产生l-氨基酸的方法

专利名称：产生l-氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及使用细菌产生L-氨基酸的方法。L-氨基酸在工业上可用作动物饲料添加剂、健康食物成分、氨基酸输液等。
背景技术：
使用微生物通过发酵生产目标物质如L-氨基酸的方法包括使用野生型微生物 (野生型菌株)的方法，使用来源于野生型株的营养缺陷型菌株的方法，使用来源于野生型菌株的耐受多种药物的代谢调节突变体菌株的方法，使用兼具营养缺陷型菌株和代谢调节突变体菌株两者性质的菌株的方法等。近年来，重组DNA技术用于通过发酵产生目标物质。例如，微生物的L-氨基酸生产力可通过增强编码L-氨基酸生物合成酶的表达(专利文献1和2、或通过增强L-氨基酸生物合成系统对碳源的摄入(专利文献幻来提高。同时，公开了在发酵生产碱性氨基酸的过程中利用碳酸根离子和碳酸氢根离子作为碱性氨基酸的反荷阴离子(counter anion)来替代一部分硫酸根离子或氯离子。作为将碳酸根离子和碳酸氢根离子添加至培养基的方法，这些文献描述了控制发酵罐内部压力在发酵过程中为正压，或向培养基供应二氧化碳或含有二氧化碳的混合气体的方法(专利文献4和5)。L-天冬氨酸家族氨基酸如L-赖氨酸的常规氨基酸发酵受L-谷氨酸副产物产生的影响，具体而言，如上所述的发酵生产在高PH的条件下有特别显著的L-谷氨酸副产物生成的问题。因为在许多情况下在L-氨基酸生产工艺中必需在发酵生产之后将L-氨基酸纯化至高纯度，副产物的存在是不期望的，其可招致复杂的纯化工艺和产物纯度降低的问题。迄今为止，作为发现在肠细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)中涉及谷氨酸摄入的蛋白质，已知有GltP、GltS (非专利文献1和2)、GadC (非专利文献3)和GltIJKL0已知在经修饰增强谷氨酸脱羧酶活性的菌株中L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸的生产力通过增强谷氨酸/GABA反向转运蛋白的活性(专利文献6)而得到增强。然而，并无使用其中gltP基因或gltS基因扩增的微生物产生L-氨基酸的报道。现有技术文献专利文献专利文献1 美国专利5，168，056号专利文献2 美国专利5，776，736号专利文献3 美国专利5，906，925号专利文献4 美国专利申请公开2002/0025564号专利文献5 国际专利公开W02006/038695专利文献6 国际专利公开W02008/044453非专利文献非专利文献1 J. Bacteriol.，1992Apr ； 174 (7) :2391-3
非专利文献2 J. Biol. Chem.，1990Dec ；15 ；265 (35) :21704-8非专利文献3 J. Bacteriol.，2006Dec ； 188 03) :8118-2
发明内容
本发明要解决的问题本发明的一个目标是提供属于肠杆菌科(EntercAacteriaceae)，能够在选自 L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和 L-高丝氨酸的氨基酸的生产中减少副产物L-谷氨酸产生的微生物，以及提供通过使用如上所述的可在氨基酸生产中减少副产物L-谷氨酸产生的微生物来生产如上所述的L-氨基酸的方法。解决问题的手段本发明的发明人为实现前述的目标进行了多方研究，结果发现，通过修饰细菌以增加gltp和/或gits的表达，能够减少L-氨基酸的发酵生产中作为副产物产生的L-谷氨酸，从而完成了本发明。因此，本发明提供了下述1. 一种产生L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养属于肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)并具有L-氨基酸产生能力的细菌以在培养基中产生和累积所述 L-氨基酸，并从培养基收集所述L-氨基酸，其中所述细菌已经过修饰从而增加了 gltP基因和/或gltS基因的表达，且所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸。2.如上所述的方法，其中所述gltP基因编码下述㈧或⑶所示的蛋白质(A)具有SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质，(B)具有在SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。3.如上所述的方法，其中所述gltP基因编码下述(Al)或(Bi)所示的蛋白质(Al)具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的蛋白质，(Bi)具有在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。4.如上所述的方法，其中所述gltP基因是下述(a)或(b)所示的DNA (a)具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的DNA，(b)能够与同SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质的DNA。5.如上所述的方法，其中所述gltS基因编码下述(C)或⑶所示的蛋白质(C)具有SEQ ID NO :13所示的氨基酸序列并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质，
(D)具有在SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。6.如上所述的方法，其中所述gltS基因编码下述(Cl)或(Dl)所示的蛋白质(Cl)具有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的蛋白质，(Dl)具有在SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。7.如上所述的方法，其中所述gltS基因是下述(c)或(d)所示的DNA (c)具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的DNA，(d)能够与同SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质的DNA。8.如上所述的方法，其中所述基因的表达是通过增加该基因的拷贝数或通过修饰该基因的表达调控序列而得到增强的。9.如上所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸，且在该细菌中ybjE基因的表达得到增加。10.根据权利要求9的方法，其中所述ybjE基因编码下述(E)或(F)所示的蛋白质(E)具有SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列或SEQ ID NO :6中第17至315号氨基酸的氨基酸序列的蛋白质，(F)具有在SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列或SEQ ID NO :6中第17至315号氨基酸的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白质。11.如上所述的方法，其中所述ybjE基因是下述(e)或(f)所示的DNA (e)具有SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO 5中第49至948号核苷酸的核苷酸序列的DNA，(f)能够与同SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO :5中第49至948号核苷酸的核苷酸序列互补的序列或者与可从这些核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交， 且编码具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白质的DNA。12.如上所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸，将生产培养过程中培养基的PH控制在6. 0至9. 0，并将培养结束时培养基的pH控制在7. 2至9. 0，且保证有一段培养期内培养基中存在20mM或更多的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子，从而使得所述碳酸氢根离子和/或碳酸根离子充当碱性氨基酸的反荷离子。13.如上所述的方法，其中所述细菌是埃希氏菌属Escherichia)细菌。实施本发明的实施方案下文中将详细解释本发明。<1>用于本发明的细菌本发明的细菌是属于肠杆菌科，具有L-氨基酸产生活性，且经修饰使得gltP基因和/或gltS基因的表达增加的细菌。所述L-氨基酸选自下组L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸。如果这些 L-氨基酸是使用微生物通过发酵产生的，在许多情况下产生副产物L-谷氨酸。对于L-谷氨酸副产物的产生而言，只要通过增加gltp基因和/或gits基因表达的修饰，副产物的产生与未修饰的菌株相比有所减少就足够了，但希望减少40%或更多，优选50%或更多，更优选60%或更多。本文中提及的L-氨基酸产生能力意指当在培养基中培养本发明的细菌时，该细菌在培养基或细胞中产生L-氨基酸并累积所述L-氨基酸达到所述L-氨基酸可从所述培养基或细胞被收集的程度的能力。本发明的细菌可为具有产生L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸之一的能力的细菌，或可为具有产生其中两种或三种能力的细菌。具有L-氨基酸产生能力的细菌可为固有地具有L-氨基酸产生活性的细菌，或可为如下所述的经过使用突变方法或DNA重组技术修饰的具有L-氨基酸产生能力的细菌。“基因表达的增加”意指所述基因的转录和/或基因翻译的增加。<1-1>L-氨基酸产生能力的赋予下文中将例示赋予细菌产生选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸和L-高丝氨酸的L-氨基酸的能力的方法，以及可用于本发明的被赋予了产生如上所述的L-氨基酸的能力的细菌。但是，所述细菌并不限于这些，只要使用的是具有产生L-氨基酸的能力的细菌即可。用于本发明的细菌并没有特别限制，只要其为选自属于肠杆菌科如埃希氏 lif 属(Escherichia) > 1 ff lif M (Enterobacter) > S lif M (Pantotea) > 3 W θ 1 lif M (Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏属菌(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonia) 和摩根氏菌属(Morganella)并具有前述L-氨基酸产生能力的细菌即可。具体而言，可以使用那些根据NCBI (美国国立生物技术信息中心，National Center for Biotechnology Information)数据库(http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg ？ mode = Tree&id = 1236&lvl = 3&keep = l&srchmode = l&unlock)中使用的分类法归类为肠杆菌科的细菌。作为用于修饰的肠杆菌科的亲本株，特别理想的是使用埃希氏菌属、肠杆菌属或泛菌属的细菌。尽管用来获取用于本发明的埃希氏菌属细菌的埃希氏菌属细菌亲本株并无特别限制，具体而言可使用描述于Neidhardt等的著作(Backmann B. J.，1996，Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coliK-12, p.2460-2488,表 1,于 F. D. Neidhardt (编)，Escherichia coli andSalmonella Cellular and Molecular Biology/ American Society forMicrobiology Press, Washington, D. C.)中白勺面β 些细菌。其中，优选大肠杆菌。大肠杆菌的具体实例包括来源于原型野生型菌株K12株的大肠杆菌 W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌 MG1655(ATCC 47076)等。这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心(P. O.Box 1549, Manassas, VA 20108，United States of America)获得。即，对每个菌株给出登录号，而这些菌株可通过使用这些登录号(参见httD://V驟.atcc. org/)来定购。菌株的登录号列于美国典型培养物保藏中心的目录中。肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆lil (Enterobacter Eierogenes) ·，胃^iJti歹lJyIlii Ρειη οθειειηειηει β。 一: ] 团肠杆菌的菌株最近基于16S rRNA的核苷酸序列分析等重新归类于成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis 或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。在本发明中，可使用属于肠杆菌属或泛菌属的任意细菌，只要其为归类于肠杆菌科的细菌。当通过遗传工程技术培育Pantoea ananatis 菌株时，可使用 Pantoea ananatis AJ13355 株(FERM BP-6614)、 AJ13356株(FERM BP-6615)、AJ13601株(FERM BP-7207)及其衍生物。这些菌株在分离时被鉴定为成团肠杆菌，并作为成团肠杆菌保藏。然而，如上所述最近基于16S rRNA测序等 ^Sfrfi^l^ Pantoea ananatis,,下文中描述了赋予属于肠杆菌科的细菌产生选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸的L-氨基酸的能力的方法，以及用于增强属于肠杆菌科的细菌产生上述L-氨基酸的能力的方法。为了赋予产生L-氨基酸的能力，可使用常规用于培育棒状杆菌型细菌或埃希氏 MMMM^iTj^ (Amino Acid Fermentation" ,Gakkai ShuppanCenter (Ltd.),% 1版，1986年5月30日出版，pp. 77-100)。此类方法包括通过获得营养缺陷型突变体、L-氨基酸类似物抗性菌株或代谢调节突变体的性质，或通过构建重组菌株使其过表达L-氨基酸生物合成酶的方法。在此，在培育L-氨基酸产生细菌时，可赋予一种或多种上述性质如营养缺陷型、类似物抗性和代谢调节突变。L-氨基酸生物合成酶的表达可单独增强或以两种或更多种的组合来增强。此外，可将赋予如营养缺陷型、类似物抗性或代谢调节突变性质的方法可与生物合成酶的增强相组合。具有产生L-氨基酸的能力的营养缺陷型突变株、L-氨基酸类似物抗性株或代谢调节突变株可通过对亲本或野生型株进行常规诱变如暴露于X射线或UV辐射或用诱变剂如N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍(NTG)和甲磺酸乙酯(EMS)处理，然后从获得的突变株中选择那些呈现营养缺陷型、类似物抗性或代谢调节突变且还具有产生L-氨基酸的能力的菌株来获得。L-赖氨酸产生细菌下文中例示了 L-赖氨酸产生细菌及其构建方法。具有L-赖氨酸产生能力的菌株的实例包括例如L-赖氨酸类似物抗性株和代谢调节突变株。L-赖氨酸类似物的实例包括但不限于，氧代赖氨酸(oxalysine)、赖氨酸氧肟酸 (lysine hydroxamate)、3-(2-氨基乙基)_半胱氨酸(AEC)、Y-甲基赖氨酸、α-氯代己内酰胺(α-chlorocaprolactam)等。可通过对属于埃希氏菌属的细菌施以常规人工诱变处理，来获得对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体菌株。L-赖氨酸产生细菌的实例包括大肠杆菌AJ11442菌株(FERM BP-1543, NRRL B-12185 ；参见特开昭56-18596和美国专利 4，346，170号)、大肠杆菌￥1^611菌株(特开1016710号)等。作为L-赖氨酸产生大肠杆菌，也可以使用WC196菌株(参见国际专利公开W096/17930)。此外，也可通过增加L-赖氨酸生物合成系统酶的活性来构建L-赖氨酸产生细菌。 可通过增加细胞中编码所述酶的基因的拷贝数，或通过修饰表达调控序列，来获得该酶活性的增加。编码L-赖氨酸生物合成系统的酶的基因拷贝数的增加及其表达调控序列的修饰可通过后述那些用于gltP和gits基因的相同方法来获得。编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的实例包括但不限于编码二氨基庚二酸途径
8酶的基因如二氢吡啶二羧酸合酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(IysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶基因(IysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh) (对于所有前述基因参见W096/40934)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)(特开昭 60-87788)、天冬氨酸氨基转移酶基因(aspC)(特公平6-102028)和天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd) (W000/61723)，以及编码氨基己二酸途径酶的基因如高乌头酸水合酶基因(特开 2000-157276A)。此外，所述亲本株可显示涉及能效的基因(cyo)(欧洲专利公开1170376 号)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(PntAB)(美国专利5，830，716号)、编码具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白质的ybjE基因(W02005/073390)、编码谷氨酸脱氢酶的基因(gdhA) (Gene 23:199-209,1983)或其任意组合的表达水平增加。这些基因的缩写示于括号中。在前述基因中，优选ybjE基因。ybjE基因的实例包括大肠杆菌的ybjE基因及其同源物。大肠杆菌ybjE基因的实例包括编码SEQ ID NO 6中氨基酸编号17至315的氨基酸序列的基因，特别是具有SEQ ID NO :5中核苷酸编号49至948的核苷酸序列的基因。在 SEQ ID NO :5中，预计起始密码子为核苷酸编号49至51的核苷酸。尽管SEQ ID NO :5中核苷酸编号1至3的核苷酸构成编码缬氨酸的密码子gtg，其可翻译为Met作为起始密码子，且由ybjE基因编码的蛋白质可为具有SEQ ID NO :6的氨基酸序列的蛋白质(1至315)。 在此情况下，优选使用具有SEQ ID NO :5中核苷酸编号1至948的核苷酸序列的DNA。然而，从这些实例显而易见的是，无论该起始密码子提供了何种氨基酸残基，可用于本发明产生方法的微生物都可通过使用含有SEQ ID NO :1中核苷酸编号49至948的核苷酸序列的 DNA来获得。已知来源于大肠杆菌的野生型二氢吡啶二羧酸合酶受L-赖氨酸的反馈抑制的作用，且已知来源于大肠杆菌的野生型天冬氨酸激酶受L-赖氨酸的阻遏(suppression)和反馈抑制。因此，当使用dapA基因和IysC基因时，这些基因优选为编码不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变酶的基因。编码不受L-赖氨酸反馈抑制的突变体二氢吡啶二羧酸合酶的DNA的实例包括编码具有其中118位的组氨酸残基由酪氨酸残基替代的氨基酸序列的蛋白质的DNA。编码不受L-赖氨酸反馈抑制的突变体天冬氨酸激酶的DNA的实例包括编码具有其中352位的苏氨酸残基、323位的甘氨酸残基和318位的甲硫氨酸残基分别由异亮氨酸、天冬酰胺和异亮氨酸残基替代的氨基酸序列的AKIII的DNA (对于这些突变体，参见美国专利5，661，012和 6，040，160号)。此类突变体DNA可通过使用PCR的定点诱变等来获得。广宿主谱(wide host-range)质粒RSFD80、pCABl和pCABD2已知为含有编码突变体二氢吡啶二羧酸合酶的突变体dapA基因和编码突变体天冬氨酸激酶的突变体IysC基因的质粒(美国专利6，040，160号)。用该质粒转化的大肠杆菌JM109株命名为AJ12396(美国专利6，040，160号)，且该菌株在1993年10月28日以保藏号FERM P-13936保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(the National Institute of Bioscience and Human—Technology， Agency ofIndustrial Science and Technology, Ministry of International Trade and hdustry)(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology, International PatentOrganism Depositary)，且该保藏在 1994 年 11 月 1 日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，保藏号为FERM BP-4859。RSFD80可从AJ12396株通过常规方法获得。此外，L-氨基酸产生细菌中催化从L-氨基酸生物合成途径分支而产生其他化合物的反应的酶的活性可以是降低的，或者该活性可以是缺陷的，或者其负作用于L-氨基酸合成或累积的酶的活性可以是降低的，或者该活性可以是缺陷的。此类涉及L-赖氨酸产生的酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA，ldcC)、苹果酸酶等，且其中这些酶的活性减少或缺失的菌株公开于W095/23864、W096/17930、W02005/010175等。优选的是，编码赖氨酸脱羧酶的cadA和IdcC基因两者表达均降低，以降低或消除赖氨酸脱羧酶活性。这两个基因的表达可通过例如W02006/078039中所述方法来降低。为了减少或消除这些酶的活性，可通过通常的诱变方法或基因重组技术向基因组上所述酶的基因中引入突变，从而使得所述酶的胞内活性减少或消除。这样的突变引入可通过，例如，利用基因重组消除基因组上编码所述酶的基因，或修饰表达调控序列如启动子或Siine-Dalgarno(SD)序列来达成。其还可通过在基因组上编码所述酶的区域中导入形成氨基酸取代的突变(错义突变)、终止密码子(无义突变)或用于添加或缺失一个或两个核苷酸的译码突变，或者部分或完全缺失所述基因来达成(J. Biol. Chem.，272 8611-8617，1997)。还可通过构建编码其中编码区完全或部分缺失的突变酶的基因并用其通过同源重组等替换基因组上的正常基因，或通过将转座子或IS因子引入所述基因来减少或消除酶活性。举例而言，为了通过遗传重组引入降低或消除上述酶活性的突变，使用下述方法。 通过修饰目标基因的部分序列来制备突变基因，使得其不编码能够正常发挥功能的酶，然后可用含有所述突变基因的DNA转化属于肠杆菌科的细菌以导致基因组上的相应基因与所述突变基因发生重组以使所述突变基因替换基因组上的目标基因。此种使用同源重组基因替换的实例包括使用直链DNA的方法如称作Red驱动整合的方法(Datsenko，K. A和 Wanner, B. L.，2000，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 :6640-6645)和利用 Red 驱动整合与来源于λ噬菌体的切出系统组合的方法(Cho，Ε. H.，Gumport, R. I.，Gardner, J. F.，2002， J. Bacteriol.，184 =5200-5203)(参见W02005/010175)、使用含有温度敏感性复制起点的质粒的方法(美国专利6，303，383号，特开平05-007491)等。此外，如上所述此类基于使用同源重组的基因替换的定点诱变还可通过使用无法在宿主中复制的质粒来实施。L-赖氨酸产生细菌的优选实例包括大肠杆菌WC196 Δ cadAAldcC/ PCABD2 (W02006/078039)。该菌株是通过将含有赖氨酸生物合成基因的质粒pCABD2 (美国专利6，040, 160号)引入具有被破坏的编码赖氨酸脱羧酶的cadA和IdcC基因的WC196株来构建的。所述WC196株是从来源于大肠杆菌K-12的W3110株通过用编码突变体天冬氨酸激酶III (其中352位的苏氨酸由异亮氨酸替代)的突变体IysC基因替代W3110株染色体上的野生型IysC基因，从而导致其不受L-赖氨酸的反馈抑制(美国专利5，661，012号)， 并对所得的菌株赋予AEC抗性(美国专利5，827，698号)而培育得到的。所述WC196株命名为大肠杆菌AJ13069，在1994年12月6日以保藏号raRMP-14690保藏于工业技术院生命工学工业技术石if究所(the National Institute ofBioscience and Human—Technology， Agency of Industrial Science andTechnology)(目前为独立行政法人产业技术综合 ^Jffifff^M^.^UM^'ij·, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, InternationalPatent Organism Depositary,地址臼本茨城县筑波市东一丁目1-1，筑波中央第6，305-8566)。之后其于1995年9月四日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，保藏号为FERM BP-5252(美国专利5,827,698号)。WC196 Δ cadA Δ IdcC株本身也是优选的L-赖氨酸产生细菌。WC196 Δ cadAAldcC株被命名为AJ110692，于2008 年10月7日作为国际保藏保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(the National Institute of Bioscience and Human—Technology， Agency of Industrial Science and Technology)(目前为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology, International Patent Organism D印ositary，地址日本茨城县筑波市东一丁目1-1，筑波中央第6，305-8566)，保藏号 FERM BP-11027。质粒pCABD2含有来源于大肠杆菌的编码具有使其不受L-赖氨酸反馈抑制的突变的二氢吡啶二羧酸合酶(DDPQ的突变体dapA基因，来源于大肠杆菌的编码具有使其不受L-赖氨酸反馈抑制的突变的天冬氨酸激酶III的突变体IysC基因，来源于大肠杆菌的编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因，以及来源于乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因。L-苏氨酸产生细菌用于本发明的L-苏氨酸产生细菌的优选实例包括属于肠杆菌科，其中一种或多种L-苏氨酸生物合成系统酶的活性增强的细菌。编码L-苏氨酸生物合成酶的基因的实例包括天冬氨酸激酶III基因(IysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、由thr操纵子编码的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨酸合酶基因(thrC)。可引入这些基因中的两种或更多种。可将编码L-苏氨酸生物合成酶的基因引入苏氨酸分解降低的肠杆菌科细菌。苏氨酸分解降低的埃希氏菌属细菌的实例包括例如苏氨酸脱氢酶活性缺陷的TDH6株(特开2001-346578)等。L-苏氨酸生物合成酶的酶活性受其终产物L-苏氨酸的抑制。因此，对于L-苏氨酸产生细菌的构建而言，理想的是修饰L-苏氨酸生物合成酶的基因使得所述酶在L-苏氨酸生产株中不受L-苏氨酸的反馈抑制。前述thrA、thrB和thrC基因构成了苏氨酸操纵子，其形成弱化子结构。苏氨酸操纵子的表达受培养基中异亮氨酸和苏氨酸的抑制，且还受弱化作用的阻遏。因此，可通过去除弱化作用区域或弱化子中的前导序列来修饰所述苏氨酸操纵子(参见 Lynn, S. P.，Burton, W. S.，Donohue, T. J.，Gould, R. Μ.，Gumport, R. L 禾口 Gardner, J. F.，J. Mol.Biol. 194 :59-69(1987) ；W002/26993 ；W02005/049808)。苏氨酸操纵子的天然启动子存在于苏氨酸操纵子上游，且可用非天然启动子替代 (参见W098/04715))，或可构建经修饰使得苏氨酸生物合成基因的表达受阻抑物和λ噬菌体启动子调控的苏氨酸操纵子(参见欧洲专利0593792号)。此外，为了修饰埃希氏菌属细菌从而使其不受L-苏氨酸反馈抑制，可选择耐受α-氨基-β-羟基异缬氨酸(AHV)的菌株。优选的是，经修饰不受L-苏氨酸反馈抑制的苏氨酸操纵子的拷贝数得到增加，或其表达通过将该苏氨酸操纵子连接于强启动子而得到增加。除了使用质粒扩增之外，拷贝数还可通过使用转座子、Mu噬菌体等将所述苏氨酸操纵子转移至基因组来增加。作为天冬氨酸激酶III基因(IysC)，理想的是使用经修饰而使得所述酶不受L-赖氨酸反馈抑制的基因。此种经修饰使得所述酶不受反馈抑制的IysC基因可通过美国专利5，932，453号中所述的方法来获得。除了增加L-苏氨酸生物合成基因的表达之外，还可优选增加参与糖酵解途径、 TCA循环或呼吸链的基因、调节这些基因表达的基因或参与糖摄取的基因的表达。此类对 L-苏氨酸产生有效的基因的实例包括编码转氢酶(pntAB，欧洲专利733712号)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(P印C，W095/06114)、磷酸烯醇式丙酮酸合酶(pps，欧洲专利877090号) 的基因，以及编码来自棒状杆菌或芽孢杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶的基因(W099/18228，欧洲专利公开1092776号)。L-苏氨酸产生细菌还可优选地通过增强赋予宿主细菌L-苏氨酸抗性的基因和 /或赋予宿主细菌L-高丝氨酸抗性的基因之表达，或通过赋予宿主细菌L-苏氨酸抗性或 L-高丝氨酸抗性来获得。赋予上述抗性的基因的实例包括rhtA基因(Res. Microbiol. 154 123-135 (2003))、rhtB基因(欧洲专利公开0994190号)、rhtC基因(欧洲专利公开 1013765号)、yfiK基因和yeaS基因(欧洲专利公开1016710号)。赋予宿主细菌L-苏氨酸抗性的示例性方法包括描述于欧洲专利公开0994190号或W090/04636中的那些。大肠杆菌VKPM B-3996 (美国专利5，175，107号)可作为L-苏氨酸产生细菌的示例。菌株VKPM B-3996在1987年4月7日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM)), GNII Genetika(Russia, 117545 Moscow 1, Dorozhny proezd，1)，保藏号为 VKPM B-3996 所述 VKPM B-3996 菌株含有质粒PVIC40 (W090/04636)，其是通过将苏氨酸生物合成基因(苏氨酸操纵子，thrABC) 插入含有链霉素抗性标记的广宿主谱的质粒载体PAYC32中(Chistorerdov，Α. Y.和 Tsygankov, Y. D.，Plasmid，16，161-167 (1986))而获得的。在 pVIC40 中，由苏氨酸操纵子中thrA基因编码的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I不受L-苏氨酸的反馈抑制。大肠杆菌VKPM B-5318 (参见欧洲专利0593792号)也可作为优选的L-苏氨酸产生细菌的示例。VKPM B-5318菌株于1990年5月3日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM)GNII Genetika)，保藏号为VKPM B-5318。VKPM B-5318菌株对于L-异亮氨酸而言是原养型，并携带如下所述构建的重组质粒DNA 在其固有转录调节区域即弱化子区中有缺陷的苏氨酸操纵子(即苏氨酸生物合成基因)被置于源自λ噬菌体的温度敏感性Ci阻抑子、ra启动子和编码Cro蛋白N-端的基因之下游，且所述苏氨酸生物合成基因的表达受到所述源自λ 噬菌体的阻抑子和启动子的调节。L-高丝氨酸产生细菌属于埃希氏菌属的L-高丝氨酸产生细菌的实例包括NZlO (thrB)株，其为来源于已知株 C600 (thrB、IeuB,参见 Appleyard R. K.，Genetics, 39，440-452，1954)的 Leu+ 回复体。也优选使用经编码天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因转化的NZlO转化株。如果细菌rhtB基因的拷贝数增加，则细菌变为对L-高丝氨酸耐受，且其对L-高丝氨酸、L-苏氨酸你、L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生产力提高(欧洲专利公开994190A2号)。此外，如果细菌rthC基因的拷贝数增加，则细菌变为对L-高丝氨酸和 L-苏氨酸耐受，且其对L-高丝氨酸、L-苏氨酸和L-亮氨酸的生产力提高(欧洲专利公开 1013765A1 号)。此外，还可使用大肠杆菌44菌株(以保藏号VKPM B-2175保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心)。L-甲硫氨酸产生细菌属于埃希氏菌属的L-甲硫氨酸产生细菌的实例包括菌株如大肠杆菌 AJl1539(NRRL B-12399)、AJl1540(NRRL B-12400)、AJl1541(NRRLB-12401)、AJl1542(NRRL B-12402、GB 2075055)、218 (VKPM B-8125，欧洲专利 1239041 号)等。L-天冬氨酸产生细菌属于埃希氏菌属的L-天冬氨酸产生细菌的实例包括其中从延胡索酸生成L-天冬氨酸的天冬氨酸酶活性增强的大肠杆菌菌株(特开昭38-6588)。L-丙氨酸产生细菌L-丙氨酸通过天冬氨酸的β-脱羧产生。因此，属于埃希氏菌属的L-丙氨酸产生细菌的实例包括其中天冬氨酸脱羧酶增强的大肠杆菌菌株(特开平2力似690)。L-异亮氨酸产生细菌用于衍生L-异亮氨酸产生细菌的亲本株的实例包括但不限于耐受6-二甲基氨基嘌呤的突变体(特开平5-304969)，耐受异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸 (thiaisoleucine)和异亮氨酸氧厢酸(isoleucine hydroxamate)的突变体,和另外还耐受DL-乙硫氨酸(ethionine)和/或精氨酸氧肟酸(arginine hydroxamate)的突变体(特开平5-130882)。此外还使用经编码参与L-乙硫氨酸生物合成的蛋白质如苏氨酸脱胺酶和乙酰羟酸合酶的基因转化的重组株作为亲本株(特开平2-458，FR 0356739和美国专利 5，998，178 号)。L-天冬酰胺产生细菌天冬酰胺通过将氨基基团转移至天冬氨酸来产生(Boehlein，S. K.，Richards, N.G.J.，& Schuster, S. Μ. (1994a), J. Biol. Chem.，269，7450-7457)。因此，属于埃希氏菌属的L-天冬酰胺产生细菌的实例包括其中天冬酰胺合成酶增强的产生L-天冬氨酸的大肠杆菌。本发明的细菌可以通过下述方式获得如上所述地修饰此类具有产生选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸的L-氨基酸的能力的细菌从而使得其gltP基因和/或gltS基因表达增加。或者， 本发明的细菌还可通过赋予经修饰而增加了 gltP基因和/或gltS基因表达的细菌以产生该L-氨基酸的能力来获得。“经修饰而增加了 gltP基因和/或gits基因的表达”的状态对应于与未修饰的菌株如野生型或亲本株相比每个细胞由gltP基因和/或gits基因编码的分子数增加或每个分子由这些基因编码的GltP蛋白或GltS蛋白的活性提高的状态。优选细菌经修饰从而使得每个细胞的GltP蛋白或GltS蛋白的活性增加至未修饰菌株活性的150%或更多，更优选 200%或更多，仍更优选300%或更多。充当上述比较的参照的未修饰菌株，如属于肠杆菌科的微生物的野生型株的实例包括例如大肠杆菌MG1655株(ATCC 47076)、W3110株(ATCC 27325) ,Pantoea ananatis AJ13335 ^ (FERM BP-6614)等。GltP 和 GltS 蛋白的活性是指负责将L-谷氨酸从细胞外摄入细菌细胞的活性，并在本说明书中称作“L-谷氨酸转运蛋白活性”。L-谷氨酸转运蛋白活性可通过将L-谷氨酸摄入本发明微生物的速度与相应的未修饰菌株的L-谷氨酸摄入速度相比较来确证。L-谷氨酸摄入的速度可通过例如将活细胞与用RI标记一定时间的L-谷氨酸反应，并检测细胞中的放射性来测量(Wallace』；Yang, YJ ；Hong, JS ；Lum, D, J. Bacteriol.，1990 Jun ；172 (6) :3214-3220)。gltP基因和/或gits基因的表达与未修饰株如亲本或野生型株的表达相比的增加，可通过将所述基因的mRNA量与野生型或未修饰株的mRNA量相比较来确证。用于确证表达量的方法的实例包括Northern杂交和逆转录PCR (RT-PCR，Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, USA, 2001)。表达可增力口至任何水平，只要所述水平与未修饰株的水平相比增加即可，例如，期望与例如未修饰株的水平相比增加至不少于1. 5倍，更优选不少于2倍，进一步优选不少于3倍。此外，由gltP基因和/或 gltS基因编码的蛋白质活性的增强也可基于靶蛋白量与未修饰株中的靶蛋白量相比的增加来确证，且可通过例如使用抗体的Western印迹来对其进行检测(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA,2001)。本发明的gltP和gits基因意指属于肠杆菌科的微生物的gltP和gits基因或其同源物。作为大肠杆菌的gltp基因，可以以编码具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列的基因 (SEQ ID NO 1)作为示例(b4077，GenBank 登录号 NP_418501. [gi :16131903])。作为大肠杆菌的gltS基因，可以以编码具有SEQ ID NO :4的氨基酸序列的基因(SEQ ID NO :3))作为示例(b3653，GenBank 登录号 NP_418110. [gi :16131524])。gltP或gltS基因的同源物意指这样的基因其来源于另一种微生物，但与埃希氏菌属细菌的gltP基因或gits基因显示高度结构相似性，且当被引入宿主时，编码具有在产生选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸的L-氨基酸的L-氨基酸时减少L-谷氨酸副产物产生量的活性以及将谷氨酸摄入细胞的活性的蛋白质。gltP或gltS基因的同源物的实例包括例如那些在GenBank 登记的基因，包括来自志贺氏菌属和肠杆菌属细菌的基因。此外，gltP基因和/或gltS基因可以是基于与上文例示的基因的同源性从链霉菌属(Sti^ptomyces)细菌如天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)或从乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus) 等属的乳酸细菌克隆到的基因。可使用任何显示与埃希氏菌属细菌的gltP基因和/或gits 基因的高同源性的基因，即使该基因可能被给予不同的基因名称。gltP基因和/或gits基因同源物包括例如能够使用合成寡核苷酸SEQ ID NO 8和9，或SEQ ID NO 10和11克隆的基因。此外，作为gltP和/或gltS基因同源物，显示高同源性的基因可从已知数据库基于前述序列信息来获得。氨基酸序列和核苷酸序列的同源性可通过使用例如Karlin 和 Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90，5873 (1993))的算法 BLAST 或 FASTA (Methods Enzymo 1.，183，63 (1990))来确定。已基于该算法BLAST开发了称为BLASTN和BLASTX的程序(参见 www, ncbi. nlm. nih. gov)。在本说明书中，术语“同源性”也可用于指“同一性”。与大肠杆菌gltP或gltS基因显示高度同源性的同源物与其同源度、细菌名称和基因序列数据库中的登录号一同如下所述
权利要求
1.一种产生L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养属于肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)并具有L-氨基酸产生能力的细菌以在培养基中产生和累积所述 L-氨基酸，并从培养基收集所述L-氨基酸，其中所述细菌已经过修饰从而增加了 gltP基因和/或gltS基因的表达，且所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸。
2.根据权利要求1的方法，其中所述gltP基因编码下述(A)或(B)所示的蛋白质(A)具有SEQID NO :12所示的氨基酸序列并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质，(B)具有在SEQID NO :12所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。
3.根据权利要求2的方法，其中所述gltP基因编码下述(Al)或(Bi)所示的蛋白质(Al)具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白质，(Bi)具有在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述gltP基因是下述(a)或(b)所示的 DNA (a)具有SEQID NO 1所示的核苷酸序列的DNA，(b)能够与同SEQID NO :1所示的核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质的DNA。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述gltS基因编码下述(C)或(D)所示的蛋白质(C)具有SEQID NO :13所示的氨基酸序列并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质，(D)具有在SEQID NO :13所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。
6.根据权利要求5的方法，其中所述gltS基因编码下述(Cl)或(Dl)所示的蛋白质(Cl)具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的蛋白质，(Dl)具有在SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述gltS基因是下述(c)或(d)所示的 DNA (c)具有SEQID NO 3所示的核苷酸序列的DNA，(d)能够与同SEQID NO :3所示的核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质的DNA。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述基因的表达是通过增加该基因的拷贝数或通过修饰该基因的表达调控序列而得到增强的。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸，且在该细菌中ybjE基因的表达得到增加。
10.根据权利要求9的方法，其中所述ybjE基因编码下述(E)或(F)所示的蛋白质(E)具有SEQID NO 6所示的氨基酸序列或SEQ ID NO 6中第17至315号氨基酸的氨基酸序列的蛋白质，(F)具有在SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列或SEQ ID NO 6中第17至315号氨基酸的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白质。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述ybjE基因是下述(e)或(f)所示的DNA(e)具有SEQID NO 5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO 5中第49至948号核苷酸的核苷酸序列的DNA，(f)能够与同SEQID NO 5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO 5中第49至948号核苷酸的核苷酸序列互补的序列或者与可从这些核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白质的DNA。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸，将生产培养过程中培养基的PH控制在6. 0至9. 0，并将培养结束时培养基的pH控制在7. 2至 9. 0，且保证有一段培养期内培养基中存在20mM或更多的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子， 从而使得所述碳酸氢根离子和/或碳酸根离子充当碱性氨基酸的反荷离子。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述细菌是埃希氏菌属 (Escherichia)细菌。
全文摘要
将属于肠杆菌科，并具有产生L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸的能力，且经修饰而增加了使得gltP基因和/或gltS基因的表达的细菌在培养基中培养，以在培养基或细胞中产生和累积所述L-氨基酸。
文档编号C12R1/185GK102227504SQ200980147429
公开日2011年10月26日 申请日期2009年11月26日 优先权日2008年11月27日
发明者竹下亮, 若狭由织 申请人:味之素株式会社