具有二氧化硅酶活性的酶的用途的制作方法

专利名称：：具有二氧化硅酶活性的酶的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有二氧化硅酶(silicase)活性的多肽用于修饰或合成二氧化硅、硅氧烷(silicone)或其他硅(IV)化合物的用途，及其技术用途。
背景技术：
：在氧之后，硅为地壳中最为丰富的元素，且其对于多种植物、动物和微生物系统中的生长和生物学功能而言是必需的(Schroder,H.C.；Krasko,A.；LePennec,G.；Adell,T.；ffiens,M.；Hassanein,H.；Miiller,I.M.；Milller,W.Ε.G.,ProgressinMolecularandSubcellularBiology，2003，33，249-268)。硅见于游离硅酸盐(Si04x_，硅酸的盐)和结合二氧化硅(SiO2的水合聚合物)的形式。二氧化硅在自然界通常作为砂岩(sandstone),硅砂(silicasand)或石英岩(quartzite)存在，其中其为以三种不同晶体形式存在的水合聚合物石英(quartz)、鳞石英(tridymite)和方石英(cristobalite)。其中，仅石英是常见的。液体二氧化硅并不容易结晶化，而是固化为玻璃(Douglas，B.Ε.；Ho,S.-Μ.Crystalstructuresofsilicaandmetalsilicates.InStructureandChemistryofCrystallineSolids,Springer:NewYork，2006，233)。二氧化硅是制造陶瓷和硅酸盐玻璃的起始材料。此外，其在许多种应用如颜料、塑料、橡胶、粘合剂、油灰(putty)和封闭剂(sealant)中用作填充物。此外，多种宝石如紫水晶(amethyst)、玛瑙(agate)、碧玉(jasper)和蛋白石(opal)是二氧化硅的聚集物(buildup)。硅酸盐目前为最大且最复杂类型的矿物。大约所有矿物的30%是硅酸盐，且一些地质学家估计地壳的90%由硅酸盐构成。硅酸盐矿物的实例为长石(feldspar)、石棉(asbestos)、粘土、角闪石(hornblende)和沸石。除此之外，新硅酸盐(neosilicates)(也称作正硅酸盐)表现为大量的宝石如橄榄石(olivine)、黄晶(topaz)和锆石(zircon)(Douglas，B.E；Ho,S.-Μ.Crystalstructuresofsilicaandmetalsilicates.InStructureandChemistryofCrystallineSolids，Springer:NewYork，2006，233)。生物硅化在温和条件下(例如中性pH和低温)在全球大规模发生。事实上，微小的浮游藻(硅藻)控制海洋二氧化硅循环，且这些单细胞植物每年加工数十亿吨的颗粒二氧化硅(Brandstadt，K.F.Curr.Opin.Biotechnol.2005，16，393及其中的参考文献)。除了硅藻之外，还有海绵、软体动物和高等植物实施生物硅化(aiimizu，K.；Cha,J.N.；Stucky,G.D.；Morse,D.Ε.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998，95，6234及其中的参考文献)。二氧化硅的合成(生物硅化)由所谓硅蛋白(silicatein)催化(Shimizu等ftx)C·Natl.Acad.Sci.USA,1998,95,6234.，Zhou,Y.；Shimizu,K.；Cha,J.N.；Stucky,G.D.；Morse,D.Ε.,Angew.Chem.Int.Ed.,1999,38,780.Alber,B.；Ferry,J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1994，91，6909)，且如在自然界司空见惯，具有逆活性(二氧化硅酶活性，即将二氧化硅水解为硅酸)的酶已报道于海生海绵(例如寄居蟹皮海绵(Suberitesdomuncula),而释放的硅酸由其他生物利用制造二氧化硅骨骼(Cha，J.N.；Shimizu,K.；Zhou,Y.；Christiansen,S.C.；ChmeIka,B.F.；Stucky,G.D.；Morse,D.Ε.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999，96，361)。还报道二氧化硅酶活性作为α-碳酸酐酶的另外活性存在(Cha等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999,96,361),Schroder等，ProgressinMolecularandSubcellularBiology，2003，33，249-268，和Muller等，美国专利公开2007/0218044号。
发明内容本发明涉及具有二氧化硅酶活性的多肽用于修饰或合成二氧化硅、硅氧烷和其他硅(IV)化合物的用途。本发明还涉及具有二氧化硅酶活性的多肽用于修饰玻璃、沙、石棉、计算机芯片、玻璃绒(glasswool)、玻璃纤维(fiberglass)、光纤(例如，所述纤维的模拟(fictionalization))、硅氧烷、用于从油砂分离沙(例如，通过增加沙的溶解)、用于去除石棉和用于喷砂(sandblasting)的用途。本发明的一个方面涉及用于修饰二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的方法，包括用具有二氧化硅酶活性的Y-碳酸酐酶处理二氧化硅、硅氧烷或硅化合物。本发明的另一个方面涉及用于合成二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的方法，包括用具有二氧化硅酶活性的Y-碳酸酐酶处理二氧化硅、硅氧烷或硅化合物的前体，其中所述处理导致二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的合成。本发明还涉及用于修饰二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的方法，包括用从嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcinathermophila)获得的二氧化硅酶或与嗜热甲烷八叠球菌二氧化硅酶(SEQIDNO1)具有高度氨基酸序列同一性的二氧化硅酶活性来处理二氧化硅、硅氧烷或硅化合物。本发明还提供了用于合成二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的方法，包括用从嗜热甲烷八叠球菌获得的二氧化硅酶或与嗜热甲烷八叠球菌二氧化硅酶(SEQIDN0:1)具有一定程度氨基酸序列同一性的二氧化硅酶活性来处理二氧化硅、硅氧烷或硅化合物的前体，其中所述处理导致二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的合成。本发明的另一个方面涉及一种用于修饰二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的方法，包括用从Bacillusplakortidis、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)或Bacillushaludurons获得的二氧化硅酶或与Bacillusplakortidis二氧化硅酶(SEQIDN0:11或12)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)二氧化硅酶(SEQIDNO:9或10)或Bacillushaludurons(SEQIDNO:8)具有高度氨基酸序列同一性的二氧化硅酶活性来处理二氧化硅、硅氧烷或硅化合物。本发明的仍另一个方面提供了用于合成二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的方法，包括用从Bacillusplakortidis、克劳氏芽孢杆菌或Bacillushaludurons获得的二氧化硅酶或与Bacillusplakortidis二氧化硅酶(SEQIDNO11或12)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)二氧化硅酶(SEQIDNO:9或10)或Bacillushaludurons(SEQIDNO8)具有高度氨基酸序列同一性的二氧化硅酶活性来处理二氧化硅、硅氧烷或硅化合物的前体，其中所述处理导致二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的合成。发明详述如本文中使用的“二氧化硅酶”或“具有二氧化硅酶活性的”多肽为催化二氧化硅和硅酸之间相互转化的酶。二氧化硅酶可水解无定形和晶体二氧化硅以生成游离的硅酸，且由于该反应的可逆性，二氧化硅酶还可合成二氧化硅(作为硅酸、硅酸盐的缩合产物)、硅氧烷和其他硅(IV)化合物。二氧化硅酶活性可根据实施例III中所述的步骤确定。在一些实施方案中，具有二氧化硅酶活性的多肽同样包括具有“碳酸酐酶”活性的多肽。碳酸酐酶(也称为碳酸脱水酶)催化二氧化碳和碳酸氢根之间的相互转化。碳酸酐酶通常根据酶分类归类(EC4.2.1.1)。碳酸酐酶活性可根据实施例II中所述的步骤确定。碳酸酐酶广泛分布于自然界所有的生物域中(Smith，K.和i^erry，J.J.Bacteriol.，1999，181，6247；Smith,K.和Ferry，J.FEMSMicrobiol.Rev.，2000，24，335)。这些酶具有三种不同类型α-类型、β-类型和Y-类型(Hewett-Emmett，D.和Tashian,R.Mol.Phylogenet.Evol.，1996，5，50)。最近提出了第四种类型(δ类型)(So等，J.Bacteriol.，2004，186，623)。这些类型是从独立来源(细菌、古菌、真核生物)演化的，具有不同的蛋白序列组成、结构和功能性。α-碳酸酐酶丰富存在于所有哺乳动物组织中，在此其促进(X)2的去除。在原核生物中，已鉴定了编码所有三种碳酸酐酶类型的基因，其中β-和Y-类型占主导地位。本发明人发现Y-碳酸酐酶酶家族中二氧化硅酶活性的存在，且该酶家族可用于修饰或合成二氧化硅、硅氧烷和其他硅(IV)化合物。具有二氧化硅酶活性的Y-碳酸酐酶的实例包括从嗜热甲烷八叠球菌TM-I株获得的Y-碳酸酐酶(Alber和i^erry，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:6909-6913；Alber和Ferry，1996，J.Bacteriol.178:3270-3274)。来自嗜热甲烷八叠球菌的Y-碳酸酐酶的氨基酸序列示于SEQIDNO:1，且其还描述于W02008/095057。来自嗜热甲烷八叠球菌的Y_碳酸酐酶的X射线结构也已经报道(Strop等，J.Biol.Chem，2001，276，10299)。如本文中使用的术语“获得的”意指该酶可为从天然产生该酶作为天然酶的生物分离的。然而，“获得的”酶可在宿主生物中通过重组重新产生。可从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得具有二氧化硅酶活性的Y-碳酸酐酶。其他来源的已知的Y-碳酸酐酶的实例包括来自Pelobactercarbinolicus(SEQIDNO2)>Syntrophusaciditrophicus(SEQIDNO:4)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(SEQIDNO:5)、噬乙酸甲烷八叠球^(Methanosarcinaacetivorans)(SEQIDNO6)>EK(Methanosarcinabarkeri)(SEQIDNO:5)和梅氏甲烧八叠球菌(Methanosarcinamazei)(SEQIDNO:7)的碳酸酐酶。二氧化硅酶活性的存在可通过实施例III中所述的步骤确证。可从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物通过使用核酸探针例如如W02008/095067所述鉴定和获得具有二氧化硅酶活性的Y-碳酸酐酶。用于从自然生境分离微生物的技术在本领域是公知的。然后所述多核苷酸可通过类似地筛选另一个微生物的基因组或cDNA文库或通过基因组测序来获得。一旦用探针检测出编码多肽的多核苷酸序列，可通过利用对于本领域普通技术人员公知的技术分离或克隆所述多核苷酸。二氧化硅酶活性的存在可通过实施例III中所述的步骤确证。其他用于本发明的二氧化硅酶包括具有二氧化硅酶活性的多肽，其与嗜热甲烷八叠球菌二氧化硅酶(SEQIDNO:1)具有至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%，以及甚至最优选至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度。如本文中使用的，两个氨基酸序列之间的“同一性”程度是使用如执行于EMBOSS程序包中的Needle程序(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，TrendsinGenetics16:276-277)(优选3.0.0或更新版本)的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)确定的。使用的参数为缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，以及EBL0SUM62(EMBOSS版本的BL0SUM62)取代矩阵(或在另一个程序中相应的用于确定％同一性的参数)。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性，并如下述进行计算(相同的残基xlOO)/(比对长度-比对中缺口总数)。适用于本发明的二氧化硅酶包括与嗜热甲烷八叠球菌二氧化硅酶(SEQIDN0:1)基本上同源的多肽。“基本上同源的多肽”可具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些变化优选对性质较不重要，其为保守氨基酸取代和其他不显著影响所述蛋白或多肽三维折叠或活性的取代；小缺失，通常一至约30个氨基酸；氨基或羧基端延伸，如氨基端甲硫氨酸残基，最多约20-25个残基的小接头，或促进纯化的小延伸(亲和标记)，如多组氨酸区(poly-histidinetract)，或蛋白A(Nilsson等，1985，EMBOJ.41075;Nilsson等，1991,MethodsEnzymol.198:3。，Ford·，1991，ProteinExpressionandPurification2:95_107。适用于本发明的二氧化硅酶还包括具有二氧化硅酶活性，并与嗜热甲烷八叠球菌二氧化硅酶(SEQIDNO:)具有多至三十个氨基酸、多至二十九个氨基酸、多至二十八个氨基酸、多至二十七个氨基酸、多至二十六个氨基酸、多至二十五个氨基酸、多至二十四个氨基酸、多至二十三个氨基酸、多至二十二个氨基酸、多至二十一个氨基酸、多至二十个氨基酸、多至十九个氨基酸、多至十八个氨基酸、多至十七个氨基酸、多至十六个氨基酸、多至十五个氨基酸、多至十四个氨基酸、多至十三个氨基酸、多至十二个氨基酸、多至十一个氨基酸、多至十个氨基酸、多至九个氨基酸、多至八个氨基酸、多至七个氨基酸、多至六个氨基酸、多至五个氨基酸、多至四个氨基酸、多至三个氨基酸、多至两个氨基酸或一个氨基酸差异的多肽。保守取代的实例为碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)组之内的。通常不改变具体活性的氨基酸取代在本领域是已知的，并例如由H.Neuratt^PR.L.Hill,1979描述于TheProteins,AcademicPress,NewYorkο最常出现的交换为Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。有限数量的非保守氨基酸，并非由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可用于取代氨基酸残基，如六氢吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸以及3，3_二甲基脯氨酸。嗜热甲烷八叠球菌二氧化硅酶(SEQIDNO:1)二氧化硅酶中的必需氨基酸还可根据本领域已知步骤如定点诱变或丙氨酸扫描诱变来鉴定(Cunningham和ffells，1989，Science244:1081-1085)。在后者技术中，在分子的每一个残基引入单个丙氨酸突变，并测试所得的突变体分子的生物学活性(即二氧化硅酶活性)以鉴定对于所述分子活性至关重要的氨基酸。亦参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶或其他生物相互作用的活性位点也可通过其结构的物理分析来确定，如通过下述技术如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如deVos等，1992，Science255:306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLett.309:59-64.必需氨基酸的身份(identity)还可由与本发明多肽相关的多肽的同一性分析推出。可进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并使用已知的诱变、重组和/或改组方法来测试，然后进行相关的筛选步骤，如Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science241:53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413;或WO95/2沈25所公开的那些。其他可用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等，1991,Biochem.30:10832-10837；美国专利5，223，409号；WO92/06204)和区域定向(region-directed)的诱变(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7127)。诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、经诱变的多肽(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。可从宿主回收编码活性多肽的经诱变的DNA分子，并使用本领域标准方法快速测序。这些方法允许快速确定目标多肽中个别氨基酸残基的重要性，并可应用于未知结构的多肽。用于本发明的二氧化硅酶还包括嗜热甲烷八叠球菌二氧化硅酶(SEQIDNO:1)具有二氧化硅酶活性的片段。嗜热甲烷八叠球菌二氧化硅酶(SEQIDNO=I)的片段是从该氨基酸序列氨基和/或羧基端缺失一个或多个氨基酸的多肽。举例而言，所述片段可包含在C端具有多至20个氨基酸残基，更优选多至10个氨基酸残基，且最优选多至5个氨基酸残基的截短的SEQIDNO:1。除了上述二氧化硅酶之外，本发明还涉及某些也经确定具有二氧化硅酶活性的α-碳酸酐酶的用途，特别是拥有二氧化硅酶活性和碳酸酐酶活性两者的SEQIDNO=Il或12所示的来自Bacillusplakortidis(之前为Bacillusgibsonii)的二氧化硅酶，以及也拥有二氧化硅酶活性和碳酸酐酶活性两者的来自克劳氏芽孢杆菌的二氧化硅酶(SEQIDN010)的用途。合适的二氧化硅酶还包括具有二氧化硅酶活性，并与Bacillusplakortidis二氧化硅酶(SEQIDNO:10或11)或克劳氏芽孢杆菌二氧化硅酶(SEQIDNO:9或10)具有优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%以及甚至最优选至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度的多肽。克劳氏芽孢杆菌碳酸酐酶的克隆和表达描述于WO2008/09057。从B.plakortidis制备碳酸酐酶描述于WO2007/019859。本发明还涉及示于SEQIDNO:8，来自Bacillushaludurons的二氧化硅酶。合适的二氧化硅酶还包括具有二氧化硅酶活性，并与Bacillushaludurons(SEQIDNO8)具有优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%以及甚至最优选至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性程度的多肽。B.haludurons碳酸酐酶的克隆和表达描述于TO2008/09057。适用于本发明的二氧化硅酶还包括具有二氧化硅酶活性，并与从Bacillusplakortidis二氧化硅酶(SEQIDNO11或12)、克劳氏芽孢杆菌二氧化硅酶(SEQIDNO9或10)或Bacillushaludurons(SEQIDNO:8)获得的二氧化硅酶具有多至三十个氨基酸、多至二十九个氨基酸、多至二十八个氨基酸、多至二十七个氨基酸、多至二十六个氨基酸、多至二十五个氨基酸、多至二十四个氨基酸、多至二十三个氨基酸、多至二十二个氨基酸、多至二十一个氨基酸、多至二十个氨基酸、多至十九个氨基酸、多至十八个氨基酸、多至十七个氨基酸、多至十六个氨基酸、多至十五个氨基酸、多至十四个氨基酸、多至十三个氨基酸、多至十二个氨基酸、多至十一个氨基酸、多至十个氨基酸、多至九个氨基酸、多至八个氨基酸、多至七个氨基酸、多至六个氨基酸、多至五个氨基酸、多至四个氨基酸、多至三个氨基酸、多至二个氨基酸或一个氨基酸差异的多肽。用于本发明的二氧化硅酶还包括Bacillusplakortidis二氧化硅酶(SEQIDNO11或12)、克劳氏芽孢杆菌二氧化硅酶(SEQIDN0:9或10)或Bacillushaludurons(SEQIDNO8)具有二氧化硅酶活性的片段。Bacillusplakortidis二氧化硅酶(SEQIDN0:11或12)、克劳氏芽孢杆菌二氧化硅酶(SEQIDN0:9或10)或Bacillushaludurons(SEQIDNO8)的片段是具有从该氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失一个或多个氨基酸的多肽。举例而言，片段可包括在N端截短多至20个氨基酸、多至10个氨基酸、多至5个氨基酸的SEQIDNO:8、9、10或11。用于本发明的本文中公开的二氧化硅酶可为分离的多肽。如本文中使用的术语“分离的多肽”指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，所述多肽如通过SDS-PAGE确定为至少纯、优选至少5%纯、更优选至少10%纯、更优选至少20%纯、更优选至少40%纯、更优选至少60%纯、甚至更优选至少80%纯和最优选至少90%纯。用于本发明的本文中公开的二氧化硅酶可为基本上纯的。本文中术语“基本上纯的多肽”指含有按重量计最多10%、优选最多8%、更优选最多6%、更优选最多5%、更优选最多4%、更优选最多3%、甚至更优选最多2%、最优选最多和甚至最优选最多0.5%的与其天然或重组结合的其他多肽材料的多肽制备物。因此，优选基本上纯的多肽为按制备物中总多肽材料重量计至少92%纯、优选至少94%纯、更优选至少95%纯、更优选至少96%纯、更优选至少96%纯、更优选至少97%纯、更优选至少98%纯、甚至更优选至少99%、最优选至少99.5%纯和甚至最优选100%纯的。本发明多肽优选为基本上纯的形式，即，该多肽制备物基本上不含与其天然或重组结合的其他多肽材料。这可通过例如藉由公知的重组方法或通过经典的纯化方法制备所述多肽来实现。根据本发明，本文中公开的二氧化硅酶用于使用本文中公开的二氧化硅酶修饰二氧化硅、硅氧烷或硅(IV)化合物以及这些化合物的混合聚合物的方法。如本文中使用的“修饰”包括二氧化硅、硅氧烷和其他硅(IV)化合物的水解或降解。在本发明的该方面的另一个实施方案中，本发明提供了使用本文中所述的二氧化硅酶合成二氧化硅、硅氧烷或硅(IV)化合物以及这些化合物的混合聚合物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括用于合成二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的方法，其包括用本文中所述的二氧化硅酶处理二氧化硅、硅氧烷或硅化合物前体，其中所述处理导致二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的合成。具有二氧化硅酶活性的酶可用于修饰或合成选自下组的化合物如硅酸、单烷^lSlhHII(monoalkoxysilantriole)、二;^氧基二醇(dialkoxysilandiole)氧基硅醇(trialkoxysilanole)、四烷氧基硅烷(tetraalkoxysilanes)、脂族烃基或芳基硅三醇(alkyl-oraryl-silantriole)、脂族烃基或芳基单烷氧基硅二醇(alkyl_oraryl-monoalkoxysilandiole)、月旨方矣:^二;^酉享(alkyl-oraryl-dialkoxysilanole)、脂族烃基或芳基三烷氧基硅烷(alkyl-oraryl_trialkoxysilane)或其他硅(IV)化合物。具有二氧化硅酶活性的多肽的技术用途包括玻璃、沙、石棉、计算机芯片、玻璃绒、玻璃纤维、光纤和硅氧烷的修饰。举例而言，二氧化硅的修饰可用于改变玻璃表面，例如，提供驱除灰尘(dirtrepellent)的窗玻璃，将太阳能电池粘附于窗玻璃，将遮阳(sunshading)材料粘附于窗玻璃等。所述多肽还可用于修饰填充物如Sipernat和Aerosil的性质，其中其他化学基团可附接于聚合的二氧化硅。该官能度还可用于修饰硅氧烷，其中可通过酶反应进行与标准化学反应相比更加精细的官能化。所述多肽还可用于从油砂分离沙，去除废石棉或在极端温和的条件下提供喷砂。所述二氧化硅酶以对于修饰或合成二氧化硅、硅氧烷或硅(IV)化合物的有效量使用。所述有效量会取决于技术应用而变化，且此量可由本领域普通技术人员确定。适当的温度、PH和其他反应条件也可由本领域普通技术人员确定。用于本发明方法的二氧化硅酶可配制为任何合适形式以供所意欲的技术应用，如作为液体例如水性形式，作为颗粒，非粉尘颗粒(non-dustinggranulate)或作为干粉或作为受保护的酶。实施例实施例I合成产生来自嗜热甲烷八叠球菌(UNIPR0T:P40881)的碳酸酐酶基因并将其针对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)进行密码子优化。将编码天然信号肽的基因序列通过WO99/43835(通过提述并入本文)所述的SOE融合交换至来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶(AmyL)，其与编码碳酸酐酶的DNA处于同一阅读框。将由包含所述碳酸酐酶编码序列而获得的核苷酸片段通过同源重组整合入枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组。将基因构建体在三重启动子系统的调控下表达(如WO99/43835中所述)。使用编码氯霉素乙酰转移酶的基因作为标记，如(Diderichsen等，1993，Plasmid30:312-315)中所述。通过DNA测序分析氯霉素抗性转化体以证实所述构建体的正确DNA序列。对于每个重组序列选择一个表达克隆。将单个碳酸酐酶表达克隆在旋转振荡桌(rotaryshakingtable)上在每个含有400ml补充3%ig/l氯霉素的基于大豆的培养基的IL带挡板的锥形瓶中发酵。将克隆在37°C发酵4日。将重组碳酸酐酶纯化至同质将培养液离心06，000秘，20分钟)，并将上清经过Whatman0.45μm过滤器过滤。所述0.45μm过滤物为大约pH7，而电导率为大约20mS/cm。将所述0.45“111过滤物通过625s印hadex层析转移至10mMHEPES/Na0H，pH7.0，然后施加于Q-s印haroseFF柱。将结合的蛋白用线性NaCl梯度洗脱。在洗脱过程中收集级分，并对这些级分测试碳酸酐酶活性。实施例II碳酸酐酶活件的检测培养液中的和纯化蛋白的碳酸酐酶活性根据(Wilbur，1948，JBiolCheml76147-154)确定。或者，所述碳酸酐酶活性作为酯酶活性用乙酸对硝基苯酯作为底物根据(Chirica等，2001，BiochimBiophysActa2001Jan12；1544(1-2):55-631544:55-63)来测量。细节可见于专利申请W02008/095057，其通过提述并入本文。实施例III二氧化硅水解缓冲液应用了含有50mM甘氨酸、50mM柠檬酸、50mM磷酸钠、50mM二硫苏糖醇、IOOmMNaCl和0.5mMZnSO4的缓冲液混合液，其pH值用HCl或NaOH调整至2.5,5.0,7.5和10.0。缓冲液是用不含硅酸盐的水(Merckl.16754.9010)在塑料容器中制备的。Mli使用下述二氧化硅底物作为晶体二氧化硅的代表，选取沙(白石英，Sigma-Aldrich274739)，而对于无定形二氧化硅，选22S和Aerosil200(均来自DegussaJS*Evonik)。Sipernat和Aerosil是通过两种不同的方法产生的分别为沉淀法和热解法，其可导致不同的表面性质，及因此对于酶作用的不同敏感性。表1.二氧化硅形式的性质权利要求1.一种用于修饰二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的方法，包括用具有二氧化硅酶活性的Y-碳酸酐酶处理二氧化硅、硅氧烷或硅化合物。2.一种用于合成二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的方法，包括用具有二氧化硅酶活性的Y-碳酸酐酶处理二氧化硅、硅氧烷或硅化合物的前体，其中所述处理导致二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的合成。3.一种用于修饰二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的方法，包括用从嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcinathermophila)获得的二氧化硅酶或与嗜热甲烷八叠球菌二氧化硅酶(SEQIDNO1)具有至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%以及甚至最优选至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的同一性程度的二氧化硅酶活性来处理二氧化硅、硅氧烷或硅化合物。4.权利要求3的方法，其中所述二氧化硅酶从嗜热甲烷八叠球菌获得。5.一种用于合成二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的方法，包括用从嗜热甲烷八叠球菌获得的二氧化硅酶或与嗜热甲烷八叠球菌二氧化硅酶(SEQIDNO1)具有至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%以及甚至最优选至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度的二氧化硅酶活性来处理二氧化硅、硅氧烷或硅化合物的前体，其中所述处理导致二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的合成。6.权利要求5的方法，其中所述二氧化硅酶从嗜热甲烷八叠球菌获得。7.一种用于修饰二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的方法，包括用从Bacillusplakortidis>3K^ifelflif(Bacillusclausii)Bacillushaludurons导白勺二_化硅酶或与Bacillusplakortidis二氧化硅酶(SEQIDNO11或12)、克劳氏芽孢杆菌二氧化硅酶(SEQIDNO9或10)或Bacillushaludurons二氧化硅酶(SEQIDNO8)具有至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%以及甚至最优选至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度的二氧化硅酶活性来处理二氧化硅、硅氧烷或硅化合物。8.权利要求7的方法，其中所述二氧化硅酶从Bacillusplakortidis获得。9.权利要求7的方法，其中所述二氧化硅酶从克劳氏芽孢杆菌获得。10.权利要求7的方法，其中所述二氧化硅酶从Bacillushaludurons获得。11.一种用于合成二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的方法，包括用从Bacillusplakortidis、克劳氏芽孢杆菌或Bacillushaludurons获得的二氧化硅酶或与Bacillusplakortidis二氧化硅酶(SEQIDNO:11或12)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)二氧化硅酶(SEQIDNO9或10)或Bacillushaludurons二氧化硅酶(SEQIDNO8)具有至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%以及甚至最优选至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度的二氧化硅酶活性来处理二氧化硅、硅氧烷或硅化合物的前体，其中所述处理导致二氧化硅、硅氧烷和硅(IV)化合物的合成。12.权利要求11的方法，其中所述二氧化硅酶从Bacillusplakortidis获得。13.权利要求11的方法，其中所述二氧化硅酶从克劳氏芽孢杆菌获得。14.权利要求11的方法，其中所述二氧化硅酶从Bacillushaludurons获得。15.权利要求1-14任一项的方法，其中所述二氧化硅酶用于修饰玻璃、沙、石棉、计算机芯片、玻璃绒、玻璃纤维、光纤和硅氧烷，用于从油砂去除沙，用于去除石棉或用于喷砂。全文摘要本发明涉及具有二氧化硅酶活性的多肽用于修饰或合成二氧化硅、硅氧烷和其他硅(IV)化合物的用途。本发明还涉及具有二氧化硅酶活性的多肽用于修饰玻璃、沙、石棉、计算机芯片、玻璃绒、玻璃纤维、光纤和硅氧烷、用于从油砂去除沙、用于去除石棉和用于喷砂的用途。文档编号C12P3/00GK102257148SQ200980151356公开日2011年11月23日申请日期2009年12月18日优先权日2008年12月19日发明者詹尼.E.托恩德,马丁.博彻特申请人:诺维信公司