专利名称：包含血凝素的流感病毒样颗粒(vlp)的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒样颗粒的生产。更具体而言，本发明涉及含有流感病毒抗原的病毒样颗粒的生产。下面的描述是优选的实施方案。本发明提供了含有编码来自包膜病毒的抗原(例如流感血凝素(HA))之核苷酸序列的核酸，其与在植物中有活性的调控区有效连接。此外，本发明提供了在植物中生产病毒样颗粒(VLP)的方法。所述方法包括将编码抗原并与在植物中有活性之调控区有效连接的核酸导入所述植物或其部分中，以及在允许所述核酸表达的条件下培养所述植物或其部分，从而产生VLP。VLP可由流感病毒制得，然而，VLP还可由其它质膜来源的病毒制得，包括但不限于麻疹病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒和HIV。本发明包括可感染人的所有类型流感病毒的VLP，包括例如但不限于非常流行的 A型(HlNl)亚型(例如A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl) )、A/印度尼西亚/5/05亚型(H5N1) (SEQ ID NO 60)以及较不常见的 B 型(例如 SEQ ID NO :26，图 100)、C 型(SEQ ID NO :27，
图10P)以及从其它流感病毒亚型得到的HA。本发明中其它流感病毒亚型的VLP还包括例如 A/布里斯班/59/2007 (Hmi ；SEQ ID NO :48)、A/所罗门群岛/3/2006 (Hmi ；SEQ ID N0: 49)、A/ 新加坡 /1/57 (H2N2 ；SEQ ID NO 54)、A/ 安徽 /1/2005 (H5N1 ；SEQ ID NO 55)、A/ 越南 /1194/2004 (H5N1 ；SEQ IDNO 56)、A/ 水鸭 / 香港 /W312/97 (H6N1 ；SEQ ID NO 57)、A/ 香港/1073/99 (H9N2 ；SEQ ID NO 59)、A/ 布里斯班 /10/2007 (H3N2 ；SEQ ID NO 50)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2 ；SEQ ID NO :51)、A/ 马 / 布拉格 /56 (H7N7 ；SEQID NO 58)、B/ 马来西亚/2506/2004 (SEQ ID NO :52)、B/佛罗里达/4/2006 (SEQ ID NO 53)或 A/加利福尼亚 /04/09(HlNl)(SEQ ID NO 127)。本发明还涉及感染其它哺乳动物或宿主动物的流感病毒，所述哺乳动物或宿主动物为例如人、灵长类、马、猪、鸟类、禽类、水禽、候鸟、鹌鹑、鸭、鹅、家禽、鸡、骆驼、犬科动物、 狗、猫科动物、猫、虎、豹、麝猫、水貂、石貂、雪貂、宠物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鲸等。可在质膜来源的病毒中表达的其它抗原的非限制性实例包括HIV的衣壳蛋白 P24 ；包膜蛋白gpl20、gp41 ；结构蛋白VP30和VP35 ；丝状病毒(例如埃博拉病毒或马尔堡病毒)的Gp/SGP(糖基化内膜蛋白)，或副粘病毒(例如麻疹病毒)的H蛋白以及F蛋白。本发明还包括但不限于从细胞质膜获得脂质包膜的流感病毒来源的VLP，所述 VLP蛋白在所述细胞中表达。例如，如果VLP在基于植物的系统中表达，那么VLP可从该细胞的质膜获得脂质包膜。一般而言，术语“脂质”是指脂溶性的(亲脂性的)天然分子。更具体地，该术语还用于指脂肪酸及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯以及磷脂)以及其它脂溶性的含固醇的代谢物或固醇类。磷脂连同糖脂、固醇和蛋白质是所有生物膜的主要组分。 磷脂的实例包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。固醇的实例包括动物固醇(例如胆固醇)和植物固醇(例如谷留醇)以及固醇糖苷。已经在多种植物中鉴定了超过200种的植物固醇，最常见的有菜油固醇、豆固醇、麦角固醇、菜子固醇、Δ-7-豆固醇、Δ-7-燕麦固醇、胡萝卜固醇(daunosterol)、谷固醇、24-甲基胆固醇、 胆固醇或β-谷固醇。本领域技术人员应当理解，细胞质膜的脂质组成可随细胞或获得细胞之生物体的培养或生长条件而变化。
细胞膜通常包含脂双层以及各种功能的蛋白质。在脂双层中可发现局部浓缩的特定脂质，称为“脂质筏”。不希望受理论限制，脂质筏可在内吞和胞吐作用、病毒或其它感染原的进入或逸出、细胞间信号转导、与细胞或生物体的其它结构组分(例如细胞内和细胞外基质)相互作用中起重要作用。针对流感病毒，本文所用的术语“血凝素”或“ΗΑ”是指存在于流感病毒颗粒外部的糖蛋白。HA是同三聚体I型膜糖蛋白，通常含有信号肽、HAl结构域和ΗΑ2结构域，所述 ΗΑ2结构域含有C端的跨膜锚定位点以及小的胞质尾(图1Β)。编码HA的核苷酸序列是公知的并且是可获得的，参见例如BioDefence Public Health base (流感病毒；参见URL biohealthbase. org)或美国国立生物技术信息中心(参见URL :ncbi. nlm. nih. gov)，其均通过引用并入本文。术语“同三聚体”或“同三聚体的”表示寡聚体由三个HA蛋白分子形成。不希望受理论限制，HA蛋白是作为约75kDa的单体前体蛋白(HAO)合成的，其在表面处组装成长形的三聚体蛋白。在三聚化发生之前，前体蛋白在保守的活化切割位点(也称为“融合肽”) 处被切割成2条通过二硫键连接的多肽链——HAl和HA2 (包含跨膜区)。HAl区段的长度可以为328个氨基酸，HA2区段的长度可以为221个氨基酸。尽管该切割对于病毒感染性可能是重要的，但是其对于蛋白质三聚化却不是必需的。HA插入宿主细胞的内质网(ER)膜内，信号肽切割和蛋白质糖基化是共翻译事件。正确的HA重折叠需要蛋白质糖基化以及形成6个链内二硫键。HA三聚体在顺式-和反式-高尔基体复合物内组装，跨膜结构域在三聚化加工中起作用。经菠萝蛋白酶处理的HA蛋白(缺少跨膜结构域)的晶体结构显示在流感毒株之间具有高度保守的结构。还已明确，HA在感染过程中发生重大的构象变化，这需要将前体HAO切割成2条多肽链(HAl和HA2)。HA蛋白可被加工(即包含HAl和HA2结构域)，或者可以不进行加工(即包含HAO结构域)。本发明涉及包含跨膜结构域并包含HAl和HA2结构域的HA蛋白的用途，例如所述 HA蛋白可以是ΗΑ0，或是包含HAl和HA2的经加工HA。所述HA蛋白可用于利用植物、植物细胞或表达系统生产或形成VLP。本发明的HA可得自任意亚型。例如，HA可以是HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、 H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16亚型或B型流感病毒。本发明的重组HA还可包含基于本领域公知的任意血凝素序列的氨基酸序列——参见例如BioDefence Public Health base (流感病毒；参见URL :biohealthbase. org)或者美国国立生物技术信息中心(参见 URL :ncbi. nlm. nih. gov)。此外，HA可基于从一种或多种新发现的或新鉴定出的流感病毒中分离出的血凝素的序列。本发明还包括VLP，其包含得自一种或多种流感病毒亚型的HA。例如，VLP可包含来自以下亚型的一种或多种HA :H1 (由SEQ ID NO :28编码)、H2 (由SEQ ID而12编码)、 H3 (由 SEQ ID NO 13 编码)、H4 (由 SEQ ID NO 14 编码)、H5 (由 SEQ ID NO 15 编码)、 H6(由 SEQID NO :16 编码)、H7(由 SEQ ID NO :11 编码)、H8 (由 SEQ ID N0:17 编码)、 H9(由 SEQ ID NO :18 编码)、H10(由 SEQ ID NO :19 编码)、H11(由 SEQ ID NO :20 编码)、 H12 (由 SEQ ID NO 21 编码)、H13 (由 SEQ ID NO 27 编码)、H14 (由 SEQ ID NO 23 编码)、 H15 (由 SEQ IDNO 24 编码),H16 (由 SEQ ID NO 25 编码)或 B 型流感病毒(由 SEQ IDNO 26编码)，或其组合。来自一种或多种流感病毒亚型的一种或多种HA可以在植物或昆虫细胞内共表达，以确保所述一种或多种HA的合成导致形成含有得自一种或多种流感病毒亚型之HA组合的VLP。对HA之组合的选择可通过由VLP制得之疫苗的目的用途来确定。例如，用于接种鸟类的疫苗可包含HA亚型的任意组合，而用于接种人的VLP可包含一种或多种HI、H2、H 3、H5、H7、H9、HlO、Ni、N2、N3和N7亚型。然而，也可根据接种用途来制备其它 HA亚型的组合。因此，本发明涉及含有一种或多种HA亚型的VLP，例如两个、三个、四个、五个、六个或更多HA亚型。本发明还提供了编码血凝素的核酸，当其在植物中表达时形成VLP。示例性核酸可包含来自选定流感病毒亚型毒株的血凝素的核苷酸序列。例如， A(HlNl)亚型例如A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl) (SEQ IDNO :33)、A/印度尼西亚/5/05 亚型(H5N1)(包含构建体#660 ；SEQ ID NO 60)以及较不常见的B型(例如SEQ ID NO 26，图100)和C型(SEQ IDNO :27，图10P)，以及从其它流感病毒亚型获得的HA。本发明中其它流感病毒亚型的VLP还包括例如A/布里斯班/59/2007 (H1N1 ；SEQ IDNO 36)、A/所罗门群岛/3/2006 (H1N1 ;SEQ ID NO :37)、A/新加坡/1/57 (H2N2 ;SEQ ID NO :42)、A/安 M /1/2005 (H5N1 ；SEQ ID NO :43)、A/越南/1194/2004 (H5m ;SEQ ID NO :44)、A/水鸭 / 香港 /W312/97 (H6N1 ；SEQID NO 45)、A/ 香港 /1073/99 (H9N2 ；SEQ ID NO 47)、A/ 布里斯班 /10/2007 (H3N2 ；SEQ ID NO 38)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2 ；SEQ ID NO :39)、A/ 马 / 布拉格 /56 (H7N7 ；SEQ ID NO 46)、B/ 马来西亚 /2506/2004 (SEQ IDNO 40)、B/ 佛罗里达 /4/2006 (SEQ ID NO 41)或 A/加利福尼亚/04/09 (HlNl) (SEQ ID NO: 127)。血凝素的正确折叠对蛋白质稳定性、多聚体形成、VLP形成和HA之功能(血细胞凝集能力)等流感病毒血凝素特性可以是重要的。蛋白质折叠可受一个或多个因素影响， 包括但不限于蛋白质序列，蛋白质相对丰度，细胞内拥挤程度，可与折叠的、部分折叠的或未折叠的蛋白质结合或瞬时缔合的辅因子的利用度，一种或多种伴侣蛋白的存在情况等。热休克蛋白(Hsp)或应激蛋白是伴侣蛋白的实例，其可参与多种细胞过程包括蛋白质合成、细胞内运输、防止错误折叠、防止蛋白质凝集、蛋白质复合物的组装和去组装、蛋白质折叠以及蛋白质解聚。这样的伴侣蛋白的实例包括但不限于HSp60、HSp65、HSp 70、 Hsp90、HsplOO、Hsp20_30、HsplO、Hspl00-200、HsplOO、Hsp90、Lon, TF55、FKBP、亲环蛋白 (CyCl0philin)、ClpP、GrpE、泛素、钙联接蛋白(calnexin)和蛋白质二硫键异构酶。参见， 例如 Macario, A. J. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25 :59_70· 1995 ；Parsell, D. Α. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27 :437_496 (1993)；美国专利 No. 5，232，833。在一些实例中，特定组的伴侣蛋白包括Hsp40和Hsp70。Hsp70的实例包括来自哺乳动物细胞的Hsp72和Hsc73、来自细菌特别是分枝杆菌(如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)禾口牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如 Bacille-Calmette Guerin, 本文中称为Hsp71))的DnaK。来自大肠杆菌、酵母和其它原核生物的DnaK、以及来自真核生物(例如拟南芥)的 BiP 和 Grp78 (Lin 等，2001 (Cell Stress and Chaperones 6 201-208))。Hsp70 的一个具体实例是拟南芥 Hsp70(由 SEQ ID N0:122 或 SEQ ID NO 123 编码)。Hsp70能够特异性地结合ATP以及未折叠多肽和肽，从而参与蛋白质折叠和解折叠以及参与蛋白质复合物的组装和去组装。Hsp40的实例包括来自原核生物(例如大肠杆菌和分枝杆菌)的DnaJ以及来自真核生物(例如苜蓿(Frugis 等，1999. Plant Molecular Biology 40 397-408))的 HSJl、 HDJl 和 Hsp40。Hsp40 的一个具体实例是紫花苜蓿(M. sativa)MsJl(由 SEQ ID NO :121、 123或114编码)。Hsp40在蛋白质折叠、耐热性和DNA复制等细胞活动中作为分子伴侣起
作用。 在各Hsp中，Hsp70及其辅伴侣蛋白(co-chaperone) Hsp40与合成完成前还在翻译的新合成多肽的稳定性相关。不希望受理论的限制，Hsp40与未折叠(新生或新转移的) 多肽的疏水片区结合，因而有利于Hsp70-ATP复合物与该多肽的相互作用。ATP水解导致多肽、Hsp70和ADP之间形成稳定的复合物并释放Hsp40。Hsp70_ADP复合物与多肽之疏水片区的缔合阻止其与其它疏水片区相互作用，并防止不正确折叠以及与其它蛋白质形成凝集体(综述见于 Hartl，FU. 1996. Nature381 :571_579)。同样不希望受理论限制，随着重组蛋白质表达系统中蛋白质的产生增加，重组蛋白质表达的拥挤效应可能导致由于错误折叠之多肽发生降解导致的重组蛋白质的凝集和/ 或累积减少。天然的伴侣蛋白能够有利于低水平重组蛋白质的正确折叠，然而当表达水平增加时，天然伴侣蛋白可变为限制因素。经农杆菌渗入之叶中血凝素的高水平表达可导致血凝素多肽在胞质溶胶中累积，而与一种或多种伴侣蛋白(例如Hsp70、Hsp40或者Hsp70 及Hsp40两者)可提高表达该多肽之细胞的胞质溶胶中的稳定性，因而减少错误折叠或凝集之血凝素多肽的水平，并增加作为稳定血凝素(其呈现允许发生血细胞凝集和/或病毒样颗粒形成的三级和四级结构特征)之多肽累积物的数目。因此，本发明还提供了在植物中生产流感病毒VLP的方法，其中将编码流感病毒 HA的第一核酸与编码伴侣蛋白的第二核酸共表达。所述第一核酸和第二核酸可在同一步骤中导入植物，或者可先后导入植物。本发明还提供了在植物中生产流感病毒VLP的方法，其中所述植物包含所述第一核酸，所述第二核酸随后被导入。本发明还提供了包含编码一种或多种流感病毒血凝素之核酸以及编码一种或多种伴侣蛋白之核酸的植物。已提出，在流感病毒血凝素表达和/或分泌过程中加工N端信号肽(SP)序列对折叠过程起作用。术语“信号肽” 一般是指通常见于血凝素多肽N端的短(约5 30个氨基酸)氨基酸序列，其可指导新翻译之多肽转运至特定细胞器或者辅助多肽特定结构域的定位。血凝素的信号肽将该蛋白质的转运靶向至内质网中，并已提出其辅助新生血凝素多肽相对于近N端结构域之膜锚定结构域的定位，以辅助成熟血凝素的切割和折叠。除去信号肽(例如，通过信号肽酶)可需要精确的切割以及去除信号肽以提供成熟血凝素——这一精确切割可取决于若干因素中的任意因素，包括信号肽的一部分还是全部、切割位点侧翼的氨基酸序列、信号肽的长度，或者这些因素的组合，并且并非所有因素均适用于任一给定序列。信号肽可以是所表达之血凝素天然存在的，或者重组血凝素包含来自第一流感病毒类型、亚型或毒株的信号肽，而其余部分来自第二流感病毒类型、亚型或毒株。例如，HA亚型HI、H2、H3、H5、H6、H7、H9或B型流感病毒的天然信号肽可用于在植物系统中表达HA。信号肽还可以是非天然的，例如来自结构蛋白或非流感病毒之病毒的 HA，或者来自植物、动物或细菌多肽。示例性信号肽是苜蓿蛋白质二硫键异构酶 (PDISP)(登记号Zl 1499的32-103位核苷酸；SEQ ID NO :34 ；图17 ；氨基酸序列 MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE)。
本发明还提供了包含天然或非天然信号肽的流感病毒血凝素以及编码此类血凝素的核酸。流感病毒HA蛋白在分子量、等电点、大小、聚糖成分等方面表现出一系列相似之处和不同之处。各种血凝素的物理化学性质可用于区分在植物、昆虫细胞或酵母系统中表达的HA，并且当多于一种HA在单一系统中共表达时其可具有特殊用途。所述物理化学性质的实例示于表1中。
权利要求
1.核酸，其包含与在植物中有活性之调控区有效连接的编码A/加利福尼亚/04/09型流感病毒血凝素(HA)的核苷酸序列。
2.权利要求1的核酸，其中所述HA包含天然或非天然的信号肽。
3.权利要求2的核酸，其中所述非天然的信号肽是蛋白质二硫键异构酶信号肽。
4.在植物中生产流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括a)将权利要求1的核酸导入所述植物或所述植物的部分中，以及b)在允许所述核酸表达的条件下培养所述植物或植物部分，从而生产所述VLP。
5.权利要求4的方法，其中在所述导入步骤(步骤a)中，所述核酸以瞬时方式被导入所述植物中。
6.权利要求4的方法，其中在所述导入步骤(步骤a)中，所述核酸以稳定方式被导入所述植物中。
7.权利要求4的方法，其还包括以下步骤c)收获所述宿主并纯化所述VLP。
8.权利要求4的方法，其中在所述导入步骤(步骤a)中，将第二核酸导入所述植物中， 所述第二核酸包含编码一种或多种伴侣蛋白的核苷酸序列。
9.权利要求8的方法，其中所述一种或多种伴侣蛋白选自Hsp40和Hsp70。
10.在植物中生产流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括a)提供包含权利要求1之核酸的植物或植物部分，以及b)在允许所述核酸表达的条件下培养所述植物或植物部分，从而生产所述VLP。
11.包含权利要求1之核酸的植物。
12.权利要求11的植物，其还包含这样的核酸，该核酸含有与在植物中有活性之调控区有效连接的编码一种或多种伴侣蛋白的核苷酸序列。15.权利要求14的植物，其中所述一种或多种伴侣蛋白选自Hsp40和Hsp70。
13.病毒样颗粒(VLP)，其包含A/加利福尼亚/04/09型流感病毒血凝素(HA)蛋白以及一种或多种来自植物的脂质。
14.组合物，其包含有效剂量的权利要求13之VLP以及可药用载体。
15.诱导对象中针对流感病毒感染之免疫力的方法，其包括施用权利要求13的病毒样颗粒。
16.权利要求15的方法，其中所述病毒样颗粒经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用给所述对象。
17.病毒样颗粒(VLP)，其包含具有植物特异性N-聚糖或经修饰N-聚糖的A/加利福尼亚/04/09型流感病毒HA。
18.组合物，其包含有效剂量的权利要求17之VLP以及可药用载体。
19.诱导对象中针对流感病毒感染之免疫力的方法，其包括施用权利要求18的组合物。
20.权利要求19的方法，其中所述组合物经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用给对象。
全文摘要
本发明提供了在植物或植物部分中合成流感病毒样颗粒(influenza virus-like particle，VLP)的方法。所述方法包括在植物中表达A/加利福尼亚/04/09型流感病毒HA并通过体积排阻色谱进行纯化。本发明还涉及包含A/加利福尼亚/04/09型流感病毒HA蛋白和植物脂质的VLP。本发明还涉及编码A/加利福尼亚/04/09型流感病毒HA的核酸以及载体。所述VLP可用于制备流感疫苗，或者可用于补充现有的疫苗。
文档编号C12N15/82GK102272308SQ200980134868
公开日2011年12月7日 申请日期2009年7月2日 优先权日2008年7月11日
发明者弗雷德里克·奥尔斯, 皮埃尔-奥列弗·拉瓦, 米凯莱·达吉斯, 索尼娅·特雷帕尼耶, 纳萨莉·兰德里, 路易斯-菲利普·韦齐纳, 马克-安德烈·德奥斯特, 马农·科图雷 申请人:麦迪卡格公司