获得基于RNA干扰(RNAi)对植物病原体攻击有抗性的转基因植物的方法

专利名称：获得基于RNA干扰(RNAi)对植物病原体攻击有抗性的转基因植物的方法
获得基于RNA干扰(RNAi)对植物病原体攻击有抗性的转基
因植物的方法本发明涉及获得基于RNA干扰(RNAi)对植物病原体攻击有抗性的转基因植物以 保护所述植物免受寄生虫和植食性动物(phytophage)的攻击的方法，所述方法包括在植 物组织中表达适合于抑制GPCR受体的功能性的dsRNA，所述GPCR受体的功能对于真菌、食 草昆虫或植物病原线虫是至关重要的。具体地，本发明涉及可使用免受真菌、食草昆虫或植 物病原线虫攻击的预防性保护处理获得的，在其组织中表达dsRNA的植物。RNAi是在进化过程中保存的存在于所有生物中的自然过程。其是各种双链RNA片 段籍以能够干扰和消除基因表达的基因沉默机制。一旦确定了双链RNA分子(dsRNA)，所谓 的RNAi机器就能够激活RNAi机制(Brandt，2002)。通过称为dicer的酶，dsRNA序列被切成具有更短长度(19_21个碱基对)的片 段(Hamilton和Baulcombe，1999)。短dsRNA片段(称为短干扰RNA或siRNA)与称为 RISC(RNA-干扰沉默复合物)的酶促复合物结合。dsRNA可能通过解旋酶(helicase)打开 只有反义RNA链仍然与RISC结合，而有义链被降解。RISC复合物能够在存在于细胞溶胶中 的众多mRNA中识别与所述同一复合物相结合的反义RNA片段互补的mRNA。如果siRNA与 mRNA之间的配对是完全的(或几乎完全的)，那么RISC的组分(称为argonaute蛋白)能 够切割mRNA (Hammond等人，2001)。两个所得的mRNA片段(一个在5’不具有头，而另一个 在3’不具有A极的尾)从而能够被细胞本身的RNA酶快速降解。另一种常见蛋白质(虽 然未普遍存在于RNAi机器中)是RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)，其从单个螺旋RNA模块 (mould)开始合成dsRNA以产生RNAi扩增机制。有关RNAi可作为强大且容易的基因沉默方法这一发现已唤起了整个科学界的关 注。该现象的普遍存在已使得其能够在许多物种中得到研究。许多实验实际上基于将整个 生物体简单地浸入含有dsRNA的溶液或通过用表达dsRNA的细菌进行的喂饲。这已使得 能够快速鉴定在秀丽隐杆线虫中参与RNAi的基因，以及在果蝇、植物和真菌中发现其同源 物，并且已证明最初分类为抑制性PTGS (quelling PTGS)(转录后基因沉默)的现象全都是 其根源建立在单个祖先机制中的单一过程的部分。在植物背景中，利用RNAi的基因沉默的应用已使得能够产生具有增加的对疾病、 昆虫的抗性水平或具有高营养品质的具有农业利益的品种。例如，一些研究者通过RNAi技术已促成改良水稻植物。他们降低了麦谷蛋白的水 平，产生称为LGC-I (低麦谷蛋白含量1)的水稻品种，其适合于不能降解麦谷蛋白的肾虚患 者(Kusaba 等人，2003)。其他RNAi应用涉及通过沉默参与毒素的生物合成的基因而除去植物内毒素。利 用dsRNA使咖啡植物的可可碱合酶失活，从而使得能够生成去除了咖啡因的咖啡(Ogita等 人，2003)。还已对具有农业利益的植物的病原体和植食性动物进行了使用dsRNA的沉默 实验，以抑制其一些至关重要的基因的表达。在鞘翅类昆虫(coleopteran)(赤拟谷盗 (Tribolium castaneum))末期幼虫和成虫中显微注射dsRNA已使得基因得到沉默并且其
4功能得到研究(Tomoyasu和Denel 1，2004)。一些研究者已使用用富含特定dsRNA的合成饮 食喂养的玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgiferaLeconte)的幼虫进行测试，以 鉴定该昆虫的生活力所必需的基因。此类测试鉴定到其失活(因干扰而引起的失活)引起 幼虫死亡的14个至关重要的基因。表达一种此类dsRNA的转基因玉米植物已显示可与利 用表达毒素Bt的转基因植物获得的保护水平相当的高保护水平(Baum等人，2007)。然而 与后者不同，表达dsRNA的转基因植物具有减少的环境影响。事实上，在该情况下昆虫基因 的抑制作用只取决于siRNA与待灭活的靶序列之间的特异性识别。因此，与将“外源”分子 导入至环境中和与非靶生物的相互作用相关的问题得到消除。为了控制病原体和植食性生物，待灭活的基因靶的选择是至关重要的。G蛋白偶联受体(GPCR)包括一大组结构和功能彼此相似的蛋白质，其在所有真核 生物中发挥至关重要的功能。它们由跨膜7次，具有细胞外氨基末端和细胞内羧基末端的 单个多肽组成；在与细胞外配体(肽、小分子、离子、光和芳香族化合物)结合后，受体通过 在细胞中引发导致第二信使(cAMP、Ca2+、cGMP、IP3)产生的反应来被激活。大多数具有农业利益的生物具有众多的GPCR，其中大部分是其重要机能的正确 运行或其致病性的基础。最广泛研究的物种(其基因组已进行了完全测序和登记，并且 其中存在相当多的关于发育生物学的信息)很明显是模式生物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、秀HI3隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、酵母(Saccharomyces)禾口链抱 霉(Neurospora)。黑腹果蝇是最广泛研究的节肢动物，并且被当作用于有害昆虫的研究的模式生 物。在果蝇基因组中，已鉴定了大约270个GPCR，其被分入5个家族。最近还已完成蚊子 (冈比亚按蚊(Anopheles gambiae))的基因组序列。详细的生物信息学方法已导致在该双 翅类昆虫的基因中鉴定了具有巨大卫生利益的276个GPCR。关于此类基因在不同发育期的 表达特异性的大量信息也是可获得的，并且已利用黑腹果蝇的基因组进行了详细的比较分 析。秀丽隐杆线虫是从遗传学、神经生物学、细胞和分子角度进行了广泛研究的模式 后生动物(metazoan)。对于该生物，还完成了基因组序列，并且除了信号转导、神经生物学、 发育、行为、生殖外，在文献中还提供了关于生物信息学、表达的大量信息。由公共机构资 助的项目也处于领先阶段，其目标在于从20个不同种类的线虫寄生虫鉴定大约315. 000个 EST (表达序列标签)。所有此类信息的可获得性允许非常快速地克隆GPCR的cDNA，从而将 其用作RNAi的靶和潜在的杀线虫剂。另一方面，关于真菌的GPCR可获得的信息较少。已在子囊菌(ascomycete)和担 子菌(basidiomycete)中鉴定了总共两个由GPCR介导的转导途径a)信息素反应(GPCR = STE)；b)对营养因子的反应(葡萄糖传感器)。可获得多得多关于子囊菌和担子菌中的异源三聚体G蛋白(GPCR的直接效应 物)的信息(Li等人，2007)。已鉴定了至少3个Ga亚基，并且已获得不同真菌种类 (酵母、链孢霉、曲霉菌(Aspergillus)、黑粉菌⑴stilago)、镰孢菌(Fusarium)、炭疽菌 (Colletotrichus)、隐球丛赤壳属(Cryphonectria)等)的无效突变体，这表明G蛋白参与 广泛的信号转导途径信息素反应、对营养素的敏感性、不育性、生命培养(life growth)、毒力和病原性、子囊孢子的发育、形态发生、发光(light)。因此很明显灭活此类GPCR会干 扰病原真菌的至关重要的信号。总之，通过RNAi对任何生物的GPCR的干扰因而是极具特异性的，因为昆虫、线虫、 真菌和哺乳动物的GPCR之间的基因同源性的百分比从未超过20-30% (参见下面的表1)。 类似地，属于相同目的种的GPCR之间的同源性百分比从不完全相同(大约90% )，这确保 了对环境有害的生物和有益的生物的种之间的区别(数据未公布)。^l.给定的昆虫种与生物的其他种之间的同源性程度的实例人类 20-30%属于相同目的昆虫 90%属于不同目的昆虫 30-55%。到目前为止，大多数用作杀虫剂、杀线虫剂或杀真菌剂的物质是广谱性分子，因此 存在对特异性干扰有害生物的存活和能育性但同时对非靶生物和环境具有最低影响或无 影响的更具选择性方法的巨大需要。目前市场上提供的杀线虫剂是例如高毒性的、昂贵的 并且难以使用。作为在California和Florida用于控制果树和蔬菜上的线虫、真菌和细菌 的最广泛使用的产品二溴甲烷是一种神经毒素，其还降低大气中的臭氧。使用的其他杀线 虫剂是涕灭威(Temik)和1’1，3-二氯丙烯(TeloneII)，两者对于人类来说都是致癌性的。基于上文中所指出的，显然存在对更具选择性，从而具有更小的环境影响的特异 性干扰植物病原生物(即寄生虫和植食性动物)的存活和可育性的新方法和相关生物学靶 的需要。本申请者现已发现GPCR受体可以是用于控制植物的寄生虫和植食性动物例如真 菌、昆虫和线虫的方便的靶。许多此类GPCR事实上具有非常特异于有害生物的基因序列， 因此dsRNA的分子能够抑制其功能性并且不能损害宿主生物(植物)或所述植物的非靶消 费者(即，人类，其他动物)。特别地，本申请者已制备了利用dsRNA的表达抑制GPCR受体 的功能性的方法，所述受体的功能对于真菌、食草昆虫或植物病原体线虫是至关重要的。可与本发明的技术、目的相关的有利方面概述于下文中a)选择性，可损害食草昆虫、线虫或寄生性真菌，但不损害其他有益生物(即蜜 蜂)；b)食品安全，原因同上所述，而且还基于RNA分子可被容易地降解并且不保留在 环境中这一事实；c)在即使使用系统性化学处理(systemic chemicaltreatment)通常也特别难以 到达的植物部分(例如金字塔式的组织(pyramid))中也表达dsRNA的可能性；d)变应原性危险的潜在不存在，因为不表达宿主植物的新型蛋白质；e)利用适当选择克隆，选择与野生型具有高/完全蛋白质组学同源性的植物的可 能性。本申请者现已发现用于通过RNA干扰获得抗一种或多种植物病原体的攻击的转 基因植物的方法，所述方法包括下列步骤a)分离编码G蛋白偶联受体(GPCR)或其部分的cDNA核苷酸序列，所述受体的功 能对于所述植物病原体是至关重要的；b)构建表达载体，所述表达载体包含由两个特异性重组位点侧翼连接的通过步骤
6a)确定的编码GPCR或其部分的cDNA核苷酸序列；c)使步骤b)的表达载体与二元载体重组反应以获得重组质粒，所述二元载体包 含组成型或组织特异性启动子、相同的特异性重组位点和内含子序列；d)将所述重组质粒转移至根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的感受态 细胞内和转化植物；e)培养植物并且在所述植物中获得dsRNA的组成型或组织特异性表达。具体地，该方法使用双链RNA表达以抑制GPCR受体的功能性，所述受体的功能性 对于真菌、食草昆虫或植物病原体线虫是至关重要的，并且所述dsRNA在植物组织中表达 以使其能够通过真菌吸器(haustorium)被吸收或能被昆虫或线虫摄入。所述植物病原体优选选自当在幼虫状态下时通常为食草性的鳞翅类 (Iepidopteran)或鞘翅类(coleopteran)的昆虫、线虫和真菌。根据一些优选实施方 案，成虫或幼虫阶段的食草昆虫可以是海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)、烟芽夜 蛾(Heliotis virescens) 0根据另外的优选实施方案，所述线虫选自南方根结线虫 (Meloidogyneincognita)、北牛艮结线虫(Meloidogyne hapla)、马铃暮金线虫(Globodera rostochiensis)。再次地，根据一个优选实施方案，植物病原体真菌可选自粉孢子 (oidium)、锈菌、s印toriae、黑星菌(venturia)、链格孢(alternaria)。此类真菌可在叶面 或在植物的地下部分扩散，并且迁入表面部分以及更内部的组织。在本发明的精神中，可在整个植物的组织中组成性地或在某些部分例如叶面或在 根系统中通过使用特异性启动子(根特异性启动子)表达一种或多种dsRNA。植物的地下 部分中的表达的目的可以在于控制例如陆生植物病原体(terrestrial phytopathogen)， 然而在根系统中表达用于线虫或其他有害昆虫的控制。因此，根据本发明的一些优选实施 方案，当dsRNA表达是组织特异性的时，所述组织选自叶面、树干、根系、蓓蕾、花、果实。根据本发明的方法涉及选择一种或多种GPCR受体作为RNA干扰的靶，所述 受体必须对于将使得植物针对其产生抗性的植物病原体是至关重要的。视昆虫、线 虫或真菌而定，可将不同类型的GPCR受体用作靶。所述GPCR靶受体优选选自咽侧 体抑制激素(allatostatin) C或Α、章鱼胺/酪胺、PBAN肽、利尿激素、脂肪动员激素 (adipokinetichormone)、神经肽、多巴胺、血清素和视紫质样的受体。根据一个优选实施方案，其中，当所述食草昆虫是海灰翅夜蛾时，编码GPCR受体 或其部分的 cDNA 的核苷酸序列选自 AlstAR(SEQ IDNO:l)、Alst CR(SEQ ID NO 2) ,DHR(SEQ ID NO 3),AKHR(SEQ IDNO 4),LGRl(SEQ ID NO 5)、Oct/TyrR(SEQ ID NO 6)、0R83b(SEQID NO 7)和PBAN-R(SEQ ID NO :8)。关于其他鳞翅类种类，例如烟芽夜蛾，本发明者已发现与 斜纹夜蛾(Spodoptera)的咽侧体抑制素C的GPCR受体同源的GPCR受体可代表该类型的 食草昆虫的选择靶。关于使用本发明的方法获得抗线虫寄生虫特别是南方根结线虫种类的线虫寄生 虫的转基因植物而言，本发明的发明者已发现通过RNAi可沉默的6种可能的GPCR靶沉默 受体。编码上述GPCR受体的cDNA的核苷酸序列选自血清素样受体(秀丽隐杆线虫的血 清素受体的同源物，SEQ ID NO :9)、多巴胺样受体(秀丽隐杆线虫的多巴胺CeDop-I受体 的同源物，SEQ ID N0:10)、神经肽受体(秀丽隐杆线虫的神经肽的受体的同源物Q2TGX5_ MELIC，SEQ ID NO :11)和属于视紫质样GPCR家族的视紫质样受体(秀丽隐杆线虫的GPCR的同源物(T27D1. 3 ；T07D4. 1 ；B0563. 6 ；F02E8. 2)。根据本发明方法的一个优选实施方案，可在获得的转基因植物的组织中表达一种 或多种dsRNA。这样，可能获得表达2或3个不同类型dsRNA的品系，从而相同植物既可抗 植食性动物(其主要以叶为食)又可抗根部寄生虫的攻击。虽然保持了对单个种类有害生 物的抗性的特异性，但可产生抗各种种类甚至彼此极不相同的有害生物种类(即在系统发 育上属于完全远缘的类群(门))的植物。因此，根据本发明的一个特别优选实施方案，可 在每一个步骤中使用核苷酸cDNA序列平行地重复根据本发明的方法的步骤a至c)，以获得 一种或多种重组质粒(所述重组质粒用于d)共转化相同的植物或dl)转化不同的植物并 且将其杂交)，所述cDNA序列编码对于不同植物病原体(即线虫或昆虫、不同种的线虫、昆 虫或真菌)是至关重要的GPCR受体。由于转化植物之间的杂交育种，同样可产生表达抗昆 虫GPCR(即斜纹夜蛾、Heliotis)和抗线虫GPCR(南方根结线虫)的特异性dsRNA的植物。本发明还涉及RNA干扰技术用于保护具有农艺学利益的植物(例如，谷物、茄科 植物、藤本植物(vine)、蔬菜)、观赏植物(例如蔷薇等)、环境植物(例如针叶树、菩提树 (linden tree)、白杨等)的用途。根据本发明的一个优选实施方案，使用茄科植物，优选烟 草，更特别地烟草(Nicotiana tabacum)。本发明的另一个目的涉及抗一种或多种植物病原体的转基因植物，所述植物可按 照上文中定义的方法获得。按照本发明的方法进行了遗传改造以抑制植物病原体GPCR受 体的植物可用于生产目的在于用于人类或用于动物饲养的食物，而且还可用于生产用于工 业目的的生物质(纸、纤维、药理物质、用于能量产生的生物质或基础化学物质等)。根据本 发明的一个优选实施方案，所述转基因植物是对其最有危害性的寄生虫之一(昆虫海灰翅 夜蛾)有抗性的烟草植物。特别地，转基因烟草植物(即，烟草)表达能够抑制海灰翅夜蛾 GPCR 受体的 dsRNA(选自 AlstAR(SEQ ID NO :1)、AlstCR(SEQ ID NO 2)、DHR(SEQ ID NO 3),AKHR(SEQ ID NO 4)、LGRl (SEQ ID NO :5)、0ct/TyrR(SEQ ID NO :6)、0R83b(SEQ ID NO: 7)和PBAN-R (AF401480，SEQ IDNO :8)(通过相同昆虫在幼虫期摄入表达所述dsRNA的植物 组织)。在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及抗海灰翅夜蛾的转基因植物，其特征在 于其为烟草植物并且表达其中反义链与编码受体AlstCR(SEQ ID NO : 或DHR (SEQ ID NO 3)的mRNA互补的dsRNA。根据另一个优选实施方案，本发明涉及抗南方根结线虫的转基因植物，其特征在 于其为烟草植物并且表达其中反义链与编码SEQ IDNO 11的mRNA互补的dsRNA。因此本发明的一个目的涉及用于预防性处理植物以使其抗一种或多种昆虫、线虫 和植物病原体真菌的攻击的方法，其包括上述方法的步骤a) _e)。为了确保其最佳发育，必 要时，可将所获得的植物经历使用肥料、培养调节剂或生物刺激剂或使用杀真菌产品、除草 剂、杀虫剂和杀线虫剂(合成或天然的)的处理步骤。此类应用可允许相对于使用本专利 技术客体获得的抗微生物剂活性更低的选择寄生虫抗性的危险，并且使用杀虫剂与利用本 发明技术获得的抗微生物剂活性可能实现协同作用。现特别地参考附图，以举例说明性、但非限定性的目的描述本发明，其中-

图1显示从海灰翅夜蛾克隆的编码GPCR受体AlstAR、AlstCR、DHR、AKHR、LGRl、 OctR, 0R83b、PBANR 的 cDNA 的序列；-图2显示从南方根结线虫克隆的编码GPCR受体=MiSerRl样、MiDopRl样和MiNpRl样的cDNA的序列；-图3显示转基因植物AlstCR的RT-PCR分析(泳道1至7)；WTl和WT2 非转化 烟草植物；M 已知的分子量标准；C+ 质粒pENTR+AlstCR ；-图4显示与以表达特异于AlstCR的dsRNA的转基因烟草植物喂食海灰翅夜蛾幼 虫4周后的死亡率相关的直方图；-图5显示以表达特异于AlstCR和DHR的dsRNA的转基因烟草植物喂食的南方根 结线虫幼虫的死亡率的趋势；-图6显示与野生型植物和表达MiNpRl样/dsRNA的转基因植物被南方根结线虫 感染的烟草根的百分数相关的直方图。为了本发明的举例说明性的、但非限定性的目的，我们描述了茄科植物即烟草的 转化(以保护所述植物免受其两种最有害的寄生虫昆虫海灰翅夜蛾和线虫南方根结线虫 攻击)的两个实例。实施例1 转化烟草植物以保护其免受昆虫海灰翅夜蛾的攻击材料和方法GPCR靶的选择被选择作为本发明内此实施方案的靶的海灰翅夜蛾受体如下1. AlstAR(咽侧体抑制素A的推定的受体)；2. AlstCR(咽侧体抑制素C的推定的受体)这两个GPCR是至关重要的，因为它们结合其主要功能是抑制在“咽侧体”的部 分上合成保幼激素的咽侧体抑制素。除了参与变态激活过程(Weaver等人，1994)外，咽 侧体抑制素、神经肽对于调控肠平滑肌的收缩和在卵巢的发育和功能性方面也是重要的 (Aguilar 等人，2003 ；Meyering-Vos 等人，2006)；3. DHR (利尿激素DH的受体)对于利尿调控是重要的(Johnson等人，2004)；4. PBAN-R(信息素生物合成的激活神经肽PBAN的受体)其结合促进性信息素的 合成和释放的小肽(Rafaeli等人，2007)；5.AKHR(脂肪动员激素AKH的推定的受体)对于碳水化合物和脂质的代谢并且对 飞行性能也是重要的(Maubli等人，2002)；6. LGRl (含有富含亮氨酸的重复的G蛋白偶联受体)属于含有富含亮氨酸的重复 的G蛋白偶联受体(LGR)种类并且在生殖中发挥基础作用(Nishi等人，2000)；7. Oct/TyrR，章鱼胺和酪胺的推定的受体其能够与神经递质例如章鱼胺和酪胺 相互作用，从而在感觉和分泌器官的神经调节过程中是重要的(Farooqui，2007)；8. 0R83b (嗅觉受体家族的受体)；与嗅觉受体(OR)家族的只在嗅觉感觉神经元的 小的亚群体中表达的其他成员不同，ORSIBb在几乎所有触角神经元中表达(Neuhaus等人， 2005)。其并非在嗅觉功能中发挥直接作用，而是与常规OR成员相互作用并且是它们从细 胞体定位至感觉纤毛所必需的，在所述感觉纤毛中发生与有气味的分子的相互作用。由于 其在嗅觉系统中发挥的总体作用，ORSIBb对于气味的感觉，从而对于昆虫的营养是绝对至关 重要的。为了进行RNAi实验，从斜纹夜蛾克隆所有编码GPCR的序列，但已存在于数据库中 的编码PBAN-R的基因(AF401480)除外。
使用通过比较不同昆虫种类的此类基因中的保守区域而产生的简并引物，利用通 过从海灰翅夜蛾提取的总1 離反转录的00嫩，分离编码受体418丨41 、0冊、11^1、(《8313、0(^/ TyrR的序列以及编码受体AlstCR和受体AKHR的序列的部分。在另一方面，对于PBAN-R， 使用从V期幼虫分离编码序列的特异性引物。对于其它受体，基于文献中可获得的表达数 据，使用昆虫的不同组织和培养期分离序列。具体地，从卵扩增编码受体LGR的基因，而从 V期幼虫分离DHR ；利用从个体成虫的头部提取的RNA扩增编码受体AlstAR、AlstCR、AKHR、 0R83b、Oct/TyrR的基因。测定PCR产物的序列并且将其用于设计5’和3’ RACE-PCR实验 的特异性引物。将分离的序列克隆在质粒pCR 2, 1-T0P0 (Invitogen)中并且进行完全 测序(图1)。选择的受体的分离和克隆受体AlstAR的克降为了分离编码海灰翅夜蛾的咽侧体抑制素A的受体的cDNA，基于通过家蚕、黑腹 果蝇和美洲大蠊的同源受体的氨基酸序列之间的比对确定的保守区设计简并引物。引物的 序列示于下面(括号内的核苷酸表示简并的位置；引物即是寡核苷酸的混合物，各自在该 特定的位置上包含不同的核苷酸)IFw :atg (ac) g (acgt) (at) (gc) (acgt) ac (agct) ac (agct) aa (tc) (tc) t (agct) (tc) t(agct)at(tc)a(ag) (tc) (SEQ ID NO :12)2Fw gt (agct) cc (agct) tt (tc) ac (agct) gc (agct) ac (agct) ga (tc) ta (tc) gt (agct)atg(SEQ ID NO :13)IRv :gt(agct)ac (agct) (ac) g(agct)atggt(agct)gt(agct)gt(agct)gt (agct) gt (agct)(SEQ ID NO :14)2Rv :tgg (at) s (agct) tg (tc) gt (agct) aa (tc) cc (atcg) gt (atgc) (ac) t (tc) ta (tc) gc (agct)(SEQ ID NO :15)。使用由!Iomega商业化的试剂盒从海灰翅夜蛾个体成虫的头提取总RNA。将RNA 的样品经历使用rDNasil (Ambion)的处理以消除污染的基因组DNA。在变性的上样染料 存在的情况下，将2μ 1 RNA加载至琼脂糖凝胶上并且使用RNA的特异性分子量标 准(i^rmentas)作为参照进行定量。将基因工具软件(Perkin Elmer)用于定量。使用 RevertAid M-MuLV 逆转录酶(Fermentas)和 500ng oligodT (Promega)将 1 μ g 总 RNA 转录 成 cDNA。通过cDNA的扩增，经过30个PCR循环(在98°C下进行10秒，在50°C下进行30 秒，在72°C下进行30秒)、然后在72°C下延伸10分钟而获得507bp的片段。在于相应缓 冲液中含有2. 5 μ M浓度的各引物、0. 2mM脱氧核苷酸(Fermentas)和1个单位的Wiusion High-FidelityDNA聚合酶(Finnzymes)的50 μ 1体积中进行反应。将获得的片段克隆入克隆载体pCR2. ldnvitrogen)，然后使用特异于所述载体的 寡核苷酸 M13Fw 和 M13Rv 测定序列(CeingeBiotecnologie Avanzate scarl)。基于所述序列，设计下列寡核苷酸组以分别用于3’ RACE(组1 ；有义)和 5，RACE (组 2 ；反义)ILl Is GCATCCCATAGCTTCCATGT (SEQ ID NO 16)
2s GGTGATATTAACCACAGCTATTCCCGTGGGC (SEQ ID NO :17)3s GTATGCTGACGAGGTTGTGGAAGAGTGCTCC (SEQ ID NO :18)4s AAGGTGACGAGAATGGTTGTG (SEQ ID NO :19)5s GCGCAGATAGTGTCGCATGTA (SEQ ID NO :20)组2 las AGACGACTCTTCCACAACCTCGTCAGCATAC (SEQ ID NO :21)2as GTTAATATCACCACCCATAT (SEQ ID NO :22)3as GCCCACGGGAATAGCTGTGGTTAATATCACC (SEQ ID NO :23).使用5’ /3’ RACEKIT(其中锚定引物和oligo(dT)锚定引物用其序列示于下文中 的oligo SLl和oligo (dT) SLl替代)通过PCR-RACE获得基因的5，和3，末端SLl GGTTTAATTACCCAACTTTGAG(SEQ ID NO 24)dTSLl GGTTTAATTACCCAACTTTGAGTTTTTTTTTTTTTTTT(ACG)(SEQID NO 25).用引物Is和SLl扩增使用1.87 μ M引物dTSLl合成的1 μ 1 cDNA,以获得该基因 的3，末端。扩增条件是40个循环(包括在98°C下进行10秒、在46°C下进行30秒、在 72°C进行30秒的循环)，然后在72°C下延长10分钟。使用上述条件作为扩增条件，使用引 物SLl与组1的各引物组合来进行随后的扩增。如上所述获得650bp的片段，将其克隆在pCR2. 1中并且进行测序。为了扩增5’末端，遵循由试剂盒的提供商指定的方案，并且使用引物Ias用于合 成cDNA，使用引物2aS-3aS和SLl进行扩增。获得大约500bp的片段，克隆该片段并且进行 测序。为了获得编码整个基因的cDNA，使用下列引物扩增用于与简并引物反应的 μ cDNA 5，-ATGGCGTCGACTGAAGAC-3，(SEQ ID NO 26)3，-TCAGACGATGTCATGGCA-5，(SEQ ID NO 27).使用的扩增条件如下40个循环(包括在98°C下进行10秒，在60°C下进行30秒 和在72°C进行1分钟)，然后在72°C下延长10分钟。获得大约1080个碱基的片段，将其克 隆在载体PCR2. 1中，并且进行测序。受体0R83b的克隆为了分离编码海灰翅夜蛾的受体ORSIBb的cDNA，设计特异性的反向引物和简并的 正向引物。正向引物的简并性只对一个位置感兴趣，因为来源于甜菜夜蛾、烟芽夜蛾、美洲 棉铃虫和甘蓝夜蛾的各自核苷酸序列之间的比对显示彼此之间具有非常高的保守程度。引 物的序列示于如下Fw ATGACCAA(AG)GTGAAGGCCCAG (SEQ ID NO :28)Rv GTGTTGGTACAACTCAAGTAA (SEQ ID NO :29)。使用如之前的段落中所述制备的cDNA，在30个循环(包括在98°C下进行10秒， 在50°C下进行30秒和1. 5分钟的延伸)中使用的两个引物中每一个各250nM扩增该1 μ 1 的cDNA。获得大约1，500bp的片段，如上所述将其克隆入载体pCR2. 1并且进行测序。受体DHR的克隆为了分离海灰翅夜蛾的受体DHR的cDNA，基于烟草天蛾、黑腹果蝇、稻褐飞虱和美
11洲蟋蟀的相应蛋白质序列间的比对设计简并引物。使用的引物的序列如下IFw TT (TC) (TC) T (ATCG) TA (TC) TT (TC) AA (AG) GA (ATCG) (TC) T (ATG) (AC) G (ATCG) TG(TC) (SEQ ID NO :30)2Rv :A (AG) (TC) TT (ATCG) GT (ATCG) AT (ATCG) A (AG) (ATCG) ACCCACAT (ATCG) AT (SEQ ID NO 31)。使用已描述的方法从V期幼虫提取RNA。为了定量RNA和合成cDNA，使用针对Als tAR的克隆所描述的方案。通过45个扩增循环(包括在98°C下进行10秒，在48°C下进行30秒和在72°C下 进行1分钟)，然后在72°C进行10分钟的延伸来获得550bp的片段，然后将其克隆入载体 PCR2. 1并且进行测序。基于序列，设计特异性引物并且按照已描述的方法将其用于随后的3’和5’ RACE 反应。引物的序列如下组1:Is AACCTCATGTCGACGTATATTCTGTCT (SEQ ID NO 32)2s ATGCTTGTAGAAGGTTTGTACCTGTAC (SEQ ID NO :33)3s TGGGTTATATGCAGGTGCTTCGTCAAC (SEQ ID NO :34)组2:las GGATGGGGTGCGCCGGCGGTGTTCCTA (SEQ ID NO :35)2as CATACATATGACCAGAATCGTACACGA (SEQ ID NO :36)3as GGCGAGGTAGATGAGGCTGGTGACGTC (SEQ ID NO :37)。对于3，，通过40个扩增循环(包括在98°C下进行10秒，在46°C下进行30秒和在 72°C下进行1分钟)、然后在72°C下延伸10分钟分离到大约650bp的片段。对于5’，按照 上述方法通过40个扩增循环获得大约500bp的片段。将下列引物用于完整cDNA的分离5，-ATGGCGGAGAAGTGCCTGGCG-3，(SEQ ID NO 38)3，-TCATACCGTGAGTCGTATGCT-5，(SEQ ID NO :39)。使用1 μ 1 cDNA (利用从V期幼虫提取的RNA合成的)，利用Fw和Rv引物通过45 个扩增循环(包括在98°C下进行10秒，在55°C下进行30秒和在72°C下进行30秒)、然后 在72°C下延伸10分钟来扩增1190bp的片段。受体LGRl的克隆为了分离海灰翅夜蛾的受体LGRl的cDNA，基于家蚕、黑腹果蝇和埃及斑蚊的相应 蛋白质序列间的比对设计简并引物。使用的引物的序列如下IFw :GC (ATGC) TA(TC) (TC) T (AGCT) AC (AGCT) CA (TC) (GC) (AGCT) (AGCT) TT (TC) CA (TC) TG (TC) TG (TC) (SEQ ID NO :40)IRv :TC (AGCT) A (TC) (AGCT) GG (AGCT) A (AG) (AG) CA (AGCT) AT (AGCT) (GC) (AT) (AGCT)GT(SEQ ID NO :41)。按照已描述的方法从海灰翅夜蛾的卵提取RNA。为了定量RNA和合成cDNA，使用 针对克隆AlstAR描述的方案。通过45个扩增循环(包括在98°C下进行10秒，在48°C下进行30秒，在72°C下进行1. 5分钟)、然后在72°C下延伸10分钟来获得大约1，250bp的片段，然后将其克隆入载 体pCR2. 1并且进行测序。根据序列的分析，设计了下述引物，然后通过之前描述的方法将其用于随后的3’ 和5，RACE反应组1:Is TGATGAAAATGCCTTCGC (SEQ ID NO 42)2s CACGAACCAGTCAACAACAC (SEQ ID NO :43)3s GAAAGCGTACCTGACGCATCATTTCCA (SEQ ID NO :44)4s GTTATCAGTAATTACTTTAACTATAGT (SEQ ID NO :45)组2:las ACTGCCGGAGTCTGAGAAGTA (SEQ ID NO :46)2as GTACTCCTCGCTCGTAGTCG (SEQ ID NO :47)3as CATTTCGACTGCATTATAGC (SEQ ID NO :48)4as GCCTTCTAGGTCTATAGCTTG (SEQ ID NO :49)。按照之前段落中描述的方法，通过对从海灰翅夜蛾卵提取的RNA开始合成的cDNA 进行35个扩增循环来分离大约500bp的片段和860bp的片段，将其克隆入载体pCR2. 1，并 且分别在3’和5’进行测序。为了分离相应于编码海灰翅夜蛾受体LGRl的完整序列的cDNA，使用分别相应于 末端5’和3’的下列引物5，-ATGTATTGGAGATTATGTATTTGGGCT-3，(SEQ ID NO 50)3，-TTAAAGCGGTACCTCACTACTGTCTTT-5，(SEQ ID NO :51)。通过标准扩增方法分离、克隆2，250bp的片段并且进行测序。受体Oct/TyrR的克隆为了分离编码海灰翅夜蛾的受体Oct/TyrR的cDNA，基于家蚕、烟芽夜蛾和甘蓝夜 蛾的相应基因的核苷酸序列之间的比对设计简并引物。使用的引物的序列如下IFw CCAGAATGGGA(AG)GC(AT)AT (TC)TGCAC (SEQ ID NO :52)2Rv AC (AG) CCCATTAT (TG) AT (AG) CC (TC) AG (AG) G (SEQ ID NO :53)。将引物用于从按照上述方法制备的、从个体成虫的头提取的RNA合成的cDNA扩增 1，090bp的片段。在将片段克隆入载体pCR2. 1并且测序后，设计用于3’和5’ RACE反应的 下列引物组1:Is CCAGAAAATTGACACCAA (SEQ ID NO 54)2s GAGAGTAACTCGAAAGAAAC (SEQ ID NO :55)3s TGCTGTTTATCAATTCATTGAAGA (SEQ ID NO :56)组2:las AGTTCTTTTTTTAGTGGCCAAA (SEQ ID NO :57)2as GACAAGGCGTATCAGGTTC (SEQ ID NO :58)3as ACCCTAGAAGTGGCGGAGAGCTAATA (SEQ ID NO :59)。
按照上述段落中描述的方法，通过对由从海灰翅夜蛾的个体成虫的头提取的RNA 开始合成的cDNA进行40个扩增循环来分离大约380bp的片段和590bp的片段，将其克隆 入载体PCR2. 1，并且分别在3，和5，进行测序。为了分离相应于编码受体Oct/TyrR的完整序列的cDNA，使用下列引物5，-ATGGGGCAAACAGCTACACAC-3，(SEQ ID NO 60)3，CTCTGTATGAAACCGTGA-5，(SEQ ID NO :61)。通过40个扩增循环(包括在98°C下进行10秒，在55°C下进行30秒和在72°C下 进行1分钟)分离1，434bp的片段并且克隆和测定其序列。受体PBANR的克降受体PBANR的序列已可在数据库中获得，因而设计相应于编码区的5’和3’的引 物，其序列示于下文中5，-ATGACATTGTCAGCGCCCCCGATC-3，(SEQ ID NO 62)3，-TCAATCATGAATGTAACA-5，(SEQ ID NO :63)。按照上述方法，将引物用于扩增从由V龄幼虫提取的RNA开始合成的1 μ 1 cDNA. 通过进行40个循环(包括在98 V下进行10秒，在55 °C下进行30秒，在72 °C下进行40秒)、 然后在72°C下延伸10分钟来进行扩增。获得1，053bp的片段，然后按照所述方法将其克隆 入载体pCR2. 1并且进行测序。克降编码警体AlstCR的序列的一部分为了分离海灰翅夜蛾的受体AlstCR，基于蜜蜂、黑腹果蝇和冈比亚按蚊的各自蛋 白质序列之间的同源性设计下列简并引物IFw :GA (AG) TG (TC) TT (TC) (TC) T (AGCT) AT (ATC) GG (ATGC) (SEQ IDNO :64)IRv (ATGC) GC (AG) CA (ATGC) GT (AG) CA (ATGC) GC (TC) TT (SEQ IDNO :65)。通过在45°C下进行40个扩增循环，将引物IFw和IRv用于扩增从由个体成虫的头 提取的RNA转录的cDNA。分离726bp的片段，然后将其克隆入载体pCR2. 1并且进行测序。克隆编码受体AKHR的序列的部分为了分离海灰翅夜蛾的受体AKHR，基于家蚕和美洲大蠊的相应受体的核苷酸序列 之间的同源性设计下列简并引物IFw :GACCTGATGTGC(AC)G(AC) (AG)TCATG (SEQ ID NO :66)IRv:GTC(AG)ATCCA(AG)TACCACAG(AG)CA (SEQ ID NO :67)。通过在45°C下进行40个扩增循环，将引物IFw和IRv用于扩增从由个体成虫的头 提取的RNA转录的cDNA。分离534bp的片段，然后将其克隆入载体pCR2. 1并且进行测序。在质粒pENTER和PH7GW1WG2中克隆受体通过消化或使用与待分离的基因的序列同源的正向引物和反向引物通过PCR从 质粒pCR 2. 1 -Τ0Ρ0 分离编码受体 Al stAR、Al stCR、DHR、ΑΚΗ、0R83b 和 Oct/TyrR 的基 因，所述引物具有与质粒PENTR的多接头相容的限制性酶EcoRI (正向引物)和SioI (反向 引物)的识别序列。使用具有BamHI酶的识别序列的正向引物和包含B10 I位点的反向引 物，利用质粒pCR 2. 1-T0P0扩增LGRl受体。为了克隆PBAN受体，将包含EcoRI位点的正
向引物与具有被NotI酶切割的序列的反向引物一起使用。引物的序列示于下文中AlstAR Fw 5’ -GGAATTCCATGGCGTCGACTGAAGAC-3，0187](SEQ ID NO 68)
0188]AlstAR Rev 5’ -CCTCGAGGTCAGACGATGTCATGGCA-3’
0189](SEQ ID NO 69)
0190]AlstCR Fw 5’ -GGAATTCCCTGCGTTCCATTCACTGCTA-3’
0191](SEQ ID NO 70)
0192]AlstCR Rev 5’ -CCTCGAGGAAGAATTGGGTTCATGGCAG-3，
0193](SEQ ID NO 71)
0194]DHR Fw 5’ -GGAATTCCGATGGCGGAGAAGTGCCTGGC-3，
0195](SEQ ID NO:72)
0196]DHR Rev 5’ -CCTCGAGGGTCATACCGTGAGTCGTATGC-3，
0197](SEQ ID NO :73)
0198]AKH Fw 5' -GGAATTCCGGACCTGATGTGCCGAGTCATG-3'
0199](SEQ ID NO :74)
0200]AKH Rev 5’ -CCTCGAGGGCTTGTCGATCCAATACCAC-3，
0201](SEQ ID NO :75)
0202]LGR 15， -CGGGATCCCGGATGTATTGGAGATTATGTATTTGGGC-3’
0203](SEQ ID NO :76)
0204]LGRl Rev 5' -CCTCGAGGGTTAAAGCGGTACCTCACTAC-3'
0205](SEQ ID NO :77)
0206]0R83b Fw 5’ -GGAATTCCGATGACCAAAGTGAAGGCCCAGG-3’
0207](SEQ ID NO :78)
0208]0R83b Rev 5’ -CCTCGAGGGTTACTTGAGTTGTACCAACACC-3’
0209](SEQ ID NO :79)
0210]Oct/TyrR Fw 5’ -GGAATTCCGGGGCAAACAGCTACACACG-3’
0211](SEQ ID NO :80)
0212]Oct/TyrR Rev 5’ -CCTCGAGGGTCACGGTTTCATACAGAGTAAC-3，
0213](SEQ ID NO :81)
0214]PBAN-R Fw 5’ -GGAATTCCGATGACATTGTCAGCGCCCCCG-3，
0215](SEQ ID NO :82)
0216]PBAN-R Rev 5' -TAAAGCGGCCGCTCAATCATGAATGTAACAAAAA-3'
0217](SEQ ID NO :83)。
0218]使用50ng质粒DNA，200yM的dNTP，0. 25 μ M正向引物，0. 25 μ M反向引物，5x Phusion HF 缓冲液，IU 的 Phusion High-FidelityDNA 聚合酶(Finnzyme s)在 50 μ 1 的终 体积中进行扩增反应。扩增程序包括在98°C进行30秒的变性循环，35个循环(在90°C下 进行10秒，在52°C下进行30秒，在72°C下进行1分钟)和在72°C下进行10分钟的1个终 延伸循环。在的琼脂糖凝胶上分离大约5μ1的扩增产物以确认其质量和分子量。在 从用于扩增的试剂中纯化后(GenEluteTMPCR Clean-邱试剂盒，SIGMA)，将剩余的PCR反应 物经历使用20U的适当限制性内切酶的消化，以产生粘性末端用于随后在载体pENTR(其也 使用相同的限制性内切核酸酶消化)中进行克隆。使用20u的T4DNA连接酶(Biolabs)，
15在16°C下于20 μ 1的体积中进行受体的基因(200ng)和载体pENTR(300ng)之间的连接反 应。将10 μ 1的连接酶反应用于转化涂板在具有抗生素卡那霉素(50mg/l)的LB上的大肠 杆菌(E.coli)DH5感受态细胞以选择具有pENTR质粒的细胞克隆。在37°C下用液体LB和 卡那霉素接种获得的集落，进行整个晚上。提取质粒DNA(Wizard PlusSV Minipreps DNA纯化系统，Promega)并且用 IOu 的适当的限制性内切酶进行消化。将具有克隆的受体的pENTR质粒用于与二元载体pH7GWlWG2(I)的重组反应。在 BIGatewaysLR clonase II Enzyme Mix(Invitrogen)150ng pENTRM 粒与300ng pH7/GWlWG2(I)于25°C下一起温育2小时。然后在37°C下用蛋白酶K阻断反 应，进行10分钟，将其用于转化DH5 α细胞。通过用限制性内切酶消化分析质粒，然后通过 测序分析进一步确认。利用冷冻/除霜(freezing/defrosting)技术使用重组质粒转化根 癌土壤杆菌的感受态细胞(C58)。向100 μ 1的感受态细胞中加入约10 μ g质粒并且将其在 冰上温育5分钟。将细胞置于干冰/乙醇中进行5分钟，然后转移至37°C下进行10分钟。 向细胞中加入Iml LB，将其在下温育3小时，然后涂板在含有利福平100mg/l和壮观 霉素IOOmg/1的LB上。利用特异于每一个克隆的受体的引物通过PCR分析抗性集落。使用dsRNA转化烟草将Gateway技术用于在烟草植物中表达dsRNA 从其中它们已被克隆并且序列已 被测定的pCR 2.1-TGPG 质粒分离编码受体的序列。使用与基因序列互补并且具有被 用于质粒pENTRanvitrogen)克隆的限制性内切酶识别的位点的寡核苷酸进行PCR反应。 该质粒是一种进入载体(Entry Vector)，其除了克隆DNA序列外，还由于存在侧翼连接克 隆PCR产物的2个特异性重组位点(attLl和attU)而允许被转移入表达载体(目的载 体，Destination Vector)。将重组克隆与二元载体pH7GWIWG (I)(植物系统生物学Plant System Biology)用于重组反应以进行植物表达。该质粒的特征在于存在启动子35S用于 克隆在位点attRl和attR2下游的基因的组成型表达，所述位点attRl和attR2用于与进 入载体重组并且将克隆基因的5’ -3’链转移至一个内含子序列上游和另一个相同内含子 序列的下游。组成型启动子的存在确保了基因的表达，而内含子序列允许dsRNA的形成。 pENTR的位点attLl和attL2与pH7GWIWG(I)的位点attRl和attR2之间的重组反应由酶 Gateway LR Clonase (Invitrogen)介导。通过使用限制性内切核酸酶进行消化，然后 通过测序进一步验证来表征重组质粒。将此类质粒转移至根癌土壤杆菌(菌株C58)的感 受态细胞以转化烟草植物。对于各构建体，将大约50个叶盘(leaf disk)与其共培养，并 且将相同量的叶盘与用空质粒pH7GWIWG(I)转化的土壤杆菌共培养作为对照用于随后的 生物学测试。在用具有表达单个克隆的受体的质粒PH7GW1WG2的根癌土壤杆菌转化烟草植物 后，将叶外植体与在下培养的100 μ 1细菌培养物共培养3天，直至在IOml的液体培养 基 A10(3.6g/1 B5，250mg/lNH4N03，500mg/l MES，2%葡萄糖，1 μ g/ml 苄氨基嘌呤，0. 1 μ g/ ml萘乙酸，pH 5. 7)存在的情况下达到DO6tltl = 0. 8 通过用含有头孢噻肟500 μ g/ml的新 鲜AlO培养基漂洗叶子的碎片来除去土壤杆菌。然后在抗生素潮霉素(30mg/l)存在的情至固体All培养基上。每周一次将外植体转移至新鲜培养基上直至愈伤组 织形成，将其置于A12(具有等于200yg/ml头孢噻肟浓度的All)上。将苗转移至固体MS 30 (Murashige 和 Skoog 4. 4g/l，蔗糖 30g/l pH 5.7)和潮霉素上。转基因植物的表征从0. 5g培养在选择培养基上的烟草植物的叶子提取基因组DNA (GenElute Plant Genomic DNA minipr印试剂盒，Sigma)，将其用作模块用于通过PCR验证外源DNA 的存在。通过从转基因植物的叶子提取RNA(GenElute Mammalian Total RNA Miniprep 试剂盒，Sigma)以进行cDNA的逆转录来就dsRNA的存在情况进一步表征对PCR呈阳性的 植物。为此目的，将2 μ g总RNA与250ng的随机六聚物(Randomhexamer) (Invitrogen)于 70°C下一起温育5分钟，然后在冰上进行5分钟。向反应物中加入含有ImM dNTPUX反应 缓冲液、20u核糖核酸酶抑制剂的溶液，将混合物在25°C下温育5分钟。向样品中加入200u RevertAid M-MuLV Reverse，将反应物在25°C下温育10分钟，然后在42°C下进行60分 钟，然后在70°C下进行10分钟。将1μ 1 cDNA用于PCR反应，并且对每一个受体，采用用于在pENTR中进行克隆的 引物。使用海灰翅夜蛾的幼虫进行的测试为了进行对ds RNA/AlstC-R和dsRNA/DHR转基因植物的生物学测试，使用海灰翅 夜蛾的III龄幼虫。将每一个幼虫置于具有6cm直径的容器，其中每天引入一个转基因品 系的叶子碎片。作为对照，用经空质粒转化(从而不表达任何dsRNA)的植物的叶子喂食同 龄幼虫。结果通过对从叶子提取的基因组DNA进行PCR就异源基因的存在情况表征在选择培 养基上再生的植物，通过对从总RNA逆转录的cDNA进行RT-PCR来验证dsRNA的产生。图 3显示对AlstC-R转基因植物进行的dsRNA的RT-PCR分析。在全部分析的7个品系中， dsRNA的表达水平相当高，然而在对照植物(WTl和WT2)中未检测到表达。为了确保扩增反 应正确进行，将含有AlstCR基因的质粒的阳性对照(C+)用作模板。对于表达其他受体的 dsRNA (AlstA-R, DHR、PBAN-R、OctR)的植物获得类似的结果。通过嫩枝插穗(nodal cutting)微繁殖全部阳性转基因植物，以获得待用幼虫测 试的单个转化株的均一群体。使用以在无菌条件下培养的转基因植物的叶碎片饲喂的海灰翅夜蛾的I龄幼虫 进行幼虫测试。一起培养幼虫直至III期，然后将每一个幼虫分离在IOcm-培养皿中，其中 每天加入叶子碎片，进行昆虫整个生命周期直至达到蛹期。在第一预实验中，对于每一个转基因品系，将20个幼虫用于测试。图4中的图表 显示从对表达针对AlstC-R的dsRNA的植物进行生物监测获得的结果。分析的转基因品 系(C2、C3、Cfe和C7)标示于横坐标轴上，而死亡百分率标示于纵坐标上。很明显以转基 因植物喂食的幼虫相对于以对照植物(WT)喂食的幼虫显示高得多的死亡百分率。在4周 的喂食后，以对照为食的幼虫显示大约3%的死亡率，而以转基因品系为食的幼虫具有大约 80%的死亡率(品系AlstC-R 5a和7)和100%的死亡率(品系AlstC_R2和3)。在第二实验中，测试以两种转基因品系(分别表达针对AlstCR和DHR的dsRNA)
17为食的幼虫的死亡率，并且将其与以Wt植物为食的对照幼虫相比较。从I龄幼虫开始，在 10天的时间内测量幼虫群体的死亡率。在图5中显示的图表中，以两种转基因植物为食的 幼虫的死亡率在8天后达到100%，然而在对照中仍然为60%。该实验清楚地表明，AlstCR 和DHR的dsRNA在植物中的存在导致了幼虫生活力的显著降低，从而确认了本发明提出的 技术的有效性。实施例2 转化烟草植物以保护其免受线虫南方根结线虫的伤害材料和方法GPCR靶的选择从南方根结线虫克隆的并且选择作为本发明此实施方案的靶的该生物的GPCR受 体如下1.秀丽隐杆线虫血清素受体的同源物，称为MiSerRl样(图2 ；SEQ ID NO 9)；2.秀丽隐杆线虫CeDop-I多巴胺受体的同源物，称为MiDopRl样(图2 ；SEQ ID NO 10)；3.秀丽隐杆线虫CeNPRl样神经肽的同源物，称为MiNPRl样(图2 ；SEQ ID NO 11)；4.秀丽隐杆线虫推定的GPCR的同源物(T27D1. 3)(属于视紫质样GPCR的家族)， 称为MiRhol样；5.秀丽隐杆线虫推定的GPCR的同源物(T07D4. 1)(属于视紫质样GPCR的家族)， 称为MiRho2样；6.秀丽隐杆线虫推定的GPCR的同源物(B0563. 6)(属于视紫质样GPCR的家族)， 称为MiRho3样；7.秀丽隐杆线虫推定的GPCR的同源物(F02E8. 2)(属于视紫质样GPCR的家族)， 称为MiI ho4样。除了这6个受体外，还在数据库中鉴定到相应于目的GPCR的另一个序列=MiNpRl 样0i2TGX5_MELIC)，其是模式线虫秀丽隐杆线虫的神经肽受体的类似物(图2，SEQ ID NO 11)。用包含受体MKerRl 样(SEQ ID NO 9) ,MiDopRl 样(SEQ ID NO 10)和 MiNpRl 样 (SEQ ID NO=Il)的基因序列(其在植物中产生dsRNA)的质粒转化烟草植物。分析的受体 的核苷酸序列示于图2中。南方根结线虫的受体的克隆为了从南方根结线虫克隆受体MiSerRl样和MiDopRl样，用线虫的同源受体的 不同多肽序列查询南方根结线虫的表达序列的数据库(可在http //www, nematode, net/ BLAST/Cluster. BLAST/index. php 上获得的)。鉴定的克隆为-Aff 735607 (对于 MiSerRl 样)-Aff 571066 (对于 MiDopRl 样)。从鉴定的克隆的序列开始，设计特异性寡核苷酸，并且将其用于扩增受体序列的 部分。然后使用之前描述的5’和3’Race法获得完整受体的序列。关于MiNprl样受体，使用 该基因的5’和3’上的特异性引物进行克隆，所述基因的序列已存在于数据库中0i2TGX5_MELIC)。用于扩增的寡核苷酸如下
对于 MiSerRl 样(SEQ ID NO 9)MiserRFlGATTTGGAAAATTTGGACGAT(SEQIDNO:84)
MiserRF2GGAGGGTCTTTTGTCCATGCA(SEQIDNO:85)
MiserRF3TCTCATCCAATAATTGCAATT(SEQIDNO:86)
MiserRRl:ACGTAATGCTGAATATCGAAG(SEQIDNO:87)
MiserRR2CAAATTTAAAATTGAAGCAGT(SEQIDNO:88)
MiserRR3:AGCCAAAGCAAGTGATATAAG(SEQIDNO:89)对 MiDopRl 样(SEQ ID NO 10)MidopR Fl:ACTCTTGGTGTTATTATGGGC(SEQIDNO:90)
MidopR F2TGGCTAGGTTATGCCAATTCT(SEQIDNO:91)
MidopR F3CGAGACTTTCGACGTGCCTTT(SEQIDNO:92)
MidopR Rl:AAAGGCACGTCGAAAGTCTCG(SEQIDNO:93)
MidopR R2:AGAATTGGCATAACCTAGCCA(SEQIDNO:94)
MidopR R3GCCCATAATAACACCAAGAGT(SEQIDNO:95)。下列寡核苷酸用于完整编码区的扩增MiserR 正向ATGTTAGAAAATGATTTGGAAAA (SEQ ID NO 96)MiserR 反向TTATTTTGATGATTCCATCA (SEQ ID NO 97)MiDopR 正向ATGTTGCCCTGGTGGCTACCTCT (SEQ ID NO 98)MiDopR 反向TTAAAAACATAAAAATCTCA (SEQ ID NO 99)MiNprR 正向ATGGAAGCATCTACAATGGAATT (SEQ ID NO 100)MiNprR 反向TCATATCCTCTCATCTGTAT (SEQ ID NO 101)。将所扩增的受体克隆入载体PCR2. 1 (Invitrogen)并且进行测序。与实施例1中针对编码海灰翅夜蛾的GPCR受体的基因所描述的类似，将南方根结 线虫的cDNA转移入质粒pENTER中，然后转移入用于植物的二元载体PH7GW1WG2中。将表达相应于南方根结线虫的Mi NPRl样的dsRNA的转基因品系用于根感染测 试ο根感染实验将2周龄的烟草植物转移至装有与大约5-6个南方根结线虫虫瘿(gall)(之前从 其他感染植物的根切取的)混合的无菌土壤的16cm-盆中。6周后，除去土壤，就虫瘿的存 在情况分析植物的根。测量转基因植物感染的总生物质的量，并将其与WT对照未感染植物 感染的总生物质的量相比较。结果如上所述，用南方根结线虫蠕虫感染属于3个不同的表达NPRl样dsRNA的转基因 品系的烟草植物。3周后，估计转基因植物中感染根的百分数并且将其与未转化对照植物 (WT)的所述百分数相比较。如图6中显示的，转基因植物的根与WT植物相比较显示感染水 平的降低。该结果表明，表达南方根结线虫NPRl样基因的dsRNA的转基因植物对线虫感染 更具抗性，从而确认此处提出的技术也可用于保护植物免受线虫攻击。参考书目
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权利要求
1.用于制备通过RNA干扰对一种或多种植物病原体的攻击有抗性的转基因植物的方 法，其包括下列步骤a)分离编码G蛋白偶联受体(GPCR)或其部分的cDNA核苷酸序列，所述受体的功能对 于所述植物病原体是至关重要的；b)构建表达载体，所述表达载体包含由两个特异性重组位点侧翼连接的通过步骤a) 确定的编码GPCR或其部分的cDNA核苷酸序列；c)使步骤b)的表达载体与二元载体进行重组反应，获得重组质粒，所述二元载体包含 组成型或组织特异性启动子、相同的特异性重组位点和内含子序列；d)将所述重组质粒转移至根癌土壤杆菌的感受态细胞内和转化植物；e)培养植物并且在所述植物中获得dsRNA的组成型或组织特异性表达。
2.权利要求1的方法，其中所述植物病原体选自食草昆虫、线虫和真菌。
3.权利要求2的方法，其中所述食草昆虫选自海灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis), 烟芽夜蛾(Heliotis virescens)。
4.权利要求2的方法，其中所述线虫选自南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、北 IH π^^. (Meloidogyne hap la) (Globodera rostochiensis)。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中当dsRNA表达是组织特异性的时，所述组织选 自叶面、根系、树干、蓓蕾、花、果实。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述GPCR受体选自咽侧体抑制素A或C、章 鱼胺/酪胺、PBAN肽、利尿激素、脂肪动员激素、神经肽、多巴胺、血清素或视紫质样的受体。
7.权利要求6的方法，其中当所述昆虫是海灰翅夜蛾时，编码GPCR受体或其部分的 cDNA 核苷酸序列选自 AlstAR(SEQ ID NO :1)、AlstCR(SEQ ID NO 2), DHR(SEQ ID NO :3)、 AKHR(SEQ ID NO 4),LGRl(SEQ ID NO :5)、Oct/TyrR(SEQ ID NO :6)、0R83b (SEQ ID NO :7) 和 PBAN-R(SEQ ID NO :8)。
8.权利要求6的方法，其中当所述线虫是南方根结线虫时，编码GPCR受体的cDNA核 苷酸序列选自血清素样受体(SEQ ID NO :9)、多巴胺样受体(SEQ ID N0:10)、神经肽受体 (SEQ ID NO :11)、视紫质样受体。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中可在每一个步骤中使用编码对于不同植物 病原体而言至关重要的GPCR受体的cDNA核苷酸序列平行地重复步骤a) -c)以获得一个或多个重组质粒，所述重组质粒d)用于共转化相同的植物或dl)转化不同的植物并且将其杂 交。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述植物属于茄科(Solanaceae)，优选烟草。
11.根据权利要求1至10中定义的方法可获得的抗一种或多种植物病原体的转基因植物。
12.权利要求10的转基因植物，当从属于权利要求7时，其为抗海灰翅夜蛾的烟草植物。
13.抗海灰翅夜蛾的转基因植物，其特征在于其是烟草植物并且表达dsRNA，在所述 dsRNA中，反义链与编码SEQ ID NO 2和 /或SEQ IDNO 3的mRNA互补。
14.抗南方根结线虫的转基因植物，其特征在于其是烟草植物并且表达dsRNA，在所述 dsRNA中反义链与编码SEQ ID NO :11的mRNA互补。
15.用于预防性处理植物以使其对一种或多种植物病原体昆虫、线虫、真菌的攻击具有 抗性的方法，其包括权利要求1至10中任一项定义的步骤a)_e)。
16.权利要求15的方法，其还包括用肥料、生物刺激剂、杀真菌剂、合成的或天然的杀 线虫剂、除草剂或杀虫剂处理所获得的植物的步骤。
全文摘要
本发明涉及获得基于RNA干扰对植物病原体(即寄生虫和植食性动物)的攻击具有抗性的转基因植物的方法，其包括在植物组织中表达适合于抑制GPCR受体的功能性的双链RNA(dsRNA)，所述GPCR受体的功能对于真菌、食草昆虫或植物病原性线虫是至关重要的。
文档编号C12N15/82GK102124114SQ200980131951
公开日2011年7月13日 申请日期2009年7月15日 优先权日2008年7月17日
发明者D·安德伦纳奇, F·阿庞纳, M·G·库鲁奇, S·阿瑟罗 申请人:阿特拉生物科技有限责任公司