂盒中提供)振摇(HOOrpm) 5分钟对所述珠洗涤2次，并在+22°C下用50 μ 1的洗涤 液振摇(HOOrpm) 12分钟对所述珠洗涤1次。使所收集的具有所固定的生物素化mRNA-dsDNA复合物的Dynabead再悬浮于逆转 录反应混合物中。在冰上制备用于所选择的mRNA/dsDNA复合物的逆转录反应混合物12 μ 1_5Χ用 于逆转录酶的反应缓冲液(Fermentas) ；6 μ I-IOmM dNTP (Fermentas) ；1. 5 μ l_40u/μ 1 RiboLock RNA 酶抑制剂(Fermentas) ；0. 3 μ 1-20 μ M pD_42 寡核苷酸(SEQ IDNo 8)；1.5μ 1 RevertAi d Minus M-MuLV 逆转录酶 QOOu/μ 1) (Fermentas) ；35. 7 μ 1 不含核酸 酶的水。将所制备的混合物分成3个19 μ 1的等分试样一个用于使具有固定的生物素化 mRNA/dsDNA复合物的Dynabead再悬浮，将另一个19 μ 1等分试样转移到具有留出的未进 行链亲和素珠纯化的延伸mRNA/dsDNA复合物样品的试管，向剩下的19 μ 1等分试样中添加1μ 1不含核酸酶的水(阴性反应对照-用于证明反应混合物未受到污染)。通过+42°C下 在热混合器(Eppendorf)中振摇(IOOOrpm) 1小时，使所有反应混合物进行温育。通过巢式PCR进行cDNA的扩增。在冰上制备起始PCR混合物10 μ 1-10Χ含有KCl 的 Taq 缓冲液(Fermentas) ； 10 μ l_2mM各 dNTP (Fermentas) ；6 μ l-25mMMgCl2 (Fermentas)；2μ I-Iu/ μ 1 LC (重组)Taq DNA 聚合酶(Fermentas) ； 1 μ 1-2. 5u/ μ 1 PfuDNA 聚合酶 (Fermentas) ；0· 5 μ 1-100 μ M RD_Nde 引物(SEQ ID No :9) ；0. 5 μ l_100pMpD_55 引物(SEQ ID No 10) ；65 μ 1水-将混合物分成5个19 μ 1的样品(切19 μ 1)。向3χ 19 μ 1的PCR 主混合物中添加1 μ 1 cDNA(RT样品1至3)；向一个具有19 μ 1的PCR主混合物的试管中 添加1 μ 1 7jC -阴性PCR对照。对于阳性PCR对照，添加1 μ 1的pET_his_MLV_pD质粒( Ing)。循环方案为在94°C下进行起始变性步骤3分钟，30个循环(94°C下45秒钟，58°C 下45秒钟和72°C下3分钟)和最后在72°C下延伸5分钟。在冰上制备用于部分基因扩增(为了更好地分辨RT样品中MLV_D583N_pD del_ pD cDNA的比例)的巢式PCR混合物20 μ 1-10Χ含有KCl的Taq缓冲液(i^ermentas)； 20 μ l-2mM 各 dNTP (Fermentas) ； 12 μ l-25mM MgCl2 (Fermentas) ；0. 9μ 1_5ιι/μ 1 Taq DNA 聚合酶(Fermentas) ； 1.0 μ 1-100 μ M M_F 引物(SEQID No :11) ； 1.0 μ 1-100 μ M M_2R 引物 (SEQ ID No 12) ； 135. 1 μ 1水-将混合物分成5x 38 μ 1。向所制备的巢式PCR混合物添加 2 μ 1第一次PCR (引物组RD_Nde//pD_55)产物。将Master mix再次混合，并分成两试管 (2x 20 μ 1)以用于30个或35个PCR循环扩增。循环方案为在94°C下进行起始变性步骤 3分钟，30或35个循环(94°C下45秒钟，57°C下45秒钟和72°C下1分钟)和最后在72 °C 下延伸3分钟。对于MLV D583N_pD, PCR片段的预期长度是907bp，对于del_pD是736bp。 在每孔加载10 μ 1 PCR混合物的琼脂糖凝胶上对扩增进行分析(图15)。结果1.使用T4DNA连接酶将双链(dsDNA)衔接体成功地连接到mRNA。如通过dsDNA-生 物素衔接体的连接所确定的，连接效率是约60%。可以在链亲和素珠上对mRNA/dsDNA复合 物进行特异性纯化，提供了分辨生物素标记的底物和未标记的底物的机会。与mRNA/dsDNA 相比，游离mRNA对于DNA依赖性DNA聚合酶是差得多的底物。因此，dsDNA与mRNA的60 % 连接效率足够良好，并且所述底物可以成功地用于进化流程。2.进行使用 mRNA/dsDNA 复合物(mRNA 混合物 MLV_D583N_pD del_pD = 1 20) 的一般选择实验。使用WakoPURE蛋白翻译系统进行体外翻译，并且进行区室化生物 素-dUTP导入到dsDNA的反应，以证明编码活性逆转录酶的基因(MLV_D583N_pD)相对于编 码失活酶的基因(del_pD)的富集。根据选择流程(图12)，生物素-dUTP的导入反应应该 仅发生在含有活性(MLV_D583N_pD)逆转录酶的水性区室中，导致mRNA/dsDNA复合物的生 物素化。通过使生物素化的复合物与固定在磁珠上的链亲和素结合，从而选择DNA依赖性 DNA聚合酶，然后通过RT-PCR对所选择的基因进行扩增。编码活性酶的基因(在我们的情 况下是MLV_D583N_pD逆转录酶的RT-PCR片段)相对于编码失活酶的基因富集(图15)。 基因MLV_D583N_pD del_pD的起始比例为1 20，最终比例(富集后)是 1 1。个 别地，在该特定实验中富集倍数是 20倍。不同实验中计算的富集倍数是5 200。并且 经确认可以应用区室化核糖体展示(CRD)法的，通过经修饰核苷酸的导入选择DNA依赖性 DNA聚合酶。可以立即进行常规DNA依赖性DNA聚合酶的选择。生物素-dUTP可以与不同的的目核苷酸类似物(包括具有:V修饰的核苷酸类似物)交换。将所述核苷酸类似物导 入DNA链后，末端被封闭，不能延长，并且会终止延伸反应。该方法用于边合成边测序 (SBS)方案，并且利用区室化核糖体展示(CRD)技术可以容易地对适合于SBS的DNA聚合酶 进行进化。附录1NcoIccatgggcatgaccctaaatatagaagatgagcatcggctacatgagacctcaaaagagc 60cagatgtttctctagggtccacatggctgtctgattttcctcaggcctgggcggaaaccg 120ggggcatgggactggcagttcgccaagctcctctgatcatacctctgaaagcaacctcta 180cccccgtgtccataaaacaataccccatgtcacaagaagccagactggggatcaagcccc 240ggacatacagagactgttggaccagggaatactggtaccctgccagtccccctggaacacgc 300accctgctacccgttaagaaaccagggactaatgattatagKcctgtccaggatctgagag 360ggaagtcaacaagcgggtggaagacatccaccccaccgtgcccaacccttacaacctcttga 420cgcgggctcccaccgtcccaccagtggtacactgtgcttgatttaaaggatgcctttttct 480cgcctgagactccaccccaccagtcagcctctcttcgcctttgagtggagagatccagaga 540tgggaatctcaggacaattgacctggaccagactcccacagggtttcaaaaacagtccca 600ct tccctgtttgatgaggcactgcacagagacctagcagacttccggatccagcacccagact 660gtgatcctgctac旦gtacgtggatgacttactgctggccgccacttctgagctagactgcc 720aacaaggtactcgggccctgttacaaaccctagggaacctcgggtatcgggcctcggcca 780gcagaaagcccaaatttgccagaaacaggtcaagtatctggggtatcttctaaaagagggtc 840agagatggctgactgaggccagaaaagagactgtgatggggcagcctactccgaagaccc 900actcgacaactaagggagttcctagggacggcaggcttctgtcgcctctggatccctgggt 960ttgcagaaatggcagcccccttgtaccctctcaccaaaacggggactctgtttaattggg 1020gcccagaccaacaaaaggcctatcaagaaatcaagcaagctcttctaactgccccagccc 1080ctggggttgccagatttgactaagccctttgaactctttgtcgacgagaagcagggctacg 1140ccaaaggtgtcctaacgcaaaaactgggaccttggcgtcggccggtggcctacctgtcca 1200aaaagctagacccagtagcagctgggtggcccccttgcctacggatggtagcagccattg 1260ccgtactgacaaaggatgcaggcaagctaaccatgggacagccactagtcattctggccc 1320-------------------------
cccatgcagtagaggcactagtcaaacaaccccccgaccgctggctttccaacgcccgga 1380tgactcactatcaggccttgcttttggacacggaccgggtccagttcggaccggtggtag 1440ccctgaacccggctacgctgctcccactgcctgaggaagggctgcaacacaactgccttg 1500gatatcctggccgaagcccacggaacccgacccgacctaacggaccagccgctcccagacg 1560cgccgaccacacctggtacacggatggaagcagtctcttacaagagggacagcgtaaggcgg 1620gagctgcggtgaccaccgagaccgaggtaatctgggctaaagccctgccagccgggacat 1680ccgctcagcgggctgaactgatagcactcacccaggccctaaagatggcagaaggtaaga 1740gagctaaatgtttatactgatagccgttatgcttttgctactgcccatatccatggagaaa 1800tatacagaaggcgtgggttgctcacatcagaaggcaaagagatcaaaaataaagacgaga 1860tcttggccctactaaaagccctctttctgcccaaaagacttagcataatccattgtccag 1920aggacatcaaaagggacacagcgccgaggctagaggcaaccggatggctgaccaagcggccc 1980gaaaggcagccatcacagagactccagacacctctaccctcctcatagaaaattcatcac 2040ccaattcccgcttaattaatgaattcEcoRI附录权利要求
1.一种编码靶蛋白的核酸的制备方法，所述方法包括(a)提供包括一种或多种编码所述靶蛋白的RNA或DNA分子在内的RNA或DNA分子阵列；(b)从所述阵列产生靶蛋白，从而形成RNA-蛋白复合物或DNA-蛋白复合物，其中所述 RNA或DNA分子与所述复合物非共价结合或共价结合；(c)将所述复合物分隔到区室中，其中大多数或全部区室含有不超过一个复合物；(d)使所述复合物处于允许靶蛋白具有活性的反应条件下；和(e)基于与靶蛋白相关的活性选择编码所述靶蛋白的核酸，其中当所述复合物是DNA-蛋白复合物并且所述复合物中DNA非共价结合时，在不存在 用于各复合物的分离的区室的情况下进行步骤b)。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述阵列为mRNA的阵列。
3.如权利要求2所述的方法，其中通过在mRNA进行核糖体翻译的条件下温育所述 mRNA的阵列来进行步骤b)，从而产生三元复合物的阵列，每个三元复合物包含mRNA、核糖 体和从所述mRNA翻译的蛋白。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤c)包括将所述复合物的阵列 导入水相微滴中，其中大多数或全部水相微滴含有不超过一个复合物。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述水相微滴是油包水乳液的水相微滴。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述水相微滴是水包油包水乳液的水相微滴。
7.如权利要求6所述的方法，其中在步骤(e)中在荧光激活细胞分选仪中对微滴进行 选择。
8.如权利要求4 6中任一项所述的方法，其中所述mRNA包含酶的底物，所述酶包括 所述靶蛋白或其辅酶；其中使所述水相微滴处于允许酶具有活性的反应条件下；和 其中基于与所述靶蛋白相关的酶活性选择编码所述靶蛋白的核酸。
9.如权利要求8所述的方法，其中将所述辅酶导入到具有所述复合物的水相微滴中。
10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，其中对所述允许酶具有活性的反应条件进 行选择以有利于突变酶活性。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述反应条件包括高于野生型酶的最适温度的温度。
12.如权利要求8 11中任一项所述的方法，其中所述酶包括核酸加工酶。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述核酸加工酶包括所述靶蛋白，并且选自核酸 聚合酶、核酸连接酶和末端脱氧核苷酸转移酶。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述靶蛋白是包括逆转录酶的核酸聚合酶。
15.如权利要求14所述的方法，其中选择编码所述靶蛋白的核酸的步骤(e)包括选择 通过所述逆转录酶的作用产生的cDNA，所述cDNA编码逆转录酶。
16.如权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述允许酶具有活性的反应条件包 括50°C 60°C的温度。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述靶蛋白是核酸连接酶，并且所述允许酶具有 活性的反应条件包括包含核酸连接子或衔接体的辅助底物，所述辅助底物进一步包含用于附着到配体结合伴侣的亲和配体。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述靶蛋白是末端脱氧核苷酸转移酶，并且所述 允许酶具有活性的反应条件包括包含dNTP的辅助底物，所述辅助底物进一步包含用于附 着到配体结合伴侣的亲和配体。
19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中选择编码所述靶蛋白的核酸的步 骤(e)包括通过与包含所述配体结合伴侣的固相附着而对导入所述辅助底物的mRNA进行 选择。
20.如权利要求13所述的方法，其中所述靶蛋白是核酸连接酶，并且所述允许酶具有 活性的反应条件包括包含核酸连接子或衔接体的辅助底物，所述连接子或衔接体进一步包 含用于所述mRNA的特异性扩增的序列标签。
21.如权利要求12所述的方法，其中所述核酸加工酶包含所述辅酶，并且所述辅酶被 导入到所述油包水乳液的水相微滴中。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述靶蛋白包括逆转录酶辅助酶，并且所述核酸 加工酶包括逆转录酶。
23.如权利要求22所述的方法，其中选择编码所述靶蛋白的核酸的步骤(e)包括选择 通过所述逆转录酶的作用产生的cDNA，所述cDNA编码所述逆转录酶辅助酶。
24.如权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述逆转录酶辅助酶是解旋酶、焦 磷酸酶、持续因子或RNA结合蛋白。
25.如权利要求21所述的方法，其中所述靶蛋白包括RNA酶抑制剂，并且所述核酸加工 酶包括RNA酶。
26.如权利要求25所述的方法，其中选择编码所述靶蛋白的核酸的步骤(e)包括选择 被RNA酶降解的mRNA。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述编码靶蛋白的核酸包含所述编码 靶蛋白的核酸富集的核酸阵列，所述阵列可选地被转化或扩增，以形成步骤(a)中的mRNA 的阵列，并进行一个或多个另外的步骤(b) (e)的循环。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述复合物在第一缓冲 液中产生，所述第一缓冲液在步骤(d)之前或步骤(d)期间与第二缓冲液交换。
29.一种逆转录酶，所述逆转录酶通过权利要求14 16中任一项所述的方法获得，并 且在大于42°C的温度时具有最佳活性。
30.如权利要求四所述的逆转录酶，其中所述最佳活性的温度为50°C 60°C。
31.一种逆转录酶，所述逆转录酶包含在以下氨基酸位置中的一处或多处带有突变的 MMLV逆转录酶氨基酸序列D200, D653, L603, T330, L139, Q221,T287，149，N479, H594, A502,E607, K658, P130, Q237,A307, Y344, Q430, D449, A644, N649,L671, E673, M39，Q91，M66, W388,.1179 L333 R390 Q374 和 E5其中当所述突变位于D653位时所述突变不是D653N，其中当所述突变位于L603位时所述突变不是L603A，并且其中当所述突变位于H594位时所述突变不是H594A。
32.如权利要求31所述的逆转录酶，所述逆转录酶具有以下突变中的一个或多个突 变D200N，A 或 G，D653G, A，H 或 V，L603W 或 M，T330P, L139P, Q221R, T287A, I49V 或 T， N479D, H594R 或 Q, A502V, E607K, G 或 A，K658R 或 Q P130S, Q237R, A307V, Y344H, Q430R, D449G 或 A，A644V 或 T，N649S, L671P, E673G 或 K，M39V 或 L，Q91R 或 L，M66L, W388R, I179T 或 V L333Q R390W Q374R 和 E5K。
33.一种逆转录酶，所述逆转录酶在大于37°C的温度时具有最佳活性，其中50°C时的 活性是37°C时活性的至少120%。
34.一种突变逆转录酶，所述突变逆转录酶在50°C时的活性为相应野生型酶活性的至 少两倍。
35.一种突变逆转录酶，所述突变逆转录酶在37°C时的比活性为相应野生型酶的至少 125%。
36.一种突变逆转录酶，在50°C处理5分钟后，对在37°C的残留活性进行测定，所述突 变逆转录酶的热稳定性为相应野生型酶的至少1. 5倍。
37.如权利要求33 36中任一项所述的逆转录酶，所述逆转录酶包括MMLV逆转录酶。
38.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求31 37中任一项所述的逆转录酶。
全文摘要
本发明提供了一种编码靶蛋白的核酸的制备方法，所述方法包括(a)提供包括一种或多种编码所述靶蛋白的RNA或DNA分子的RNA或DNA分子阵列；(b)从所述阵列产生靶蛋白，从而形成RNA-蛋白或DNA-蛋白复合物，所述复合物中RNA或DNA分子与所述复合物非共价或共价结合；(c)使所述复合物分隔到区室中，其中大多数或全部区室含有不超过一个复合物；(d)使所述复合物处于允许靶蛋白具有活性的反应条件下；和(e)基于与靶蛋白相关的活性选择编码所述靶蛋白的核酸，其中当所述复合物是DNA-蛋白复合物并且该复合物中DNA非共价结合时，在不存在用于各复合物的分离的区室的情况下进行步骤b)。
文档编号C12N9/12GK102057039SQ200980121472
公开日2011年5月11日 申请日期2009年4月9日 优先权日2008年4月10日
发明者唐吉拉·斯克斯内内, 阿尔维达斯·亚努拉提斯, 雷米吉犹斯·斯卡尔加拉 申请人:菲门特斯Uab公司