表达载体及其方法

专利名称：表达载体及其方法
技术领域：
本发明涉及表达重组可溶性蛋白质的载体和化合物。更具体而言，本发明涉及表达重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融合蛋白的核酸分子、表达载体和宿主细胞。本发明还涉及一种采用所述表达载体转染的宿主细胞制备重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融和蛋白的方法。
背景技术：
1986年，美国食品药品管理局(FDA)批准将来自哺乳动物细胞的人组织纤溶酶原激活物(tPA，美国加利福尼亚州基因泰克公司(Genentech，CA, USA))蛋白用于治疗目的。 细胞培养和重组DNA技术的进步推动了采用遗传工程细胞表达具有治疗或其它经济价值的各种类似蛋白质。目前存在若干单克隆抗体已获得治疗应用的批准，几百种抗体处于研发和批准的各阶段。和tPA类似，这些蛋白质大多数在无限增殖化的中华仓鼠卵巢(CHO) 细胞中表达，但其它细胞系如小鼠骨髓瘤(NSO)、幼仓鼠肾(BHK)、人胚胎肾(ΗΕΚ493)细胞系也获得了生产重组蛋白质的批准。很多来自高等真核生物来源的生物活性治疗物的表达常需要低等真核细胞或原核细胞中不天然产生的转录后修饰，由此需要使用来自高等真核生物来源的细胞。因此，通常优选哺乳动物表达系统制备大多数治疗蛋白质，因为细胞系中也进行所需转录后修饰。 现在可将各种哺乳动物细胞表达系统用于蛋白质表达。表达载体通常采用强病毒或细胞启动子/增强子以驱动重组基因的表达。然而，哺乳动物细胞中的这些表达载体/系统达到的重组蛋白质的表达水平在商业生产中不具可行性。治疗物生产中存在两个关键问题需要解决(a)提供所述材料消耗的时间；(b)降低所述材料的价格以便进行大量生产，特别是在发展中或不发达国家。因此，生物技术产业持续着眼于可降低时间和成本的新的技术和工艺开发策略。恩利(ENBREL)(依那西普^tanerapt))也称为TNFR:Fc融合蛋白，是一种包含人肿瘤坏死因子受体超家族成员1Β(ρ75)的胞外结构域和人IgGl的Fc结构域的重组融合蛋白。它是类风湿性关节炎治疗的重大科学进步，在很多患者中显示减轻类风湿性关节炎、 多关节型青少年类风湿性关节炎、关节强硬性脊椎炎、牛皮癣性关节炎和牛皮癣的病征和症状。肿瘤坏死因子(TNF)是天然产生的参与正常炎症和免疫应答的细胞因子。它在类风湿性关节炎(RA)、多关节型青少年类风湿性关节炎(JRA)的炎症过程和所产生的关节病理学中具有重要作用。在RA患者的关节液中发现TNF水平升高。由于重组基因的遗传稳定性低和/或重组基因的沉默，可能难以在哺乳动物细胞中生产重组蛋白质如TNFR:Fc。已报道了可引起基因沉默的若干分子机制，包括DNA甲基化、负位置效应、整合依赖性阻抑作用等，仅举此数例。因此，本领域需要克服已知的生产重组融合蛋白方法的缺陷，在这样的蛋白质的大规模生产中提供具有较高遗传稳定性的表达系统。为促进从细胞培养物生产大量 TNFR:Fc，开发了一种新的表达载体。采用该表达载体已显示可增加治疗蛋白质的表达。本发明描述了 TNFR:Fc的克隆、表达和纯化。
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发明概述本发明包括所附权利要求书所述的一种或多种特征和/或以下特征，这些特征的单独或组合形式可包含可获得专利的主题本发明基于对新的支架/基质结合区(S/MAR)序列的发现，所述序列可用于增加和稳定哺乳动物和其它真核细胞中重组蛋白质的表达产量。所述S/MAR序列增大邻近转录盒的遗传稳定性并通过干扰诸如DNA甲基化等机制来抑制基因沉默。此外，认为S/MAR序列的存在通过降低位置效应而降低克隆的变化。因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的核酸，其具有选自下组的一个或多个核苷酸序列:SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 和SEQ ID NO :6，它们的变体和功能性片段，以及与它们具有至少70%同源性的序列或在严格条件下与所述分离核酸杂交的序列。在另一个实施方式中，本发明涉及一种表达载体，其携带一个或多个支架/基质结合区(S/MAR)序列和它们的任何组合。所述S/MAR序列可选自下组SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 禾口 SEQ ID NO :6，它们的互补序列、 变体和功能性片段，以及与它们具有至少70%同源性的序列，所述同源性采用匹配方法如 BLAST (基本局部比对搜索工具)算法进行成对DNA序列比对测定。在另一个实施方式中，本发明涉及一种表达载体，其携带一个或多个支架/基质结合区(S/MAR)序列或它们的任何组合，以及与一个或多个表达控制元件操作性连接的编码肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-IgG Fc融合蛋白的序列。所述S/MAR序列可位于表达载体内的转录启动子的上游或下游。此外，所述S/MAR 序列可位于与编码肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融合蛋白的序列距离0-101Λ 的位置。在另一个实施方式中，本发明涉及一种构建携带一个或多个支架/基质结合区 (S/MAR)序列或其任何组合的表达载体的方法。在另一个实施方式中，本发明涉及包含携带一个或多个支架/基质结合区(S/ MAR)序列或其任何组合的表达载体的宿主细胞。在另一个实施方式中，本发明涉及一种生产肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-IgG Fc 融合蛋白的方法，其采用携带一个或多个支架/基质结合区(S/MAR)序列或它们的任何组合的表达载体进行重组表达。在另一个实施方式中，本发明涉及肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-IgGFc融合蛋白， 其由携带一个或多个支架/基质结合区(S/MAR)序列或它们的任何组合的表达载体表达。在另一个实施方式中，本发明涉及一种生产肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-IgG Fc 融合蛋白的方法，其用携带编码肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-IgG Fc融合蛋白的基因的表达构建体转染哺乳动物细胞，并采用携带一个或多个支架/基质结合区(S/MAR)序列或它们的任何组合的质粒共转染同一哺乳动物细胞。在另一个实施方式中，本发明涉及影响一个或多个支架/基质结合区(S/MAR)序列生物活性的外遗传因子和遗传因子。附图简要说明参考附图对本发明进行进一步说明，其中


图1显示质粒载体pCDNA3. 1/TNFR Fc的结构；图2显示质粒载体pCDNA3. 1/MARl/TNFR:Fc的结构；图3显示质粒载体pCDNA3. l/MAR2/TNFR:Fc的结构；图4显示质粒载体pCDNA3. l/MAR3/TNFR:Fc的结构；图5显示质粒载体pCDNA3. l/MAR4/TNFR:Fc的结构；图6显示质粒载体pCDNA3. l/MAR5/TNFR:Fc的结构；禾口图7显示质粒载体pCDNA3. l/MAR6/TNFR:Fc的结构。发明详述本文所用的术语“支架/基质结合区(S/MAR) ”指长度为几百个碱基对(bp)的非共有的富含AT的DNA元件，其通过与细胞核蛋白质支架或基质周期性结合将真核基因组的核DNA组织为约60，000个染色质结构域。它们通常发现于非编码区如侧翼区、染色质边界区和内含子中。具有“至少70%同源性”指采用匹配方法如BLAST (基本局部比对搜索工具)算法进行成对DNA序列比对测定的其中核苷酸序列与确定的序列最少70%同源的DNA。本文所用的术语“SEQ ID NO :1、2、3、4、5和6的功能性片段”指大小足以对表达产量产生所需作用的所述序列的片段。本文所用的术语“侧翼”指所讨论的序列与表达载体直接连接或通过连接DNA序列连接，只要这样的连接序列不干扰所述序列的所需作用，其长度可达到最多101Λ或更多。所述表达载体最少包含感兴趣的基因和与其操作性连接的表达控制元件。所述表达控制元件包含通常的调节元件，如转录启动子、增强子、阻抑物、RNA聚合酶结合位点、多聚腺苷酸化位点、翻译起始信号和翻译终止信号，可通过本领域普通技术人员很容易地获得。术语“互补”指与参照核苷酸序列相比具有互补核苷酸序列和相反取向的核酸序列。例如，序列 5' ATGCACGGG 3'与 5' CCCGTGCAT 3'互补。本文所用的术语“变体”指不同于具体鉴定序列的多核苷酸或多肽序列，其中缺失、取代或插入一个或多个核苷酸或氨基酸残基。变体可以是天然产生的等位基因变体或非天然产生的变体。变体可来自相同种或其它种，可包括同源物、旁系同源物和直向同源物。在某些实施方式中，变体具有的生物活性与所讨论序列的生物活性相同或类似。变体多核苷酸序列优选显示与本发明序列至少50%、更优选至少51%、更优选至少52%、更优选至少53%、更优选至少M %、更优选至少55%、更优选至少56%、更优选至少57%、更优选至少58%、更优选至少59%、更优选至少60%、更优选至少61%、更优选至少62 %、更优选至少63 %、更优选至少64 %、更优选至少65 %、更优选至少66 %、更优选至少67%、更优选至少68%、更优选至少69%、更优选至少70%、更优选至少71%、更优选至少72%、更优选至少73%、更优选至少74%、更优选至少75%、更优选至少76%、更优选至少77%、更优选至少78%、更优选至少79%、更优选至少80%、更优选至少81%、更优选至少82 %、更优选至少83 %、更优选至少84 %、更优选至少85 %、更优选至少86 %、更优选至少87%、更优选至少88%、更优选至少89%、更优选至少90%、更优选至少91%、更优选至少92 %、更优选至少93 %、更优选至少94 %、更优选至少95 %、更优选至少96 %、更优选至少97%、更优选至少98%、最优选至少99%的相同性。
本文所用的术语“序列基序”指包含于较大寡核苷酸序列中具有至少两个核苷酸的某个核苷酸序列。序列基序可在寡核苷酸序列中出现一次，或可出现任何次数。例如，寡核苷酸5' -AUCAUCAUG-3'包含出现三次的序列基序5 ‘ -AU-3'、出现两次的序列基序 5' -UC-3'和5' -CA-3'以及出现一次的序列基序5' -UG-3'。本文所用的术语“外遗传因子”指在运转时影响一个基因或一组基因表达的任何外部过程或因子，其与包括内部因子如蛋白质、核酸等的任何内部过程或因子的“遗传因子”相对。本文所用的术语“TNFR:Fc受体蛋白”或“TNFR:Fc”指氨基酸序列与人 TNFRII (p75)蛋白胞外结构域类似的蛋白质，其可与其天然配体TNF-α结合，从而抑制 TNF-α与细胞膜结合的TNFRI或TNFRII结合。已知存在的两种不同形式的TNFR中，本发明优选的TNFR是TNFRII (ρ75)。可溶性TNFR构建体不含促进向细胞外分泌的跨膜区。 TNFRII的可溶性部分即胞外结构域与人IgGl的Fc区进行符合读框的融合。本发明的融合蛋白具有生物活性，即其可与TNF在溶液中结合。本文所用的术语“生物分子”指与生物环境相关的物质、化合物或组分，包括但不限于糖、氨基酸、肽、蛋白质、寡核苷酸、多核苷酸、多肽、有机分子、半抗原、表位、生物细胞、 生物细胞的组成部分、维生素、激素等。术语“表达系统”指用于产生多核苷酸编码的一种或多种蛋白质的任何体内或体外生物系统。本文所用的术语“重组”指蛋白质来自重组表达系统，所述重组表达系统在本说明书中指基于哺乳动物细胞的表达系统。本文所用的术语“分离的DNA序列”指分离片段形式或作为较大DNA构建体一部分的DNA聚合物。可将这样的序列克隆到表达载体中，可分离大量所述序列用于所述DNA 片段的鉴定、操作和回收。可将这样的序列以不被非翻译DNA区或内含子中断的开放阅读形式提供。本文所用的术语“核苷酸序列”指脱氧核糖核苷酸的杂聚物。可从cDNA片段和短寡核苷酸接头或一系列寡核苷酸组装编码本发明蛋白质的DNA序列，以提供能够在重组转录单元中表达的合成基因。“染色体”是在细胞内发现的DNA和蛋白质的有序结构。“染色质”是在真核细胞的细胞核内发现的DNA和蛋白质的复合体，其组成染色体。“DNA”或“脱氧核糖核酸”包含遗传信息。由不同的核苷酸A、G、T或C组成。本文所用的“基因”指编码给定成熟蛋白质的脱氧核糖核苷酸(DNA)序列。其不包含非翻译侧翼区，如RNA转录起始信号、多聚腺苷酸化添加位点、启动子或增强子。本文所用的术语“转录启动子”指控制编码序列或功能性RNA表达的核酸序列。启动子可来自天然基因，或包含来自天然情况下发现的不同启动子的不同元件。所述启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，可来自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。合适的启动子的例子有SV40启动子、MT-I (金属硫蛋白基因)启动子、人巨细胞病毒即时早期启动子等。“转录增强子”指不依赖基因位置或取向而启动基因转录的基因序列。“转录阻抑物”指不依赖基因位置或取向而抑制基因转录的基因序列。
术语“信号肽”指分泌的成熟蛋白质前的氨基末端多肽。由于被切割，其不存在于成熟蛋白质中。本文所用的术语“蛋白质”指通过肽键连接的两个或更多个单独氨基酸(无论是否天然产生)的任何聚合物，如连接于一个氨基酸(或氨基酸残基)的α碳原子的羧酸基团的羧基碳原子与连接相邻氨基酸α碳原子的氨基基团的氨基氮原子进行共价结合时发生的情况。这些肽键连接和包含它们的原子(即α碳原子、羧基碳原子(及其取代基氧原子)和氨基氮原子(及其取代基氢原子))形成所述蛋白质的“多肽主链”。此外，本文所用的术语“蛋白质”应理解为包括术语“多肽”和“肽”(有时可互换使用)。本文所用术语“载体”指能够运输其所连接的另一核酸的核酸分子。载体通常衍生自质粒，其作用类似于“分子运载体”，携带DNA片段进入宿主细胞。所述载体可以是可方便地进行重组DNA操作步骤的任何载体，对载体的选择常依赖于其将要引入的宿主细胞。因此，所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，所述载体可以是在引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并随整合入的染色体一起复制的载体。所述载体优选为表达载体，其中编码DNA序列操作性连接于DNA转录所需的其它区段。所述表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或可同时包含这两种元件。术语“操作性连接”表示将所述区段进行排列， 使它们为达到所需目的协同发挥作用，例如，由启动子中起始转录，并通过编码多肽的DNA 序列进行。本文所用的术语“质粒”指发现于细菌和一些其它生物中的小环状双链多核苷酸结构的DNA。质粒可独立于宿主细胞染色体进行复制。术语“复制”指从模板DNA链合成所述DNA。术语“转录”指从DNA模板合成RNA。术语“翻译”指从信使RNA合成多肽。术语“顺”指将两个或更多个DNA元件连接设置在同一质粒上。术语“反”指将两个或更多个DNA元件设置在两个或更多个不同质粒上。术语“取向”指DNA序列中核苷酸的次序。本文所用的术语“分离的核酸片段”指单链或双链的DNA或RNA聚合物。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可包含一个或多个区段的cDNA、基因组DNA或合成DNA。本文所用的术语“基因扩增”指某个或某些基因的选择性重复复制，而不引起其它基因拷贝数量成比例增多。它是很多生物中一种重要的普遍发育和进化过程。基因扩增可分为两种(i)发育调节的基因表达，如爪蟾(Xenopus oocytes)中所见和(ii)自发产生的基因表达，如大肠杆菌(Escherichia coli)中所报道的lac区的扩增。哺乳动物中最为人熟知的基因扩增是二氢叶酸还原酶(DHFR)。术语“转化”指将核酸片段转移到宿主生物的基因组中，引起具有遗传稳定性的遗传。包含转化核酸片段的宿主生物称为“转化”生物。术语“真核细胞”指来自通过内膜和细胞骨架组织形成复杂细胞结构的真核生物的任何细胞。本发明包括可用于基因/蛋白质操作且还可在细胞培养条件下保持并随后被转染的任何真核细胞。特别优选的细胞类型包括干细胞、胚胎干细胞、中华仓鼠卵巢细胞 (CHO)、COS、BHK21、NIH3T3、HeLa, C2C12、HEK、MDCK、癌细胞和初级分化或未分化细胞。所述哺乳动物细胞可包括CHO细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、HEK293细胞或其它无限增殖的细胞系。本文所用的术语“转染”指通过任何转移手段将外源材料如DNA引入真核细胞。不同的转染方法包括但不限于，磷酸钙转染、电穿孔、脂质转染胺试剂转染和DEAE-葡聚糖转
^fe ο术语“转染细胞”指引入外源DNA的真核细胞。该DNA可以是宿主染色体的一部分或作为染色体外元件进行复制。术语“共转染”指用一种以上相对于细胞外源的基因同时转染真核细胞的方法。术语“瞬时基因表达”指迅速生产小量蛋白质的方便方法。COS细胞通常用于表征瞬时表达。术语“稳定基因表达”指制备依赖质粒稳定整合到宿主染色体中而持续表达感兴趣基因的稳定细胞系。已构建包含肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融合蛋白活性编码DNA的新的真核表达载体，其在转染入合适的细胞系时可驱动TNFR:Fc活性的表达。所述新的表达载体可用于产生可溶性TNFR:Fc。重组产生的TNFR:Fc活性可用于治疗和预防各种疾病，包括类风湿性关节炎、多关节型青少年类风湿性关节炎、关节强硬性脊椎炎、牛皮癣性关节炎和牛皮癣。本发明涉及一种用于产生增加量的可溶性TNFR:Fc的新的真核表达载体。原核表达系统是分子生物学早期研究工具的一部分。在原核系统中从头合成重组真核蛋白质为真核基因产物带来多种问题。其中最严重的两个问题是不正确的蛋白质折叠和装配，以及缺乏翻译后修饰，主要是糖基化和磷酸化。原核系统不具有所有适合产生结构和/或催化功能性真核蛋白质的蛋白质合成机器。因此，通常优选哺乳动物表达系统制备治疗蛋白质，原因很简单，所述细胞系统会在原位进行所需的翻译后修饰。现在各种哺乳动物表达系统均可用于重组基因的瞬时或稳定表达。通常采用中华仓鼠卵巢(CHO)细胞稳定表达系统(CHO SES)。此外，还采用幼仓鼠肾(BHK)细胞、人胚胎肾(HEK) 293细胞、小鼠L 细胞和骨髓瘤细胞系如历58L和Sp2/0等作为宿主用于建立稳定转染子。然而，外源DNA整合到宿主细胞基因组中是不可预测的过程。已充分证明，转基因表达在细胞系中具有高度可变性，整合可引起表型发生非预期的变化。克隆的表达水平变化大的原因包括不同的质粒拷贝数和称为位置效应的现象，所述现象最初在果蝇 (Drosophila melanogaster)中被描述为位置效应花斑。整合的位置可通过至少三种机制影响转基因表达局部调节元件的活性、局部染色质结构和局部DNA甲基化状态。可采用两种常用方法保护DNA免受负位置效应或整合依赖性阻抑作用。一种方法包括采用位点特异性重组方法使转基因直接整合到具有转录活性的预定位点。另一种方法是将发现于染色质边界区的DNA序列元件整合到表达载体中，使所述基因无论整合位点如何均可免受周围染色质的影响。就重组蛋白质表达而言，起染色质边界作用并保护转染基因免受周围染色质影响的序列包括绝缘子序列和支架/基质结合区(S/MAR)。S/MAR是在体外以高亲和性与分离的核支架或核基质结合的DNA序列。表达研究表明，使转基因侧接绝缘子可降低位置效应，由此抑制克隆的表达变化。S/MAR是将染色质环锚定到核基质的较短(IOO-IOOObp长)序列。已观察到S/MAR侧接包括各种转录单元的
10结构域末端。还已显示S/MAR将染色质的转录活性区聚拢，使转录在与核基质表面重合的染色体区起始。这样，它们可限定独立染色质结构域的边界，从而仅由包围的顺式调节元件控制结构域内的基因表达。先前已讨论了 S/MAR多个可能的功能，包括形成染色质结构域的边界、改变染色质构象、参与DNA复制起始和组织染色体的染色质结构。S/MAR在着丝粒相关 DNA和端粒阵列中普遍存在，看来在有丝分裂中期的有丝分裂染色体装配和维持染色体形状中具有重要作用。因此，S/MAR在细胞周期的不同阶段参与多个独立过程。对实验鉴定的S/MAR的分析揭示了一种短至300个碱基对(bp)、最长达几千个碱基0Λ)的典型元件。这些S/MAR可包含若干序列基序，包括富含AT的核苷酸基序((>70% A-T)。大多数MAR看来包含称为“MAR识别信号”的MAR特异性序列，其为由200bp内的两个单独序列AATAAYAA和AVWVRTAANNWffGNNNC组成的二分(bipartite)序列。提出指示MAR序列的其它序列为DNA解旋基序(AATATATTAATATT)、复制起始蛋白位点(ATTA和ATTTA)、同质寡核苷酸重复序列(例如，A盒AATAAAYAAA和T盒TTWTWTTWTT) ,DNA酶I超敏感位点、潜在的不含核小体的片段、多聚嘌呤-多聚嘧啶足迹(polypurine-polypyrimidine track) 以及可在负超螺旋条件下采取非B型DNA或三螺旋构象的序列。推测S/MAR可在独立组织为允许或不允许基因表达的结构的染色体结构域之间形成遗传边界，所述允许和不允许基因表达的结构分别称为常染色质和异染色质结构域。 因此，侧接S/MAR元件的转基因可组成自主染色质结构域，其表达仍可独立于邻近的染色体环境。最近显示S/MAR在共同插入到染色体环境中时可增加邻近转基因的表达。或者， S/MAR可例如通过介导组蛋白修饰或亚核定位改变主动重新装配染色体整合位点周围的染色质，由此防止转基因沉默。据报道，邻接鸡溶菌酶(cLys)基因座5'端的充分表征的31Λ MAR元件、果蝇Scs 边界元件、hspSAP MAR、小鼠T细胞受体TCRa和大鼠LAP基因座控制区均能介导各种系统中的允许性染色质结构。将这些元件引入表达载体，通过稳定转染CHO细胞鉴定所得的转基因表达。这些元件中的大多数显示对CHO细胞库中的转基因表达水平具有适度作用。相比之下，cLysMAR的有效性是这些元件中第二佳的元件的6倍。此外，在两个cLysMAR元件侧接表达盒时，可观察到表达水平再增加4倍。多拷贝的cLysMAR很大(61Λ)，考虑到表达载体的大小，会限制这种染色质元件的普遍使用。改善MAR多样性的一种方法由共转染转基因表达盒和在单独的质粒上反式转染各种量的cLysMAR组成。显示该方法可使表达增强到高于采用仅携带一个cLysMAR 元件的质粒获得的水平。因此，可在共转染中简单地将携带MAR的质粒加入现存的表达载体，以显著增加表达水平。在另一种方法中，通过缺失诱变限定cLysMAR的短功能元件。发现MAR的这些部分虽然长度小得多，但在多聚化时与全长元件的活性相等(P. -A. Girod和 N. Mermod，数据未公开)。多聚体蛋白质生产面临一个主要问题为获得有效生产，需要在化学计量水平上协调合成所有亚基。因此，在不同的表达盒中采用相同的表达信号如启动子和3/-区。在存在或缺乏MAR元件的条件下，将编码重链和轻链表达盒并具有各种邻近染色质元件的两个线性化质粒同时转染到CRO细胞中。再次地，加入cLysMAR元件将分离的CRO细胞克隆的平均和最大生产率增加5-10倍。
一种最佳设置由以下组成同时在重链和轻链表达载体上顺式加入MAR元件，通过向转染混合物中再加入另外的含MAR的质粒来反式加入MAR元件。cLysMAR的顺式和反式共转染增加稳定共转染细胞库中的平均表达水平。此外，它降低了不同克隆的表达变化， 由此能以较高频率分离出显示高分泌水平的克隆。在比较各种染色质结构调节元件对转基因表达的作用的研究中，将鸡溶菌酶 5'MAR鉴定为活性最高的序列之一。还显示它增加各种哺乳动物细胞系中调节型或组成型转基因的表达水平。在转染到CHO细胞系中时，加入cLysMAR序列增加转基因的总体表达。如之前所述，通常优选哺乳动物表达系统制备治疗蛋白质，因为它们需要翻译后修饰。现在可将各种哺乳动物细胞表达系统用于蛋白质表达。然而，哺乳动物细胞中的这些表达载体/系统达到的重组蛋白质的表达水平在商业生产中不具可行性。恩利是一种由人75千道尔顿(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分与人IgGl的Fc部分连接组成的二聚体融合蛋白。恩利的Fc组分包含IgGl的CH2结构域、CH3结构域和铰链区，但不包含CHl结构域。恩利在中华仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物细胞表达系统中通过重组DNA技术进行生产。其由934个氨基酸组成，表观分子量为约150千道尔顿。恩利是一项重大的科学进步，已显示其减轻类风湿性关节炎、多关节型青少年类风湿性关节炎、关节强硬性脊椎炎、牛皮癣性关节炎和牛皮癣的病征和症状。TNF是天然产生的参与正常炎症应答和免疫应答的细胞因子。它在类风湿性关节炎(RA)、多关节型青少年类风湿性关节炎(JRA)的炎症过程和所产生的关节病理学中具有重要作用。在RA患者的关节液中发现TNF水平升高。TNF有55千道尔顿蛋白(p55)和75 千道尔顿蛋白(P75)两种不同的受体(TNFR)，它们以可溶形式的单体分子天然存在于细胞表面上。TNF的生物活性依赖于与其中任何一种细胞表面TNF受体的结合。诸如恩利等蛋白质会通过竞争性抑制作用抑制TNF的行为，由此通过阻止TNF与其细胞受体结合而使TNF 不具有生物活性。TNFR的胞外结构域与人IgGl的Fc部分的融合能使分子发生二聚化，通过增加血清滞留时间而实现蛋白质的最佳药代动力学。由于所述融合蛋白的两个结构域来自人，嵌合蛋白不会诱导免疫应答，由此使其成为供人使用的合适分子。本发明涉及一种采用上述S/MAR产生较大量恩利的新的表达载体。从培养基中分离时，所述DNA序列表达产物显示TNFR:Fc的生物活性。公开了载体开发、克隆和亚克隆、 转染、发酵和纯化策略。方法克隆和构建表达载体在pCDNA3. 1载体中，感兴趣的基因受人巨细胞病毒(CMV)即时早期启动子/增强子的调节。其允许重组蛋白进行有效高水平的表达。采用定向TOPO表达试剂盒将感兴趣的基因TNFR:Fc克隆到P⑶NA3. 1载体中。先通过集落PCR、之后采用合适的限制酶证实阳性转化体。采用BamHI和B10I对其进行双重消化，产生预期形状。还采用限制酶ApaI和 SacII进行证实，其明显地显示预期形状。之后对插入片段进行测序验证。分离的支架/基质结合区(S/MAR)此处标记为S/MAR序列，先通过PCR将其克隆到pGEMT轻便(pGEMTeasy)载体中，并通过合适的限制酶分析和测序进行证实。随后采用限制性位点将克隆的S/MAR插入到ρ⑶NA3. 1载体中CMV启动子的上游。通过限制性分析证实所述插入。表达重组TNFR采用重组表达载体，在该情况中为ρ⑶NA3. 1表达编码TNFR = Fc融合蛋白的基因。 重组表达载体是可复制的DNA构建体，其中编码感兴趣蛋白质的DNA与驱动其表达的某些基因元件连接。这样的转录单元的装配通常包含转录启动子或增强子、合适的转录和翻译的起始和终止位点、编码感兴趣蛋白质的编码序列和可帮助区分转染和未转染哺乳动物细胞系克隆的选择性标记。特别优选将重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达作为本发明的一部分，因为已知这样的蛋白质可正确折叠，由此形成完整的功能构象。将用于重组基因表达的细胞系是CHO-Kl细胞系，其为均一细胞群。包含编码重组蛋白质的稳定整合转录单元的转染的 CHO-Kl集落是单克隆培养物(monoculture)，即所述细胞是单个祖先转化体的后代。用包含完整转录单元的表达载体转染转化的宿主细胞。表达的TNFR:Fc会被分泌到培养物上清液中。通过采用选择性标记如编码抗生素(新霉素)抗性的基因选择细胞系， 从而获得表达产物水平升高。通过以上描述，本发明的诸多变动对本领域技术人员是显而易见的。这样的明显变动属于所附权利要求书的完整的意图范围内。
1权利要求
1.一种分离的核酸，包含选自下组的一个或多个序列SEQ ID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6，它们的互补链、变体和功能性片段， 以及与它们具有至少70%同源性的序列。
2.如权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，所述一个或多个序列包含S/MAR序列。
3.如权利要求2所述的分离的核酸，其特征在于，所述一个或多个S/MAR序列在所述序列用于表达系统时增加生物分子的表达。
4.如权利要求3所述的分离的核酸，其特征在于，所述一个或多个S/MAR序列不依赖所述序列在表达系统中的取向而增加所述生物分子的表达。
5.如权利要求3所述的分离的核酸，其特征在于，所述生物分子是蛋白质。
6.如权利要求3所述的分离的核酸，其特征在于，所述生物分子是融合蛋白。
7.如权利要求6所述的分离的核酸，其特征在于，所述融合蛋白是重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融合蛋白。
8.如权利要求2所述的分离的核酸，其特征在于，所述一个或多个S/MAR序列包含一个或多个核苷酸序列基序。
9.如权利要求8所述的分离的核酸，其特征在于，所述一个或多个核苷酸序列基序包含至少一个富含AT的核苷酸基序。
10.一种构建表达效率增大的表达载体的方法，所述方法包括将如权利要求1所述的分离的核酸插入到表达载体中。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述表达载体是哺乳动物表达载体。
12.一种包含如权利要求1所述的分离的核酸的载体。
13.如权利要求12所述的载体，其特征在于，所述载体是细菌质粒、噬菌体载体、酵母附加型载体、人工染色体载体或病毒载体。
14.如权利要求12所述的载体，其特征在于，所述载体是哺乳动物表达载体。
15.一种产生重组宿主细胞的方法，所述方法包括将权利要求1所述的分离的核酸或如权利要求12所述的表达载体引入宿主细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，通过转染引入所述分离的核酸或表达载体。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述分离的核酸在转染后整合到所述重组宿主细胞的基因组中。
18.一种由如权利要求15所述的方法产生的宿主细胞。
19.一种包含如权利要求12所述的载体的宿主细胞。
20.如权利要求18或19所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是真核细胞。
21.如权利要求18或19所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
22.一种包含核酸分子的表达载体，所述核酸分子包含(a)与一个或多个表达控制元件操作性连接的蛋白质编码序列，和(b)选自下组的一个或多个S/MAR序列SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6，它们的互补链、 变体和功能性片段，以及与它们具有至少70%同源性的序列。
23.如权利要求22所述的表达载体，其特征在于，所述蛋白质是融合蛋白。
24.如权利要求22所述的表达载体，其特征在于，所述蛋白质是重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-AlgG Fc融合蛋白。
25.一种包含如权利要求22所述的表达载体的宿主细胞。
26.如权利要求25所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是真核细胞。
27.如权利要求25所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
28.一种包含核酸分子的表达载体，所述核酸分子包含(a)与一个或多个表达控制元件操作性连接的肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融合蛋白的编码序列，和(b)选自下组的一个或多个 S/MAR 序列SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6，它们的互补链、变体和功能性片段，以及与它们具有至少 70%同源性的序列。
29.一种包含如权利要求观所述的表达载体的宿主细胞。
30.如权利要求四所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是真核细胞。
31.如权利要求四所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
32.如权利要求观所述的表达载体，其特征在于，所述一个或多个表达控制元件包含转录启动子、转录增强子、转录阻抑物、多聚腺苷酸化位点、复制起点、翻译起始信号和翻译终止信号中的至少一个。
33.如权利要求32所述的表达载体，其特征在于，所述一个或多个S/MAR序列位于所述转录启动子的上游。
34.如权利要求32所述的表达载体，其特征在于，所述一个或多个S/MAR序列位于所述转录启动子的下游。
35.如权利要求32所述的表达载体，其特征在于，所述一个或多个S/MAR序列位于所述翻译终止信号的下游。
36.如权利要求32所述的载体，其特征在于，所述一个或多个S/MAR序列位于所述转录启动子的上游和所述翻译终止信号的下游。
37.如权利要求32所述的载体，其特征在于，所述一个或多个S/MAR序列位于所述转录启动子的下游和所述翻译终止信号的下游。
38.如权利要求观所述的表达载体，其特征在于，所述一个或多个S/MAR序列位于距离编码肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融合蛋白的序列0-10ΚΒ的位置。
39.如权利要求观所述的表达载体，其特征在于，所述一个或多个S/MAR序列位于距离复制起点0-10ΚΒ的位置。
40.如权利要求观所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体用于肿瘤坏死因子α 受体(TNFR)-人IgG Fc融合蛋白的重组表达。
41.一种产生蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤(a)用包含(I)编码所述蛋白质的序列和(II)选自下组的一个或多个S/MAR序列的表达载体转染哺乳动物细胞SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5 禾口 SEQ ID NO :6，它们的互补链、变体和功能性片段，以及与它们具有至少70%同源性的序列；(b)在适合所述蛋白质表达的条件下培养所述转染的哺乳动物细胞；和(c)分离表达的蛋白质。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是融合蛋白。
43.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-AlgG Fc融合蛋白。
44.一种产生肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤(a)用包含(I)编码肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融合蛋白的序列和 (II)选自下组的一个或多个S/MAR序列的表达载体转染哺乳动物细胞SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6，它们的互补链、变体和功能性片段，以及与它们具有至少70%同源性的序列；(b)在适合所述融合蛋白表达的条件下培养所述转染的哺乳动物细胞；和(c)分离表达的融合蛋白。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述方法还包括纯化所述分离的融合蛋白的步骤。
46.如权利要求44所述的方法产生的肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-AIgGFc融合蛋白。
47.一种产生肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤(a)用包含编码肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgGFc融合蛋白的序列的表达载体转染哺乳动物细胞；(b)用包含一个或多个选自下组的S/MAR序列的质粒共转染所述哺乳动物细胞:SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6，它们的互补链、变体和功能性片段，以及与它们具有至少70%同源性的序列； (c)在适合所述融合蛋白表达的条件下培养所述转染的哺乳动物细胞；和(d)分离表达的融合蛋白。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，还包括纯化所述分离的融合蛋白的步骤。
49.如权利要求47所述的方法产生的肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-AIgGFc融合蛋白。
50.一种影响一个或多个S/MAR序列活性的因子，其特征在于，所述一个或多个S/MAR 序列包含选自下组的一个或多个序列:SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4,SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6，它们的互补链、变体和功能性片段，以及与它们具有至少70%同源性的序列。
51.如权利要求48所述的因子，其特征在于，所述因子是遗传因子或外遗传因子中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及表达重组可溶性蛋白质的载体和化合物。更具体而言，本发明涉及表达重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融合蛋白的核酸分子、表达载体和宿主细胞。本发明还涉及采用所述表达载体转染的宿主细胞制备重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融和蛋白的方法。
文档编号C12N15/13GK102177240SQ200980136144
公开日2011年9月7日 申请日期2009年8月12日 优先权日2008年8月12日
发明者A·维亚斯, G·切拉帕, S·梅特亚, V·M·帕特尔 申请人:阿维斯塔根有限公司