抗原特异性细胞毒性t细胞的制备试剂盒的制作方法

专利名称：抗原特异性细胞毒性t细胞的制备试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及在抗原特异性的细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphoc yte 以下也称为“CTL”)的制备中利用的试剂盒及其使用。本申请基于2008年10月31日申请的日本国专利申请第2008-280786号和2009年7月15日申请的日本国专利申请第2009-166630 号主张优先权，这些专利申请的全部内容通过参照来援引。
背景技术：
抗原特异性细胞毒性T细胞疗法(CTL疗法)作为下一代的免疫疗法而被期待。 CTL疗法中，在生物体外制备抗原特异性CTL。以往，抗原特异性CTL的制备伴随着复杂且繁杂的操作，不得不依靠开放体系培养系统。因此，必须在医疗用等级的培养细胞加工中心(CPC)内配备、管理用于保持等级100 (class 100)级别的清洁环境的设施，需要巨大的费用。另外，以往的方法中，使用各种细胞因子，制备时所需要的费用也相当可观。进而，虽说在保持等级100级别的设施中制备，但是利用开放体系的培养伴随安全方面的风险。这样，以往的抗原特异性CTL制备方法中操作性、经济性和安全性成为实用化的很大障碍，只能在有限的设施中实施。应予说明，本申请人中的一人在在先专利申请(专利文献1)中，提出了兼备简便性和安全性，而且能够以低成本实施的病毒特异性CTL培养系统。该培养系统的主要特征是在抗原特异性的细胞毒性T细胞的诱导、增殖中不利用树突状细胞，在诱导的CTL的分离中使用⑶137抗原。专利文献专利文献1 国际公开第2008/023786号小册子

发明内容
专利文献1中提出的上述培养系统与以往的系统相比带来了飞跃性的进步。但是，对于各工序中的细胞的操作，没有采用特有的手段、方法，在操作性方面还有改善的余地。另外，虽然指出了不在开放体系、而在封闭体系中培养的重要性，但是没有提供具体的对策。因此，本发明的课题是谋求抗原特异性CTL的制备中的操作性、经济性和安全性的进一步的改善，促进CTL疗法的实用化。本申请人以在先专利申请(专利文献1)中报告的培养系统为基础，为了解决上述课题而反复进行了研究。其结果，通过重新研究各工序，并对培养基、培养容器等的形态、操作方法等独自地进行钻研，从而发现了对抗原特异性细胞毒性T细胞的制备极其有用的试剂盒的构成。这样，本发明的发明人进行深入研究，最终完成了本发明，本发明如下。[1] 一种制备试剂盒，其特征在于，是用于抗原特异性细胞毒性T细胞制备方法的制备试剂，上述抗原特异性细胞毒性T细胞制备方法包括诱导抗原特异性细胞毒性T细胞的第1工序；制备抗原呈递用活化T细胞的第2工序；和使用通过上述第1工序诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞和通过第2工序制备的抗原呈递用活化T细胞，使抗原特异性细胞毒性T细胞增殖的第3工序；作为用于上述第1工序的构成要素，具备(1-1)容纳在注入容器中的含抗原肽培养基，(1-2)至少2个容纳在注入容器中的含IL-2培养基，和(1-3)密封型培养容器，具备用于注入另外制备的外周血单核细胞的第1 口，用于注入上述含抗原肽培养基的第2 口，与上述含IL-2培养基的数量至少是相同数量的、用于注入上述含IL-2培养基的第3 口，和用于移出诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞的第4 Π ；作为用于上述第2工序的构成要素，具备(2-1)容纳在注入容器中的含抗⑶3抗体培养基，(2-2)至少2个容纳在注入容器中的含IL-2培养基，(2-3)容纳在注入容器中的含抗原肽培养基，和(2-4)密封型培养容器，具备用于注入另外制备的外周血单核细胞的第1 口，用于注入上述含抗CD3抗体培养基的第2 口，与上述含IL-2培养基的数量至少是相同数量的、用于注入上述含IL-2培养基的第3 口，用于注入上述含抗原肽培养基的第4 口，和用于移出所制备的抗原呈递用活化T细胞的第5 口 ；作为用于上述第3工序的构成要素，具备(3-1)容纳在注入容器中的用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基，(3-2)容纳在注入容器中的用于分离抗原呈递用活化T细胞的培养基，(3-3)第1密封型分离容器，具备用于移入诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞的第1 口，排液用的第2 口，用于注入上述用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基的第 3 口，和用于移出分离后的抗原特异性细胞毒性T细胞的第4 口，(3-4)第2密封型分离容器，具备用于移入制备的抗原呈递用活化T细胞的第1 口，排液用的第2 口，用于注入上述用于分离抗原呈递用活化T细胞的培养基的第3 口，和用于移出分离后的抗原呈递用活化T细胞的第4 口，(3-5)至少2个容纳在注入容器中的增殖用培养基，上述增殖用培养基含有IL-2 或IL-15或这两者，和(3-6)密封型培养容器，具备用于移入分离后的抗原特异性细胞毒性T细胞的第 1 口，用于移入分离后的抗原呈递细胞的第2 口，用于注入另外制备的血清或血浆的第3 口， 与上述增殖用培养基的数量至少是相同数量的、用于注入上述增殖用培养基的第4 口，和用于移出增殖的抗原特异性细胞毒性T细胞的第5 口。[2]根据[1]所述的制备试剂盒，其中，上述(1-2)的含IL-2培养基的数量为3 5。[3]根据[1]或[2]所述的制备试剂盒，其中，上述0-2)的含IL-2培养基的数量为3 6。[4]根据[1] [3]中任一项所述的制备试剂盒，其中，上述(3-1)的用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基和上述(3-2)的用于分离抗原呈递用活化T细胞的培养基是含IL-2培养基。
[5]根据[1] [4]中任一项所述的制备试剂盒，其中，对于上述(1-3)的密封型培养容器的第1 口 第3 口、上述0-4)的密封型培养容器的第1 口 第4 口、以及上述 (3-6)的密封型培养容器的第3 口和第4 口而言分别具备2种帽，该2种帽包括未使用时安装的帽和使用后安装的帽，上述使用后安装的帽可与未使用时安装的帽辨别开。[6]根据[1] [5]中任一项所述的制备试剂盒，其中，上述(1-3)的密封型培养容器的第3 口、上述(2-4)的密封型培养容器的第3 口、和上述(3-6)的密封型培养容器的第4 口分别为分支型口。[7]根据[1] W]中任一项所述的制备试剂盒，其中，上述(1-3)的密封型培养容器、上述0-4)的密封型培养容器和上述(3-6)的密封型培养容器分别具备预备用口。[8]根据[1] [7]中任一项所述的制备试剂盒，其中，还具备容纳在容器中的用于制备外周血单核细胞的培养基。[9]根据[8]所述的制备试剂盒，其中，还具备用于制备外周血单核细胞的容器。[10]根据[1] [9]中任一项所述的制备试剂盒，其中，还具备用于分离利用第3 工序而增殖的抗原特异性细胞毒性T细胞的分离容器。[11]根据[10]所述的制备试剂盒，其中，还具备用于冻结保存使用上述分离容器分离的细胞的保存容器。[12] 一种制备试剂盒，其特征在于，是用于抗原特异性细胞毒性T细胞制备方法的制备试剂，上述抗原特异性细胞毒性T细胞制备方法包括诱导抗原特异性细胞毒性T细胞的第1工序；制备抗原呈递细胞的第2工序；和使用通过上述第1工序诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞和通过第2工序制备的抗原呈递细胞，使抗原特异性细胞毒性T细胞增殖的第3工序；作为用于上述第1工序的构成要素，具备(1-1)容纳在注入容器中的含抗原肽培养基，(1-2)至少2个容纳在注入容器中的含IL-2培养基，和(1-3)密封型培养容器，具备用于注入另外制备的外周血单核细胞的第1 口，用于注入上述含抗原肽培养基的第2 口，与上述含IL-2培养基的数量至少是相同数量的、用于注入上述含IL-2培养基的第3 口，和用于移出诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞的第4 Π ；作为用于上述第2工序的构成要素，具备容纳在容器中的冻结干燥状态的抗原呈递细胞；作为用于上述第3工序的构成要素，具备(3-1)容纳在注入容器中的用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基，(3-2)第1密封型分离容器，具备用于移入诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞的第1 口，排液用的第2 口，用于注入上述用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基的第 3 口，和用于移出分离后的抗原特异性细胞毒性T细胞的第4 口 ；(3-3)至少2个容纳在注入容器中的增殖用培养基，上述增殖用培养基含有IL-2 或IL-15或这两者，和(3-4)密封型培养容器，具备用于移入分离后的抗原特异性细胞毒性T细胞的第 1 口，用于移入制备的抗原呈递细胞的第2 口，用于注入另外制备的血清或血浆的第3 口，与
7上述增殖用培养基的数量至少是相同数量的、用于注入上述增殖用培养基的第4 口，和用于移出增殖的抗原特异性细胞毒性T细胞的第5 口。[13] 一种抗原特异性细胞毒性T细胞的制备方法，其特征在于，使用[1] [12] 中任一项所述的制备试剂盒。利用本发明的制备试剂盒，能以简便的操作制备抗原特异性细胞毒性T细胞。另外，制备所需要的时间也变得非常短。另一方面，本发明的制备试剂盒使在封闭体系内进行所有的培养工序成为可能。由此还能够带来安全性的提高。通过确保高安全性，设备所需要的级别降低，能够以低成本制备抗原特异性细胞毒性T细胞。


图1是抗原特异性CTL制备试剂盒的一个例子。 于抗原特异性CTL的诱导工序的构成要素。图2是抗原特异性CTL制备试剂盒的一个例子。 于抗原呈递细胞的制备工序的构成要素。图3是抗原特异性CTL制备试剂盒的一个例子。 于抗原特异性CTL的增殖工序的构成要素。图4是抗原特异性CTL制备试剂盒的一个例子。 于抗原特异性CTL的增殖工序的构成要素。图5是表示细胞的移入用管、移出用管和分注用管的图。图6是表示抗原特异性CTL诱导工序的流程图。图7是表示抗原呈递细胞制备工序的流程图。图8是表示抗原特异性CTL增殖工序的流程图。图9是表示抗原特异性CTL增殖工序以后的各工序的流程图。图10是流式细胞仪分析的结果。在图6 (抗原特异性CTL诱导工序的流程)所示的第0天、第7天和第14天，以及图8 (抗原特异性CTL增殖工序的流程)所示的第21天进行取样，用流式细胞仪进行分析(上段)。下段是表示总细胞数和四聚体阳性细胞数的经时变化的曲线图。图11是流式细胞仪分析的结果。在图6 (抗原特异性CTL诱导工序的流程)所示的第0天、第7天和第14天、图8 (抗原特异性CTL增殖工序的流程)所示的第21天、以及进一步增殖4天的时刻(第25天)进行取样，用流式细胞仪进行分析(上段)。下段左是表示总细胞数和四聚体阳性细胞数的经时变化的曲线图。下段右是表示细胞毒性试验的结果的曲线图。细胞毒性试验中，将由供体制备的EBV(爱泼斯坦巴尔病毒)感染LCL(淋巴母细胞)作为靶细胞，将其与效应细胞(四聚体阳性细胞)以规定的比率(效应细胞/ 靶细胞=10)混合后，以各浓度添加抗原肽进行孵育。由伴随细胞的溶解而检测到的51Cr 的量来评价细胞毒性。作为抗原肽，使用了 QYD(HLA-AM402限制性CMV pp65表位肽)和 TYG(HLA-A*2402限制性^V LMP2a表位肽)(对照组)。图12是流式细胞仪分析的结果。在图6 (抗原特异性CTL诱导工序的流程)所示的第0天、第7天和第14天、图8 (抗原特异性CTL增殖工序的流程)所示的第21天、以及进一步增殖3天的时刻(第24天)进行取样，用流式细胞仪进行分析(上段)。下段是表
试剂盒的构成要素中，表示了用试剂盒的构成要素中，表示了用试剂盒的构成要素中，表示了用试剂盒的构成要素中，表示了用示总细胞数和四聚体阳性细胞数的经时变化的曲线图。图13是流式细胞仪分析的结果。在图6 (抗原特异性CTL诱导工序的流程)所示的第0天、第7天和第14天、图8 (抗原特异性CTL增殖工序的流程)所示的第21天、以及进一步增殖7天的时刻(第28天)进行取样，用流式细胞仪进行分析(上段)。下段左是表示总细胞数和四聚体阳性细胞数的经时变化的曲线图。下段右是表示细胞毒性试验的结果的曲线图。细胞毒性试验中，将由供体制备的EBV(爱泼斯坦巴尔病毒)感染LCL(淋巴母细胞)作为靶细胞，将其与效应细胞(四聚体阳性细胞)以规定的比率(效应细胞/ 靶细胞=10)混合后，以各浓度添加抗原肽进行孵育。由伴随细胞的溶解而检测到的51Cr 的量来评价细胞毒性。作为抗原肽，使用了 QYD(HLA-A*2402限制性CMV pp65表位肽)和 TYG(HLA-A*2402限制性^V LMP2a表位肽)(对照组)。图14是流式细胞仪分析的结果。在图6 (抗原特异性CTL诱导工序的流程)所示的第0天、第7天和第14天、图8 (抗原特异性CTL增殖工序的流程)所示的第21天、以及进一步增殖4天的时刻(第25天)进行取样，用流式细胞仪进行分析(上段)。下段左是表示总细胞数和四聚体阳性细胞数的经时变化的曲线图。下段右是表示细胞毒性试验的结果的曲线图。细胞毒性试验中，将由供体制备的EBV(爱泼斯坦巴尔病毒)感染LCL(淋巴母细胞)作为靶细胞，将其与效应细胞(四聚体阳性细胞)以规定的比率(效应细胞/ 靶细胞=10)混合后，以各浓度添加抗原肽进行孵育。由伴随细胞的溶解而检测到的51Cr 的量来评价细胞毒性。作为抗原肽，使用了 NLV(HLA-A*0201限制性CMV pp65表位肽)和 CLG(HLA-A*0201限制性^V LMP2a表位肽)(对照组)。图15是利用了冻结干燥状态的抗原呈递细胞的抗原特异性CTL制备试剂盒的一个例子。试剂盒的构成要素中，表示了用于抗原特异性CTL的诱导工序的构成要素。图16是利用了冻结干燥状态的抗原呈递细胞的抗原特异性CTL制备试剂盒的一个例子。试剂盒的构成要素中，表示了用于抗原呈递细胞的制备工序的构成要素。图17是利用了冻结干燥状态的抗原呈递细胞的抗原特异性CTL制备试剂盒的一个例子。试剂盒的构成要素中，表示了用于抗原特异性CTL的增殖工序的构成要素。图18是利用了冻结干燥状态的抗原呈递细胞的抗原特异性CTL制备试剂盒的一个例子。试剂盒的构成要素中，表示了用于抗原特异性CTL的增殖工序的构成要素。图19是冻结干燥抗原呈递细胞时的条件的例子。
具体实施例方式本发明的第1方面涉及用于抗原特异性细胞毒性T细胞(抗原特异性CTL)的制备的制备试剂盒。“抗原特异性CTL”是指对特定的抗原特异性高的CTL。抗原特异性CTL 是特异性地识别不表达对应的抗原而进行呈递的细胞，并发挥细胞毒性。抗原特异性CTL 通过生物体具有的防御机构在生物体内也能被诱导，但本发明中“抗原特异性CTL”是在生物体外被诱导。本发明的制备试剂盒具备用于实施抗原特异性CTL的诱导(第1工序)、抗原呈递用活化T细胞的制备(第2工序)和抗原特异性CTL的增殖(第3工序)所必需的要素。 对每个工序、本发明的制备试剂盒所包括的要素进行说明。(第1工序CTL的诱导)
该工序中利用外周血单核细胞诱导对特定的抗原具有特异性的CTL。为了实施该工序，本发明的制备试剂盒至少包括以下的要素(1-1) (1-3)。(1-1)容纳在注入容器中的含抗原肽培养基，(1-2)至少2个容纳在注入容器中的含IL-2培养基，和(1-3)密封型培养容器，具备用于注入另外制备的外周血单核细胞的第1 口，用于注入上述含抗原肽培养基的第2 口，与上述含IL-2培养基的数量至少是相同数量的、用
于注入上述含IL-2培养基的第3 口，和用于移出诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞的第4□。以下，对各要素的详情进行说明。应予说明，在以下的说明中，只要没有特别的说明，“含抗原肽培养基”表示“容纳在注入容器中的含抗原肽培养基”。同样地，“含IL-2培养基”表示“容纳在注入容器中的含IL-2培养基”。(1-1)含抗原肽培养基注入容器的形态，只要是能够保持培养基的同时，能够将作为收容物的培养基注入后述的密封型培养容器中，就没有特别的限定。例如，将能够塞严的注射器(syringe)作为注入容器来利用即可。注入容器中容纳有含抗原肽培养基。含抗原肽培养基是指根据目的含有特定的抗原肽的培养基。作为抗原肽，可以例示病毒(巨细胞病毒、爱泼斯坦巴尔病毒、腺病毒等)、 肿瘤抗原(WT1、hTERT、MN/CA9、gp 100、MART 1、TRP1、TRP2、酪氨酸酶、MAGE1、MAGE2、MAGE3、 MAGE6、NY-ES0-1、MUMl、BAGE、GAGEl、GAGE2、CEA、PSA 等)的 HLA 结合肽。通常只使用 1 种抗原肽，但不阻止使用2种以上的抗原肽。可以通过在适合T细胞的培养的培养基(例如 RPMI1640、AIM-V、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco' s modified eagle medium) 等)中添加抗原肽来制备含抗原肽培养基。还可以添加血清、血浆、血清白蛋白、抗生素、 L-谷氨酰胺等。培养基中的抗原肽的量例如为0.01yg/mL 100yg/mL。对于含抗原肽培养基的量，例如为5mL 50mL。根据含抗原肽培养基的量决定注入容器的大小即可。例如，如果使用5mL的含抗原肽培养基，则将5mL用的注射器作为注入容器来采用即可。(1-2)含 IL-2 培养基注入容器的构成与(1-1)的情况相同，因此省略其说明。注入容器中容纳有含 IL-2培养基。可以通过在适合T细胞的培养的培养基(例如RPMI1640、AIM-V、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified eagle medium)、X_VIV0(BioWhittaker 公司)、 ALyS505N((株)细胞科学研究所)等)中添加IL-2来制备含IL-2培养基。还可以添加血清、血浆、血清白蛋白、抗生素、L-谷氨酰胺等。作为IL-2，优选使用重组人IL-2(例如 Chiron 公司提供的 PR0LEUKIN)。IL-2 的含量例如为 10IU/mL 1000IU/mL。本发明中，至少使用2个容纳在注入容器中的含IL-2培养基。优选地，含IL-2培养基的数量为3以上。具体来说，例如含IL-2培养基的数量为3 5。如果增加含IL-2培养基的数量，则在CTL诱导工序中能够追加的培养基的次数增加。由此可以谋求诱导效率的提高和/或诱导的细胞数的增加。培养基组成(IL-2的含量、其它成分的含量等)、液体量等不需要对所有的含IL-2 培养基进行统一。例如，可以进行如下的各种组合将液体量少的含IL-2培养基(例如 IOmL)和液体量多的含IL-2培养基(例如20mL)进行组合，或将IL-2含量少的含IL-2培养基(例如100IU/mL)和IL-2含量多的含IL-2培养基(例如1000IU/mL)进行组合。前者的组合的情况下，考虑到操作性和效率性，优选将液体量少的含IL-2培养基的数量作为 1，将液体量多的含IL-2培养基的数量作为2 4。再者，还可以将含IL-2培养基的一部分作为预备用来使用。(1-3)密封型培养容器密封型培养容器至少具备4种口(第1 第4 口)。第1 口是另外制备的外周血单核细胞的注入用口。同样地，第2 口是含抗原肽培养基的注入用口，第3 口是含IL-2培养基的注入用口，第4 口是用于移出诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞的注入用口。对于第2 口，具备与含IL-2培养基的数量至少相同的数量。即，第2 口的数量是与含IL-2培养基的数量相同或其以上。设有比含IL-2培养基的数量多的第2 口的情况下， 可以将一部分的口作为预备的口来利用。第1 口、第3 口和第4 口的数量原则上为1。但是，还可以设有应对操作失误的预备口。预备口可以设置在每个口、或设置成与2个以上的口(例如第2 口和第3 口)共通的形式。各口的形态没有特别的限定。可以采用例如，Luer锁紧接口类型、针刺口(针刺一卜)或膜管等。其中，优选采用Luer锁紧接口类型的口。这是因为通过确实的固定
可以防止漏液。没有必要所有的口为相同的形态。例如，将第1 口制成能够利用注射针进行注入的口(例如，具有由橡胶等弹性体构成的注入口的情形)，将其它的口制成Luer锁紧接口类型的口。在优选的一方式中，将所有的口制成Luer锁紧接口类型。利用该结构可以防止各注入操作中的漏液，同时操作方法共通化，因此，提高操作性。还可以将第1 第4 口的一部或全部制成分支型口。如果采用分支型口，则口和容器本体的连接部的数量变少，构造简化。因而，制造和操作变得容易，而且还可以防止使用时的状态不佳的发生。这样，利用分支型口是需要在密封型容器中具备相当数量的口的本发明中有利的结构。分支型口的分支数没有特别的限定。例如，可以使用分支数为2 4的分支型口。 优选地，至少将含IL-2培养基(1-2)用的第3 口制成分支型口。应予说明，本说明书中，分支型口的情况下，将分支的数量作为口数。例如，3分支口视为3个口。本发明的密封型培养容器中特有的结构是各口。因而，本发明的密封型培养容器的结构除了与各口相关的部分以外，按照公知的结构(例如能够利用于细胞培养的各种袋)制造即可。从操作容易等理由考虑，优选由柔软的材质构成的袋的形态。(第2工序抗原呈递用活化T细胞的制备)在该工序中，利用外周血单核细胞来制备抗原呈递用活化T细胞。为了实施该工序，本发明的制备试剂盒至少包括以下的要素(2-1) (2-4)。应予说明，“抗原呈递用活化T细胞”是指通过对外周血单核细胞施加特定的刺激，在细胞表面表达副刺激因子的细胞，是能够发挥作为促进抗原特异性CTL的增殖的抗原呈递细胞的功能的细胞。使用了本发明的制备试剂盒的情况下，通过使用抗CD3抗体，可以制备抗原呈递用活化T细胞。应予说明，从说明的便利上，以下将“抗原呈递用活化T细胞”简称为“抗原呈递细胞”。(2-1)容纳在注入容器中的含抗⑶3抗体培养基，(2-2)至少2个容纳在注入容器中的含IL-2培养基，(2-3)容纳在注入容器中的含抗原肽培养基，和
(2-4)密封型培养容器，具备用于注入另外制备的外周血单核细胞的第1 口，用于注入上述含抗CD3抗体培养基的第2 口，与上述含IL-2培养基的数量至少是相同数量的、用于注入上述含IL-2培养基的第3 口，用于注入上述含抗原肽培养基的第4 口，和用于移出制备的抗原呈递用活化T细胞的第5 口。以下，对各要素进行详情说明，但对于没有特别言及的事项(注入容器的结构、除了与口相关的部分之外的密封型培养容器的结构等)，与第1工序中使用的对应的要素相同，援引其说明。另外，在以下的说明中，只要没有特别地言及，“含抗CD3抗体培养基”就表示“容纳在注入容器中的含抗CD3抗体培养基”。同样地，“含IL-2培养基”表示“容纳在注入容器中的含IL-2培养基”，“含抗原肽培养基”表示“容纳在注入容器中的含抗原肽培养
其”
难 ο(2-1)含抗CD3抗体培养基用于含抗⑶3抗体培养基的抗⑶3抗体可以通过⑶3分子或使用了其一部分的免疫学方法来制备。也可以使用市售的抗CD3抗体。市售的抗CD3抗体的例子是0KT-3抗体 (Janssen Pharmaceutical公司)。从安全性方面考虑，优选使用获得药品批准的0KT-3抗体。应予说明，抗CD3抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。但是，如果从特异性、 效率方面考虑，优选使用单克隆抗体的抗CD3抗体。还可以并用2种以上的抗CD3抗体。通过在适合T细胞的培养的培养基(例如RPMI1640、AIM_V、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco，s modified eagle medium)等)中添加抗CD3抗体，可以制备含抗 CD3抗体培养基。还可以添加血清、血浆、血清白蛋白、抗生素、L-谷氨酰胺等。培养基中的抗CD3抗体的量是例如0. 01 μ g/mL 10 μ g/mL。对于含抗⑶3抗体培养基的量，是例如 5mL 5 OmL ο(2- 含 IL-2 培养基与(1- 的含IL-2培养基同样具备2个以上的含IL-2培养基。优选含IL_2培养基的数量为3以上。进一步优选含IL-2培养基的数量为4以上。具体来说，例如含IL-2 培养基的数量为3 6。如果含IL-2培养基的数量增加，则抗原呈递细胞的制备工序中能够追加培养基的次数增加。由此，可以谋求制备效率的提高和/或制备的细胞数的增加。培养基组成(IL-2的含量、其它成分的含量等)、液体量等不需要对所有的含IL-2 培养基进行统一。例如，可以进行如下的各种组合将液体量少的含IL-2培养基(例如 IOmL)和液体量多的含IL-2培养基(例如20mL)进行组合，或将IL-2含量少的含IL-2培养基(例如100IU/mL)和IL-2含量多的含IL-2培养基(例如1000IU/mL)进行组合。优选将IL-2含量和液体量少的含IL-2培养基(例如液体量为10mL，IL-2含量为100IU/mL) 与IL-2含量和液体量多的含IL-2培养基(例如液体量为20mL，IL-2含量为1000IU/mL) 组合使用。这种情况下，考虑到操作性和效率性，优选例如将前者的数量作为1，将后者的数量作为3 5。再者，还可以将含IL-2培养基的一部分作为预备用来使用。(2-3)含抗原肽培养基对于该含抗原肽培养基，由于与(1-1)的含抗原肽培养基相同，因此省略其说明。(2-4)密封型培养容器该密封型容器至少具备5种口(第1 第5 口)。第1 口是另外制备的外周血单核细胞的注入用口。同样地，第2 口是含抗⑶3抗体培养基注入用的口，第3 口是含IL-2培养基的注入用口，第4 口是含抗原肽培养基的注入用口，第5 口是所制备的抗原呈递用活化T细胞的移出用口。对于第3 口，具备与含IL-2培养基的数量至少相同的数量。即，第2 口的数量是与含IL-2培养基的数量相同或其以上。设有比含IL-2培养基的数量多的第2 口的情况下， 可以将一部分的口作为预备的口来利用。第1 口、第3 口、第4 口和第5 口的数量原则上为 1。但是，还可以设有应对操作失误的预备口。预备口可以设置在每个口、或设置成与2个以上的口(例如第3 口和第4 口)共通的形式。与(1-3)的密封型培养容器的情况相同，各口的形态没有特别的限定。如果表示各口的结构的一个例子，则将第1 口制成能够利用注射针的注入的口(例如，具有由橡胶等弹性体构成的注入口的情形)，将其它的口制成Luer锁紧接口类型的口。优选地，根据与 (1-3)的密封型培养容器的情况相同的理由，将所有的口制成Luer锁紧接口类型。另一方面，与(1-3)的密封型培养容器的情况相同，还可以将第1 第5 口的一部分或全部制成分支型口。优选地，至少将含IL-2培养基(2-2)用的第3 口制成分支型口。(第3工序CTL的增殖)在该工序中，使用通过第1工序诱导的抗原特异性CTL和通过第2工序制备的抗原呈递细胞使抗原特异性CTL增殖。为了实施该工序，本发明的制备试剂盒至少包括以下的要素(3-1) (3-6)。(3-1)容纳在注入容器中的用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)的培养基，(3-2)容纳在注入容器中的用于分离抗原呈递细胞的培养基，(3-3)第1密封型分离容器，具备用于移入诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞的第1 口，排液用的第2 口，用于注入上述用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基的第 3 口，和用于移出分离后的抗原特异性细胞毒性T细胞的第4 口，(3-4)第2密封型分离容器，具备用于移入制备的抗原呈递细胞的第1 口，排液用的第2 口，用于注入上述用于分离抗原呈递用细胞的培养基的第3 口，和用于移出分离后的抗原呈递细胞的第4 口，(3-5)至少2个容纳在注入容器中的增殖用培养基，上述增殖用培养基含有IL-2 或IL-15或这两者，(3-6)密封型培养容器，具备用于移入分离后的抗原特异性细胞毒性T细胞的第 1 口，用于移入分离后的抗原呈递细胞的第2 口，用于注入另外制备的血清或血浆的第3 口， 与上述增殖用培养基的数量至少是相同数量的、用于注入上述增殖用培养基的第4 口和用于移出增殖的抗原特异性细胞毒性T细胞的第5 口。(3-1)用于分离抗原特异性CTL的培养基和(3-2)用于分离抗原呈递细胞的培养
基用于分离抗原特异性CTL的培养基和用于分离抗原呈递细胞的培养基都只要是适合τ细胞的培养的培养基(例如RPMI1640、AIM-V、达尔伯克氏改良伊格尔培养基 (Dulbecco's modified eagle medium)、X_VIVO(BioWhittaker 公司)、ALyS505N((株)细胞科学研究所)等)即可。优选使用添加有IL-2或IL-15的培养基。还可以使用添加有 IL-2和IL-15这两者的培养基。添加IL-2的情况下，其含量是例如10IU/mL 1000IU/ mL。添加IL-15的情况下，其含量是例如lOng/mL lOOng/mL。作为IL-15，优选使用重组人IL-15(例如CellGenix公司提供的CellGro IL-15)。还可以使用添加有血清、血浆、血清白蛋白、抗生素、L-谷氨酰胺等的培养基。用于分离抗原特异性CTL的培养基和用于分离抗原呈递细胞的培养基的组成没有必要相同。典型的是，各准备一个用于分离抗原特异性 CTL的培养基和用于分离抗原呈递细胞的培养基，但是如后述的那样，分离时进行清洗工序的情况下，与其相应地准备所需数量的培养基。(3-3)第1密封型分离容器第1密封型分离容器用于诱导的抗原特异性CTL的分离。第1密封型分离容器至少具备4种口(第1 第4 口)。第1 口是诱导的抗原特异性CTL的移入用口。同样地， 第2 口是排液用的口，第3 口是用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基的注入用口， 第4 口是分离后的CTL的移出用口。各口的形态等没有特别的限定。例如，将第3 口制成 Luer锁紧接口类型的口。这里的“分离”是指从通过第1工序得到的细胞含有培养液回收细胞。本发明中的 “分离”由包括利用离心处理的细胞的沈降(离心)、不要的培养基的废弃(排液)、培养基中的细胞的重悬(培养基的注入)、细胞悬液的回收(细胞的移出)的一系列的操作构成。 也可以不设置用于排液操作的专用口(第2 口)，将CTL的移出用口也用于排液。在细胞的移出操作前，还可以进行再次的离心处理以及接下来的排液操作和培养基的注入操作。即， 还可以编入细胞的清洗工序。还可以重复进行这样的清洗工序(例如2次 4次)。(3-4)第2密封型分离容器第2密封型分离容器用于制备的抗原呈递细胞的分离。第2密封型分离容器至少具备4种口(第1 第4 口)。第1 口是制备的抗原呈递细胞的移入用口。同样地，第2 口是排液用的口，第3 口是用于分离抗原呈递细胞的培养基的注入用口，第4 口是分离后的抗原呈递细胞的移出用口。与第1密封型分离容器同样，各口的形态等没有特别的限定。例如，将第3 口作为Luer锁紧接口类型的口。应予说明，对于这里的“分离”，与第1密封型分离容器的情况相同，因此省略其说明。(3-5)增殖用培养基具备2个以上的增殖用培养基。优选该培养基的数量为3以上。具体来说，例如该培养基的数量为5 7。如果培养基的数量增加，则能够在CTL增殖工序中追加的培养基的次数增加。由此可以谋求增殖效率的提高和/或回收的细胞的数量的增加。增殖用培养基含有IL-2或IL-15或它们两者。IL-2的含量是例如10IU/mL 1000IU/mL。另一方面， IL-15的含量是例如10ng/mL 100ng/mL。(3-6)密封型培养容器该密封型容器至少具备5种口(第1 第5 口)。第1 口是分离后的抗原特异性 CTL的移入用口。同样地，第2 口是分离后的抗原呈递细胞的移入用口，第3 口是另外制备的血清或血浆的注入用口，第4 口是增殖用培养基的注入用口，第5 口是增殖的抗原特异性 CTL的移出用口。对于第4 口，具备与增殖用培养基的数量至少相同的数量。即，第4 口的数量是与增殖用培养基的数量相同或其以上。设有比增殖用培养基的数量多的数目的第4 口的情况下，可以将一部分的口作为预备的口来利用。第1 口、第2 口、第3 口和第5 口的数量原则上为1。但是，还可以设有用于应对操作失误的预备口。预备口可以设置在每个口、或设置成与2个以上的口(例如第3 口和第4 口)共通的形式。 与(1-3)的密封型培养容器的情况相同，各口的形态等没有特别的限定。如果表示各口的结构的一个例子，则将第3 口制成能够利用注射针的注入的口(例如，具有由橡胶等弹性体构成的注入口的情形)，将其它的口制成Luer锁紧接口类型的口。优选地，根据与 (1-3)的密封型培养容器的情况相同的理由，至少将第4 口制成Luer锁紧接口类型。另一方面，与(1-3)的密封型培养容器的情况相同，可以将第1 第5的一部分或全部制成分支型口。优选地，至少将第4 口制成分支型口。 本发明的制备试剂盒中，对所有的培养容器((1-3)、(2-4)、(3-6))，其具备的各口仅用于1次操作。也就是说，使用过一回的口在其后的操作中不再使用。通过进行这样的操作，可以尽量避免污染的发生。对分离容器((3-4)、(3-5))也进行相同的操作，也可以防止分离操作时的污染。本发明的制备试剂盒所含有的各要素通常将每个要素、或二个以上的要素以集中的状态进行包装。优选为密封包装。优选的一方式中，对(1-3)的密封型培养容器的第1 口 第3 口、(2-4)的密封型培养容器的第1 口 第4 口、以及(3-6)的密封型培养容器的第3 口和第4 口而言分别具备2种帽。一个帽安装在未使用状态的口。另一个帽安装在使用完的口。通过使用这样的 2种帽，可以容易地掌握各口是未使用还是使用完了。由此可以防止污染。另外，还可以防止操作失误。这2种帽的结构(颜色、形状等)只要是能够辨别开两者，没有特别的限定。 例如是颜色不同的2种帽。或形状相同的2种帽。作为能够在本发明的制备试剂盒中追加的要素，可以举出用于外周血单核细胞的制备的培养基、容器等，用于外周血单核细胞的注入的容器，用于血浆的制备的培养基、容器等，用于血浆的注入的容器，用于分离通过第3工序增殖的抗原特异性细胞毒性T细胞的分离容器，用于冻结保存使用该分离容器分离的细胞的保存容器，用于细胞的移入、移出或分注的管。例如，如果还具备用于外周血单核细胞的制备的培养基和/或用于外周血单核细胞的制备的容器，则成为能够用于外周血单核细胞的制备的试剂盒，其方便性乃至利用价值高。同样地，如果具备用于分离通过第3工序增殖的抗原特异性细胞毒性T细胞的分离容器(和用于冻结保存使用该分离容器分离的细胞的保存容器)，则成为第3工序以后的操作也可以利用的试剂盒。用于外周血单核细胞的制备的培养基和容器采用制备外周血单核细胞时通常使用的即可。作为这里的培养基的一个例子，可以举出含有血清白蛋白和抗生素的RPMI1640 培养基，作为容器的一个例子，可以举出一次性类型的离心管。另一方面，作为上述的分离容器，可以采用与(3-1)或(3-2)的分离容器相同结构的分离容器，或能够用于细胞的分离的市售的分离用袋(例如分离袋A(NIPR0株式会社))。另外，有市售的用于细胞的冻结的各种袋(例如Froze bag(NIPR0株式会社))，可以将这些中的任意一种作为上述保存容器来使用。以下，对使用了本发明的制备试剂盒的、抗原特异性CTL的制备方法(本发明的第 2方面)进行说明。该制备方法大致由抗原特异性CTL的诱导工序、抗原呈递细胞的制备工序和抗原特异性CTL的增殖工序这3个工序构成。前2者的实施顺序没有限定。S卩，可以将任意一个先实施。还可以将两者同时实施。
(1)抗原特异性CTL的诱导工序在该工序中，最初从第1 口将外周血单核细胞、从第2 口将含抗原肽培养基(1-1) 分别注入密封型培养容器(1- 中。该操作后，将密封型培养容器移到设定在适合T细胞培养的条件(典型的是37°C、5%C02)的培养箱内。经过规定时间(例如1天 4天)后，从培养箱取出密封型培养容器，从第3 口中的一个口注入含IL-2培养基(1- 。在培养箱内培养规定时间(例如2 7天)后，第3 口中的一个口(其中未使用的口)再次注入含IL-2 培养基(1- 到密封型培养容器中。然后，在培养箱内继续培养。使用包括2个含IL-2培养基的制备试剂盒的情况下，此后，移到后述的抗原特异性CTL的增殖工序。使用包括3个以上含IL-2培养基的制备试剂盒的情况下，在移到抗原特异性CTL的增殖工序前，重复规定次数(根据含IL-2培养基的数量，为1次或2次以上)的含IL-2培养基的注入操作和接下来的培养。从进行含IL-2培养基的注入操作后至进行下次含IL-2培养基的注入操作的间隔是例如1天 6天。就如第1次注入操作和第2次注入操作的间隔为5天、第2次注入操作和第3次注入操作的间隔是3天的例子这样，这里的间隔没有必要必须统一。应予说明，外周血单核细胞的制备按照常用方法进行即可。但是，包括用于制备外周血单核细胞的要素的试剂盒的情况下，在制备外周血单核细胞时也利用试剂盒。(2)抗原呈递细胞的制备工序在该工序中，最初从第1 口将外周血单核细胞、从第2 口将含抗CD3抗体培养基 (2-1)分别注入密封型培养容器0-4)。该操作后，将密封型培养容器移到设定在适合T细胞培养的条件(典型的是37°C、5%C02)的培养箱内。经过规定时间(例如1天 4天) 后，从培养箱取出密封型培养容器，从第3 口中的一个口将含IL-2培养基0-2)注入到密封型培养容器。优选地，在这里的注入操作中，相比于后面使用的含IL-2培养基，使用IL-2 浓度低的培养基。在培养箱内培养规定时间(例如2 7天)后，第3 口中的一个口(其中未使用的口)再次注入含IL-2培养基0-2)。然后，在培养箱内继续培养。使用包括2 个含IL-2培养基的制备试剂盒的情况下，此后，使用第4 口进行含抗原肽培养基的注入操作。该注入操作后，将密封型培养容器放置规定时间(例如30分钟 2小时)。在此期间， 优选通过将密封型培养容器倾斜等以规定间隔(例如每隔15分钟)进行搅拌。此后，移到后述的抗原特异性CTL的增殖工序。使用包括3个以上含IL-2培养基的制备试剂盒的情况下，在含抗原肽培养基的注入操作前，重复规定次数(根据含IL-2培养基的数量，为1次或2次以上)的含IL-2培养基的注入操作和接下来的培养。应予说明，进行含IL-2培养基的注入操作后至进行下次含IL-2培养基的注入操作的间隔是例如1天 6天。就如第1 次注入操作和第2次注入操作的间隔为3天、第2次注入操作和第3次注入操作的间隔为 2天的例子这样，这里的间隔没有必要必须统一。(3)抗原特异性CTL的增殖工序在该工序中，最初分别回收在抗原特异性CTL的诱导工序中诱导的抗原特异性 CTL和在抗原呈递细胞的制备工序中制备的抗原呈递细胞。在抗原特异性CTL的回收中使用密封型培养容器(1- 的第4 口。通常是利用管等将该第4 口与第1密封型分离容器 (3-3)的第1 口连接，直接在第1密封型分离容器内回收抗原特异性CTL。使用第4 口附带有管的密封型培养容器(1-3)的情况下，不需要另外准备管就可以进行抗原特异性CTL的回收。
抗原呈递细胞的回收也进行相同的操作。即，通常是利用管等将密封型培养容器 (2-4)的第5 口与第2密封型分离容器(3-4)的第1 口连接，直接在第2密封型分离容器内回收抗原呈递细胞。接着，将回收到第1密封型分离容器的抗原特异性CTL进行分离。S卩，将第1密封型分离容器提供到离心处理，除去不需要的培养液。然后，将用于分离抗原特异性CTL的培养基从第3 口注入到第1密封型分离容器中，使细胞悬浮。接下来，利用管等将第1密封型分离容器的第4 口与密封型培养容器(3-6)的第1 口连接，从第1密封型分离容器向密封型培养容器(3-6)输送细胞。另一方面，将回收到第2密封型分离容器的抗原呈递细胞按照与抗原特异性CTL 的分离时相同的程序进行分离。然后，利用管等将第2密封型分离容器的第4 口和密封型培养容器(3-6)的第2 口连接，从第2密封型分离容器向密封型培养容器(3-6)输送细胞。 应予说明，不考虑抗原特异性CTL的分离及输送、和抗原呈递细胞的分离及输送的顺序。接着，将血清或血浆从第3 口注入到密封型培养容器(3-6)后，将密封型培养容器移到设定在适合T细胞培养的条件(典型的是37°C、5%C02)的培养箱内。但是，也可以在抗原特异性CTL的输送和/或抗原呈递细胞的输送之前，进行血清或血浆的注入操作。经过规定时间(例如1天 4天)后，从培养箱取出密封型培养容器，从第4 口中的一个口将增殖用培养基(3-5)注入到密封型培养容器。在培养箱内培养规定时间(例如2 7天) 后，第4 口中的一个口(其中未使用的口)再次注入增殖用培养基(3-5)。然后，在培养箱内继续培养。使用包括2个增殖用培养基的制备试剂盒的情况下，此后，移到细胞的回收操作。使用包括3个以上增殖用培养基的制备试剂盒的情况下，在回收操作前，重复规定次数 (根据增殖用培养基的数量，为1次或2次以上)的增殖用培养基的注入操作和接下来的培养。进行增殖用培养基的注入操作后至进行下次增殖用培养基的注入操作的间隔是例如 1天 6天。就如第1次注入操作和第2次注入操作的间隔为3天、第2次注入操作和第3 次注入操作的间隔为2天的例子这样，这里的间隔没有必要必须统一。在回收操作中，使用密封型培养容器(3-6)的第5 口。即，利用第5 口移出通过以上的操作增殖的抗原特异性CTL。本发明的更进一步的方面(第3方面)是，提供利用了冻结干燥状态的抗原呈递细胞的抗原特异性CTL制备试剂盒。本发明的制备试剂盒具备用于实施抗原特异性CTL的诱导(第1工序)、抗原呈递细胞的制备(第2工序)、和抗原特异性CTL的增殖(第3工序)所必需的要素。对每个工序、本发明的制备试剂盒所包括的要素进行说明。但是，第1 工序用的要素与第1方面的发明情况相同，因此省略其说明。另外，对于没有特别言及的事项，援引第1内容中对应的记载。(第2工序抗原呈递细胞的制备)在该工序中，将冻结干燥状态的抗原呈递细胞恢复到浸润状态。在本说明书中将该处理也称为“重构”。为了实施该工序，本发明的制备试剂盒至少包括冻结干燥状态的抗原呈递细胞。“冻结干燥状态的抗原呈递细胞”是指利用规定的抗原通过诱导化获得抗原呈递能力的细胞，该细胞处于冻结干燥状态。“冻结干燥状态的抗原呈递细胞”可以通过抗原呈递细胞的制备和接下来的冻结干燥处理来制备。例如，可以利用树突状细胞、外周血单核细胞根据常用方法制备抗原呈递细胞。另外，还可以利用K562细胞等制备抗原呈递细胞。优选地，将规定的表达HLA (例如HLA-AM)、⑶80、⑶83和⑶86的K562细胞作为抗原呈递细胞来使用。抗原呈递细胞的冻结干燥处理优选在细胞悬液中存在海藻糖的条件下进行。 将抗原呈递细胞的制备和冻结干燥处理的具体例表示在后述的实施例的栏。冻结干燥处理的一个例子记载于美国专利5，059，518。还可以按照该处理方法实施冻结干燥处理。应予说明，该文献的内容通过参照编入本说明书。(第3工序CTL的增殖)在该工序中，使用通过第1工序诱导的抗原特异性CTL和通过第2工序制备的抗原呈递细胞使抗原特异性CTL增殖。为了实施该工序，本发明的制备试剂盒至少包括以下的要素(3-1) (3-4)。(3-1)容纳在注入容器中的用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基，(3-2)第1密封型分离容器，具备用于移入诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞的第1 口，排液用的第2 口，用于注入上述用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基的第 3 口，和用于移出分离后的抗原特异性细胞毒性T细胞的第4 口，(3-3)至少2个容纳在注入容器中的增殖用培养基，上述增殖用培养基含有IL-2 或IL-15或这两者，(3-4)密封型培养容器，具备用于移入分离后的抗原特异性细胞毒性T细胞的第 1 口，用于移入制备的抗原呈递细胞的第2 口，用于注入另外制备的血清或血浆的第3 口，与上述增殖用培养基的数量至少是相同数量的、用于注入上述增殖用培养基的第4 口，和用于移出增殖的抗原特异性细胞毒性T细胞的第5 口。(3-1)与第1方面的(3-1)相同，(3-2)与第1方面的(3-3)相同，(3-3)与第1 方面的(3-5)相同，因此省略其说明。(3-4)对应第1方面的(3-6)。唯一的不同点是第2 口用于移入制备的抗原呈递细胞。该第2 口的结构没有特别的限定。例如，只要是与第1 方面的(3-6)中的第2 口相同的结构即可。与第1方面的制备试剂盒同样可以追加各种要素(用于外周血单核细胞的制备的培养基、容器，用于外周血单核细胞的注入的容器，用于血浆的制备的培养基、容器，用于血浆的注入的容器，用于抗原呈递细胞的重构的培养基、容器，用于分离通过第3工序增殖的抗原特异性细胞毒性T细胞的分离容器，用于冻结保存使用该分离容器分离的细胞的保存容器，用于细胞的移入、移出或分注的管等)。使用了本发明的制备试剂盒的、抗原特异性CTL的制备方法(本发明的第4方面) 除了第2工序以外，与使用了本发明的第1方面的制备试剂盒的情况相同。在该方面的第 2工序中，将冻结干燥状态的抗原呈递细胞重构。重构的方法典型的是包括细胞的浸润、清洗(和悬浮)。表示具体例，则如下首先，对冻结干燥状态的抗原呈递细胞添加足量的溶媒(去离子水、蒸馏水、生理盐水等)，暂时放置(浸润工序)。添加培养基后，提供到离心处理(清洗工序)。吸除上清后，再次加入培养基，使细胞悬浮(悬浮工序)。以下，利用实施例对本发明进行更详细的说明。实施例1将本发明的实施例(抗原特异性CTL制备试剂盒)的构成要素(构成品)示于图 1 4。应予说明，图1表示抗原特异性CTL的诱导工序中使用的一套构成要素(抗原特异性CTL诱导用要素)，图2表示抗原呈递细胞的制备工序中使用的一套构成要素(抗原呈递
18细胞制备用要素)，图3和4表示抗原特异性CTL的增殖工序中使用的一套构成要素(抗原特异性CTL增殖用要素)。抗原特异性CTL诱导用要素(图1)的详细内容如下。培养用袋1··1个容纳在Luer锁紧接口注射器中的含抗原肽培养基10 (含有0. 01%人血清白蛋白和 2 μ g/mL CMVpp65 (抗原肽)的 H印es 缓冲 RPMI1640) 5mL · · 1 瓶容纳在Luer锁紧接口注射器中的含IL-2培养基11 (含有0. 01 %人血清白蛋白和 100IU/mL IL-2 的 H印es 缓冲 RPMI1640) IOmL · · 1 瓶容纳在Luer锁紧接口注射器中的含IL-2培养基12(含有100IU/mL IL-2的 ALyS505N ((株)细胞科学研究所))20mL · · 3瓶培养用袋1具备Luer锁紧接口类型的口 2、Luer锁紧接口类型的3分支口(3、4)、 塑料针(参照图5)用的口 5。口 2用于注入另外制备的外周血单核细胞。另外，3分支口 (3,4)是用于含抗原肽培养基10的注入和含IL-2培养基11、12的注入的兼用口。口 5用于移出诱导的抗原特异性CTL。除了口 5以外的所有的口是Luer锁紧接口类型。口 2、3分支口(3、4)在未使用时安装有帽6。符号7所示的是使用后的口(2、3、4)安装的帽，与未使用时安装的帽6颜色不同。在该例子中，帽6为蓝色、帽7为无色透明。未使用时的口 5也安装有帽8。培养用袋1的材质是聚乙烯。抗原呈递细胞制备用要素(图2)的详细内容如下。培养用袋21·· 1个容纳在Luer锁紧接口注射器中的含抗⑶3抗体培养基30 (含有0. 01%人血清白蛋白和 2 μ g/mL 0KT-3 (抗 CD3 抗体)的 H印es 缓冲 RPMI1640) 5mL · · 1 瓶容纳在Luer锁紧接口注射器中的含IL-2培养基31(含有100IU/mL IL_2的H印es 缓冲 RPMI1640) IOmL · · 1 瓶容纳在Luer锁紧接口注射器中的含抗原肽培养基32 (含有0. 01%人血清白蛋白和 2 μ g/mL CMVpp65 (抗原肽)的 H印es 缓冲 RPMI1640) IOmL · · 1 瓶容纳在Luer锁紧接口注射器中的含IL-2培养基33(含有1000IU/mL IL-2的 ALyS505N ((株)细胞科学研究所))20mL · · 4瓶培养用袋21具备Luer锁紧接口类型的口 22、Luer锁紧接口类型的3分支口(23、 24)、塑料针用的口 25。口 22用于注入另外制备的外周血单核细胞。另外，3分支口(23、 24)是用于含抗CD3抗体培养基30的注入、含IL-2培养基(31、33)的注入、和含抗原肽培养基32的注入的兼用口。口 25用于移出制备的抗原呈递细胞。除了口 25以外的所有的口是Luer锁紧接口类型。口 22、3分支口(23、24)在未使用时安装有帽26。符号27所示的是使用后的口(22、23、24)安装的帽，与未使用时安装的帽26颜色不同。在该例子中，帽 26为蓝色、帽27为无色透明。未使用时的口 25也安装有帽28。培养用袋21的材质是聚乙火布ο抗原特异性CTL增殖用要素(图3、4)的详细内容如下。分离用袋(41a、41b)· · 2 个容纳在Luer锁紧接口注射器中的含IL-2培养基50(含有100IU/mL IL_2的 ALyS505N ((株)细胞科学研究所))20mL · · 2瓶
培养用袋51·· 1个容纳在Luer锁紧接口注射器中的增殖用培养基61(含有1000IU/mL IL_2的 ALyS505N ((株)细胞科学研究所))20mL · · 3瓶分离用袋Gla、41b)具备通过管与塑料针连接的口 Gh、42b)、Luer锁紧接口类型的2分支口 G3a、4;3b)、塑料针用的口 G^、44b)。分离用袋的一只41a用于分离诱导的抗原特异性CTL。该分离用袋中，口 4 用于移入诱导的抗原特异性CTL。2分支口 43a用于排液和含IL-2培养基50的注入。口 4 用于处理后的细胞的移出。另一方面，分离用袋41b用于分离制备的抗原呈递细胞。该分离用袋中，口 42b用于移入制备的抗原呈递细胞。2分支口 4 用于排液和含IL-2培养基50的注入。口 44b用于移出处理后的细胞。分离用袋Gla、41b)的材质是聚乙烯。培养用袋51具备Luer锁紧接口类型的口 52、Luer锁紧接口类型的3分支口 53、 通过管与塑料针连接的2分支口 54、塑料针用的口 55。口 52用于注入另外制备的血浆。 另外，3分支口 53用于注入增殖用培养基61。口 M用于移入分离的抗原特异性CTL和抗原呈递细胞。口阳用于移出增殖的抗原特异性CTL。口 52、3分支口 53在未使用时安装有帽56。符号57所示的是使用后的口(52、53)安装的帽，与未使用时安装的帽56颜色不同。在该例子中，帽56为蓝色、帽57为无色透明。未使用时的口 55也安装有帽58。培养用袋51的材质是聚乙烯。使用以上构成的制备试剂盒，通过以下的工序来制备HLA-AM限制性CMV pp65抗原特异性CTL。各工序的详情参照图6 8进行说明。(I)CTL诱导工序(图6)(a)外周血单核细胞(PBMC)的分离使用加入有少量肝素的注射筒，从HLA-AM阳性健康人采取外周血50mL，用 Ficoll密度离心分离法分离PBMCGX IO7)。(b)血浆的采取分离PBMC时，采取血浆，在56°C加热处理20分钟后，以2500rpm离心处理10分钟。(C) RPMI1640培养基中的PBMC的悬浮按照图示，使用袋培养基(含有0.01%人血清白蛋白和10yg/mL庆大霉素(Y > 夕* > )的Ifepes缓冲RPMI1640培养基)清洗PBMC后，采取袋培养基4mL，与PBMC进行悬浮。进而，加入自体血浆ImL (PBMC浓度6 X 106/mL)。(d) CTL 的诱导使用Luer锁紧接口注射器，将悬浮于RPMI1640培养基的PBMC从口 2注入培养用袋1 (参照图1)。接下来，将含抗原肽培养基10通过3分支口 3 (或3分支口 4)的任一口 注入培养用袋1后，将培养用袋1移到37°C、5% CO2的(X)2培养箱内(培养开始)。应予说明，对于使用过一回的口，代替帽6安装帽7，不会再次使用。2天后取出培养用袋1。接着，将含IL-2培养基11从3分支口 3 (或3分支口 4) 的任一口(其中，使用完的口除外)注入培养用袋1。在CO2培养箱内培养5天后，将含IL-2 培养基12从3分支口 3 (或3分支口 4)的任一口(其中，使用完的口除外)注入培养用袋 1。然后，按照培养(3天)、含IL-2培养基12的注入、培养0天)、含IL-2培养基12的注入、和培养0天)的顺序进行。通过以上的操作，用从培养开始至14天(其中，PBMC和血浆的制备所需的时间除外)这样短时间诱导了抗原特异性CTL。应予说明，还可以将PBMC的制备时使用的备用培养基添在制备试剂盒中。对于 Ficoll分离所使用的管、PBMC的清洗所使用的管、PBMC的重悬所使用的管来说也相同。(2)抗原呈递细胞的制备工序(图7)(a) RPMI1640培养基中的PBMC的悬浮在(1)的(a)准备的PBMC (0. 5mL)中添加袋培养基3. 6mL和自体血浆0. 9mL (PBMC 浓度 6X105/mL)。(b)抗原呈递细胞的制备使用Luer锁紧接口注射器，将悬浮于RPMI1640培养基的PBMC从口 22注入培养用袋21 (参照图2、。接下来，将含抗⑶3抗体培养基30通过3分支口 23 (或3分支口 24) 的任一口注入培养用袋21后，将培养用袋21移到37°C、5% CO2的(X)2培养箱内(培养开始)。应予说明，对于使用过一回的口，代替帽沈安装帽27，不会再次使用。2天后取出培养用袋21。接着，将含IL-2培养基31从3分支口 23(或3分支口 24)的任一口(其中，使用完的口除外)注入培养用袋21。在CO2培养箱内培养3天后，将含IL-2培养基33从3分支口 23(或3分支口 24)的任一口(其中，使用完的口除外)注入培养用袋21。然后，按照培养0天)、含IL-2培养基33的注入、培养0天)、含IL-2培养基33的注入、培养O天)、含IL-2培养基33的注入、和培养(1天)的顺序进行。通过以上的操作，用从培养开始至14天这样短时间制备了抗原呈递细胞。应予说明，在该实施例中，将抗原呈递细胞的制备工序(2)与CTL诱导工序(1) 一并进行。因而，用合计14天 (其中，PBMC和血浆的制备所需的时间除外)得到了抗原特异性CTL和抗原呈递细胞这两者ο(c)对抗原呈递细胞的肽脉冲将含抗原肽培养基32从3分支口 23(或3分支口 24)中任一口(其中，使用完的口除外)注入培养用袋21。然后，在室温下孵育1小时。(3)抗原特异性CTL增殖工序(图8)(a)抗原呈递细胞与抗原特异性CTL的分离将与分离用袋41b的口 42b连接的塑料针插入培养用袋21的口 25，培养用袋21 的内容物移到分离用袋41b(参照图3)。关闭口 42b的夹子后(还可以将管用密封器等熔接)，将分离用袋41b供离心处理。以打开2分支口 4 的夹子的状态挤压袋，从2分支口的排液口 4 废弃上清后，将含IL-2培养基50从2分支口的注入口 46b注入分离用袋41b 中。另一方面，将与分离用袋41a的口 4 连接的塑料针插入经过上述工序(1)后的培养用袋1的口 5中，将培养用袋1的内容物移到分离用袋41a后，进行与上述操作相同的操作 (离心处理、排液、含IL-2培养基50的注入)。(b)抗原呈递细胞与抗原特异性CTL的混合、培养将与培养用袋51的口 M连接的塑料针的其中一只59插入分离用袋41a的口 4 中，将分离用袋41a的内容物移到培养用袋51 (参照图3和4)。同样地，将塑料针60插入分离用袋41b的口 44b中，将分离用袋41b的内容物移到培养用袋51中。接下来，使用 Luer锁紧接口注射器，将工序⑴的(b)准备的自体血浆通过口 52注入培养用袋51中后，将培养用袋51移到37°C、5% CO2的(X)2培养箱内(培养开始)。1天后取出培养用袋51。 接着，将增殖用培养基61通过3分支口 53中任一口注入培养用袋51中。应予说明，对于使用过一回的口，代替帽56安装帽57，不会再次使用。在(X)2培养箱内培养3天后，将增殖用培养基61通过3分支口 53中任一口(其中，使用完的口除外)注入培养用袋51中。然后，按照培养O天)、增殖用培养基61的注入、和培养(1天)的顺序进行。通过以上的操作，用从工序⑴和⑵中的培养开始至21天这样短时间得到了抗原特异性CTL。将得到的细胞供流式细胞仪分析。其结果，可知得到了纯度74. 39%的HLA-AM限制性CMV pp65 抗原特异性CTL 3J6X108个(图10)。即，尽管是21天(其中，PBMC和血浆的制备所需的时间除外)这样短时间，但在高纯度的抗原特异性CTL的制备上获得了成功。从别的供体(3名)以同样的方法尝试了抗原特异性CTL的制备(图11 图14)。 对供体1名(HLA-AM阳性)在相同条件下制备了 2次(图11、图12)。只有图14的例子的供体的HLA型(HLA-A2阳性)不同。如图11 14所示，可以再现性良好地制备高纯度的抗原特异性CTL。另外，所制备的抗原特异性CTL显示了高细胞毒性(图11下段右，图 13下段右，图14下段右)。将制备抗原特异性CTL后的操作的一个例子示于图9。首先，利用培养用袋51的口阳将制备袋的内容物(即抗原特异性CTL)分别注入到分离用袋(参照图4)。该操作可以利用例如图5所示的3分支管63来进行。接着，离心分离后，废弃上清(培养液)，注入冻结保存液(8%人血清白蛋白加CP-I (极东制药工业株式会社)等)来悬浮细胞。接下来，将细胞悬液移入冻结保存用的袋，进行冻结保存(例如-130°C -150°C)。使用时进行融解，使用分离用袋(例如以分离用袋41为标准的结构)清洗细胞后，给患者输注细胞。实施例2将本发明的实施例(含有冻结干燥抗原呈递细胞的抗原特异性CTL制备试剂盒) 的构成要素(构成品)示于图15 图18。图15表示抗原特异性CTL的诱导工序中使用的一套构成要素(抗原特异性CTL诱导用要素)，图16表示抗原呈递细胞的制备工序中使用的一套构成要素(抗原呈递细胞制备用要素)，图17和18表示抗原特异性CTL的增殖工序中使用的一套构成要素(抗原特异性CTL增殖用要素)。应予说明，对与实施例1相同的要素标注相同的符号。抗原特异性CTL诱导用要素(图15)的详细内容如下。应予说明，各要素的构成与实施例1的情况相同，因此省略其说明。培养用袋1 · · 1个容纳在Luer锁紧接口注射器中的含抗原肽培养基10(含有0. 01%人血清白蛋白和 2 μ g/mL CMVpp65 (抗原肽)的 H印es 缓冲 RPMI1640) 5mL · · 1 瓶容纳在Luer锁紧接口注射器中的含IL_2培养基11 (含有0. 01 %人血清白蛋白和 100IU/mL IL-2 的 H印es 缓冲 RPMI1640) IOmL · · 1 瓶容纳在Luer锁紧接口注射器中的含IL-2培养基12(含有100IU/mL IL_2的 ALyS505N ((株)细胞科学研究所))20mL · · 3瓶抗原呈递细胞制备用要素(图16)的详细内容如下。容纳在容器(在该例子中是小瓶)中的冻结干燥状态的抗原呈递细胞70 · · 1瓶使用根据目的具有抗原呈递能力的抗原呈递细胞。以下，表示冻结干燥的抗原呈递细胞的制备方法的一个例子。应予说明，作为抗原呈递细胞一般使用树突状细胞，但这里将活性化T细胞作为抗原呈递细胞来制备。(1)外周血单核细胞的分离使用加入有少量肝素的注射筒，从HLA-AM阳性健康人采取外周血。然后，用 Ficoll密度离心分离法分离外周血单核细胞。(2)培养开始用IOmL的RPMI1640清洗3次后，将外周血单核细胞重悬在IOmL的RPMI1640 (含有10%自体血浆和1 μ g/mL 0KT-3)中，使外周血单核细胞为4 X 105/mL，并注入培养袋中。 在(X)2培养箱内以37 °C开始培养。(3) IL-2 的添加2 天后，注入 IOmL 的 RPMI1640 (含有 1 μ g/mL 的 100IU/mL IL-2)，在 CO2 培养箱内(37°C )培养3天。G)ALyS505N(含有 1000IU/mL 的 IL-2)培养基的添加添加ALyS505N(含有1000IU/mL的IL-2)培养基20mL后，每隔3天加入 ALyS505N(含有1000IU/mL的IL-2)培养基(20mL)，并在CO2培养箱内(37 °C )培养9天 (总培养天数14天)。(5)细胞数的测定测定细胞数的结果，得到了 1.53X 108个的细胞。
(6) CD8O、⑶86 的检测检查细胞表面抗原的表达，结果80%的细胞是⑶80阳性，85%的细胞是⑶86阳性 (结果未图示)。(7)表位肽脉冲将上述制备的抗原呈递细胞用PRMI1640重悬，使抗原呈递细胞为2 X 106/mL，然后添加HLA-AM限制性CMV pp65抗原表位肽(QYDPVLAALF)，使其达到10 μ g/mL。在室温下孵育30分钟后，用IOmL的RPMI1640清洗3次。(8)冻结干燥将肽脉冲的细胞重悬于含有10%海藻糖的IS0T0N(注册商标)111中，使细胞达到 2X 106/mL。按照ImL分别注入到冻结干燥用小瓶中后，以图19所示的条件实施冻结干燥。抗原特异性CTL增殖用要素(图17、18)的详细内容如下。应予说明，各要素的构成与实施例1的情况相同，因此省略其说明。分离用袋41a · · 1个容纳在Luer锁紧接口注射器中的含IL-2培养基50(含有100IU/mL IL_2的 ALyS505N ((株)细胞科学研究所))20mL · · 1瓶培养用袋71 · · 1个容纳在Luer锁紧接口注射器中的增殖用培养基61 (含有1000IU/mL的IL_2的 ALyS505N ((株)细胞科学研究所))20mL · · 3瓶培养用袋71具备2个Luer锁紧接口类型的52。一只用于注入另外制备的血浆， 另一只用于注入抗原呈递细胞。另一方面，通过管连接有塑料针的口 72是分离的抗原特异性CTL的移入用口。
在使用该实施例的抗原特异性CTL制备试剂盒时，使用抗原特异性CTL诱导用要素诱导抗原特异性CTL的同时，使用抗原呈递细胞制备用要素来重构抗原呈递细胞。将这样得到的2种细胞在抗原特异性CTL增殖用要素的培养用袋71内进行共培养，得到了目标抗原特异性CTL。再者，抗原呈递细胞的制备(重构)例如如下进行。(1)去离子水的添加在小瓶70中加入ImL的去离子水，在室温下放置5分钟。(2)清洗移到装入有ImL的RPMI 1640(0. 05% HSA)的15mL离心管中，以1200rpm在室温下离心10分钟。吸除上清后，添加ImL的RPMI1640 (5%自体血浆)，使细胞悬浮。产业上的利用可能性作为目标的抗原特异性CTL的制备所需要的时间当然对治疗目的、患者的状态等造成影响，但使用本发明的试剂盒，则利用分离的外周血单核细胞可以用大概20天 2月左右制备治疗所需量的抗原特异性CTL。该发明并不受到上述发明的实施方式和实施例的说明的任何限制。在不超出所要求保护的范围的记载，本领域技术人员能够容易想到的范围的各种变形方式也包含在该发明中。本说明书中明示的论文、公开专利公报和专利公报等内容通过将其所有内容援引来引用。符号说明1培养用袋2 Luer 锁紧接口3、4 3分支Luer锁紧接口5移出用口6、7、8 帽10含抗原肽培养基(5mL)11 含 IL-2 培养基(IOmL)12 含 IL-2 培养基(20mL)21培养用袋22 Luer 锁紧接口23、24 3 分支 Luer 锁紧接口25移出用口26、27、28 帽30含抗CD3抗体培养基(5mL)31 含 IL-2 培养基(IOmL)32含抗原肽培养基(IOmL)33 含 IL-2 培养基(20mL)41a、41b 分离用袋42a,42b 移入用口43a,43b 2 分支 Luer 锁紧接口
24
44a、44b 移出用口50含IL-2培养基51培养用袋61增殖用培养基62移入·移出用管63分注用3分支管70小瓶(含有冻结干燥状态的抗原呈递细胞)
权利要求
1.一种制备试剂盒，其特征在于，是用于抗原特异性细胞毒性T细胞制备方法的制备试剂盒，所述抗原特异性细胞毒性T细胞制备方法包括诱导抗原特异性细胞毒性T细胞的第1工序；制备抗原呈递用活化T细胞的第2工序；和使用通过所述第1工序诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞和通过所述第2工序制备的抗原呈递用活化T细胞，使抗原特异性细胞毒性T细胞增殖的第3工序；作为用于所述第1工序的构成要素，具备(1-1)容纳在注入容器中的含抗原肽培养基，(1-2)至少2个容纳在注入容器中的含IL-2培养基，和(1-3)密封型培养容器，具备用于注入另外制备的外周血单核细胞的第1 口，用于注入所述含抗原肽培养基的第2 口，与所述含IL-2培养基的数量至少是相同数量的、用于注入所述含IL-2培养基的第3 口，和用于移出诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞的第4 口 ； 作为用于所述第2工序的构成要素，具备 (2-1)容纳在注入容器中的含抗CD3抗体培养基， (2-2)至少2个容纳在注入容器中的含IL-2培养基， (2-3)容纳在注入容器中的含抗原肽培养基，和(2-4)密封型培养容器，具备用于注入另外制备的外周血单核细胞的第1 口，用于注入所述含抗CD3抗体培养基的第2 口，与所述含IL-2培养基的数量至少是相同数量的、用于注入所述含IL-2培养基的第3 口，用于注入所述含抗原肽培养基的第4 口，和用于移出制备的抗原呈递用活化T细胞的第5 口 ；作为用于所述第3工序的构成要素，具备(3-1)容纳在注入容器中的用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基， (3-2)容纳在注入容器中的用于分离抗原呈递用活化T细胞的培养基， (3-3)第1密封型分离容器，具备用于移入诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞的第 1 口，排液用的第2 口，用于注入所述用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基的第3 口，和用于移出分离后的抗原特异性细胞毒性T细胞的第4 口，(3-4)第2密封型分离容器，具备用于移入制备的抗原呈递用活化T细胞的第1 口， 排液用的第2 口，用于注入所述用于分离抗原呈递用活化T细胞的培养基的第3 口，和用于移出分离后的抗原呈递用活化T细胞的第4 口，(3-5)至少2个容纳在注入容器中的增殖用培养基，所述增殖用培养基含有IL-2或 IL-15或这两者，和(3-6)密封型培养容器，具备用于移入分离后的抗原特异性细胞毒性T细胞的第1 口，用于移入分离后的抗原呈递细胞的第2 口，用于注入另外制备的血清或血浆的第3 口， 与所述增殖用培养基的数量至少是相同数量的、用于注入所述增殖用培养基的第4 口，和用于移出增殖的抗原特异性细胞毒性T细胞的第5 口。
2.根据权利要求1所述的制备试剂盒，其中，所述(1-2)的含IL-2培养基的数量为3 5。
3.根据权利要求1或2所述的制备试剂盒，其中，所述(2-2)的含IL-2培养基的数量为3 6。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的制备试剂盒，其中，所述(3-1)的用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基和所述(3-2)的用于分离抗原呈递用活化T细胞的培养基是含IL-2培养基。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的制备试剂盒，其中，对于所述(1- 的密封型培养容器的第1 口 第3 口、所述(2-4)的密封型培养容器的第1 口 第4 口、以及所述(3-6) 的密封型培养容器的第3 口和第4 口而言分别具备2种帽，该2种帽包括未使用时安装的帽和使用后安装的帽，所述使用后安装的帽可与未使用时安装的帽辨别开。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的制备试剂盒，其中，所述(1-3)的密封型培养容器的第3 口、所述0-4)的密封型培养容器的第3 口、和所述(3-6)的密封型培养容器的第 4 口分别为分支型口。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的制备试剂盒，其中，所述(1-3)的密封型培养容器、所述(2-4)的密封型培养容器、和所述(3-6)的密封型培养容器分别具备预备用口。
8.根据权利要求1 7中任一项所述的制备试剂盒，其中，还具备容纳在容器中的用于制备外周血单核细胞的培养基。
9.根据权利要求8所述的制备试剂盒，其中，还具备用于制备外周血单核细胞的容器。
10.根据权利要求1 9中任一项所述的制备试剂盒，其中，还具备用于分离通过第3 工序增殖的抗原特异性细胞毒性T细胞的分离容器。
11.根据权利要求10所述的制备试剂盒，其中，还具备用于冻结保存使用所述分离容器分离的细胞的保存容器。
12.—种制备试剂盒，其特征在于，是用于抗原特异性细胞毒性T细胞制备方法的制备试剂，所述抗原特异性细胞毒性T细胞制备方法包括诱导抗原特异性细胞毒性T细胞的第 1工序；制备抗原呈递细胞的第2工序；和使用通过所述第1工序诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞和通过所述第2工序制备的抗原呈递细胞，使抗原特异性细胞毒性T细胞增殖的第3工序；作为用于所述第1工序的构成要素，具备(1-1)容纳在注入容器中的含抗原肽培养基，(1-2)至少2个容纳在注入容器中的含IL-2培养基，和(1-3)密封型培养容器，具备用于注入另外制备的外周血单核细胞的第1 口，用于注入所述含抗原肽培养基的第2 口，与所述含IL-2培养基的数量至少是相同数量的、用于注入所述含IL-2培养基的第3 口，和用于移出诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞的第4 口 ；作为用于所述第2工序的构成要素，具备容纳在容器中的冻结干燥状态的抗原呈递细胞；作为用于所述第3工序的构成要素，具备(3-1)容纳在注入容器中的用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基，(3-2)第1密封型分离容器，具备用于移入诱导的抗原特异性细胞毒性T细胞的第 1 口，排液用的第2 口，用于注入所述用于分离抗原特异性细胞毒性T细胞的培养基的第3 口，和用于移出分离后的抗原特异性细胞毒性T细胞的第4 口，(3-3)至少2个容纳在注入容器中的增殖用培养基，所述增殖用培养基含有IL-2或 IL-15或这两者，和(3-4)密封型培养容器，具备用于移入分离后的抗原特异性细胞毒性T细胞的第1口，用于移入制备的抗原呈递细胞的第2 口，用于注入另外制备的血清或血浆的第3 口，与所述增殖用培养基的数量至少是相同数量的、用于注入所述增殖用培养基的第4 口，和用于移出增殖的抗原特异性细胞毒性T细胞的第5 口。
13. 一种抗原特异性细胞毒性T细胞的制备方法，其特征在于，使用权利要求1 12中任一项所述的制备试剂盒。
全文摘要
本发明的课题是谋求抗原特异性CTL的制备中的操作性、经济性和安全性的进一步的改善。本发明提供用于抗原特异性细胞毒性T细胞制备方法的制备试剂盒，其中，作为诱导抗原特异性细胞毒性T细胞的第1工序用的要素，具备容纳在注入容器的培养基、密封型培养容器等；作为制备抗原呈递用活化T细胞的第2工序用的要素，具备容纳在注入容器的培养基、密封型培养容器等；作为使抗原特异性细胞毒性T细胞增殖的第3工序用的要素，具备容纳在注入容器的培养基、密封型分离用容器、密封型培养容器等。
文档编号C12M3/02GK102203240SQ200980143470
公开日2011年9月28日 申请日期2009年10月29日 优先权日2008年10月31日
发明者小岛势二, 直江知树, 铃木进 申请人:国立大学法人名古屋大学, 株式会社医学生物学研究所, 株式会社淋巴细胞技术