专利名称：使用丙三醇氧化途径被阻断的重组菌株生产1,3-丙二醇的方法
技术领域：
本发明涉及通过培养丙三醇氧化途径被阻断的重组菌株生产1，3-丙二醇的方法，更特别的是涉及通过重组菌株的两步法培养生产1，3-丙二醇的方法，所述重组菌株中氧化代谢途径中的产生副产物的丙三醇代谢途径被阻断。
背景技术：
1，3-丙二醇可用作合成聚酯、聚醚或聚氨酯的原材料，并用于各种应用中，包括纤维(如高功能的衣服、地毯或汽车织物)及塑料薄膜。特别是，1，3-丙二醇与对苯二甲酸聚合产生的聚对苯二甲酸丙二酯(PPT)具有优良的物理性能，且熔点为228 °C，低于聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的熔点。因此，聚对苯二甲酸丙二酯具有强实用性且作为能够替代 PET的下一代纤维材料。而且，相比较于丁二醇或乙二醇产生的产物，单体1，3-丙二醇产生的塑料和聚合物示出了极好的光学稳定性。此外，1，3-丙二醇可用作聚乙二醇型润滑剂和溶剂，从而其商业价值的评估高于丙三醇。1，3-丙二醇可通过化学合成或微生物发酵生产。生产1，3-丙二醇的化学过程包括通过加氢甲酰化将环氧乙烷转化为1，3-丙二醇的过程(美国专利号3，687，981)及通过水合作用将丙烯醛转化为1，3-丙二醇的过程(美国专利号5，015，789)。然而，这些化学过程存在的问题在于1，3-丙二醇的生产过程需要高温或高压，导致高生产成本并产生含有环境污染物的废油。生物过程包括使用微生物由丙三醇生产1，3-丙二醇的过程，所述微生物如柠檬酸细菌属、梭状芽胞杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属等，它们都是兼性厌氧菌株 (美国专利号5，254，467)。在使用上述微生物将丙三醇转化到1，3-丙二醇的代谢过程中，产生了大量的各种氧化代谢产物。特别是，丙三醇的氧化代谢产物2，3 -丁二醇与1，3-丙二醇的沸点相似，因此作为1，3-丙二醇纯化过程中的巨大障碍。以前，本发明人试图使用代谢工程技术研发微生物，所述微生物在丙三醇代谢中只产生1，3-丙二醇，而不产生包括2，3-丙二醇的氧化代谢副产物，因此本发明人使用基因重组技术构建了突变体，其中该突变体的丙三醇代谢途径中产生副产物的氧化代谢途径被阻断以使该突变体只具有产生1，3-丙二醇的还原代谢途径(韩国专利申请号10-2008-0122166)。然而，尽管在普遍分批培养中不产生副产物，发现构建的突变体的1，3-丙二醇产量低。因此，本发明人为了尽力增加重组菌株培养过程中1，3-丙二醇的产量，在所述重组菌株中，丙三醇代谢途径中产生副产物的氧化代谢途径被阻断。因此，本发明人发现，进行两步法培养过程时将增加1，3-丙二醇的产量，从而完成本发明，所述两步法培养过程包括不添加丙三醇到培养基中的第一步培养过程，及添加丙三醇到培养基中的第二步培养过禾呈。
发明内容
因此，本发明的目的在于改进培养重组菌株的方法，在所述重组菌株中，丙三醇代谢途径中产生副产物的氧化代谢途径被阻断，从而提供具有提高生产率的生产1，3_丙二醇的方法。为了实现上述目的，本发明提供了通过培养微生物突变体生产1，3-丙二醇的方法，在所述微生物突变体中，转录激活因子编码基因或二羟基丙酮激酶编码基因被缺失或被失活，并且该微生物能够使用丙三醇作为碳源产生1，3-丙二醇，所述方法包括以下步骤(a)在无丙三醇的培养基中培养微生物突变体以使微生物菌株的细胞生长；(b)将丙三醇添加到微生物细胞生长的培养液中，并进一步培养细胞以产生1，3-丙二醇；及(c)回收产生的1，3-丙二醇。本发明还提供了通过培养微生物突变体生产1，3-丙二醇的方法，所述微生物突变体能够使用丙三醇作为碳源产生1，3-丙二醇，且其中将含有1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因的载体引入肺炎克雷伯氏菌突变体(AK菌株)中，该突变体缺失丙三醇脱氢酶基因 (DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)、1，3_丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再激活因子II基因(DhaBA》，或其中将1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因插入到突变体 (AK菌株)的染色体中，所述方法包括以下步骤(a)在无丙三醇的培养基中培养微生物突变体以使微生物菌株的细胞生长；(b)将丙三醇添加到微生物细胞生长的培养液中，并进一步培养细胞以产生1，3-丙二醇；及(c)回收产生的1，3-丙二醇。本发明还提供了通过培养微生物突变体生产1，3-丙二醇的方法，所述微生物突变体能够使用丙三醇作为碳源产生1，3"丙二醇，且其中将含有1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因和丙三醇脱水酶激活因子编码基因的载体引入到肺炎克雷伯氏菌突变体(AK菌株)中，该突变体缺失丙三醇脱氢酶基因(DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶激活因子II基因(DhaBA2)，或其中将1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因和丙三醇脱水酶再激活因子编码基因插入到突变体(AK菌株)的染色体中，所述方法包括以下步骤(a)在无丙三醇的培养基中培养微生物突变体以使微生物菌株的细胞生长；(b)将丙三醇添加到微生物细胞生长的培养液中，并进一步培养细胞以产生1，3-丙二醇；及(c)回收产生的1，3-丙二醇。本发明还提供了通过培养微生物突变体生产1，3-丙二醇的方法，所述微生物突变体能够使用丙三醇作为碳源产生1，3"丙二醇，且其中将含有1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因的载体引入到肺炎克雷伯氏菌突变体(AR菌株)中，该突变体缺失转录激活因子基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再激活因子II基因 (DhaBA2)，或其中将1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因插入到突变体(AR菌株)的染色体中，所述方法包括以下步骤(a)在无丙三醇的培养基中培养微生物突变体以使微生物菌株的细胞生长；(b)将丙三醇添加到微生物细胞生长的培养液中，并进一步培养细胞以产生1，3-丙二醇；及(c)回收产生的1，3-丙二醇。本发明还提供了通过培养微生物突变体生产1，3-丙二醇的方法，该微生物突变体能够使用丙三醇作为碳源产生1，3-丙二醇，且其中将含有1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因和丙三醇脱水酶再激活因子编码基因的载体引入到肺炎克雷伯氏菌突变体(AR菌株)中，该突变体缺失转录激活因子基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再激活因子II基因(DhaBA2)，或其中将1，3_丙二醇氧化还原酶编码基因和丙三醇脱水酶再激活因子编码基因插入到突变体(AR菌株)的染色体中，所述方法包括以下步骤(a)在无丙三醇的培养基中培养微生物突变体以使微生物菌株的细胞生长；(b)将丙三醇添加到微生物细胞生长的培养液中，并进一步培养细胞以产生1，3-丙二醇；及(c)回收产生的1，3-丙二醇。
图1为示意图，其示出了产生1，3-丙二醇的还原途径和丙三醇代谢过程中产生副产物的氧化途径。图2示出了使用dha调节子的结构制备根据本发明的突变体的方法。图3示出了构建质粒DNA的方法，其中质粒DNA用于制备根据本发明的AK菌株， 并包含以下连接DhaB基因氨基端(dhaB’)-LacZ启动子(Plaez)-阿泊拉霉素抗性基因_ DhaK基因氨基端(dhaK，)。图4示出了构建质粒DNA的方法，其中质粒DNA用于制备根据本发明的AR菌株， 并包含以下连接DhaB基因氨基端(dhaB’)-LacZ启动子(Plaez)-阿泊拉霉素抗性基因_ DhaR基因氨基端(dhaR，)。图5示出了构建质粒DNA的方法，所述质粒DNA包含IacZ启动子下游的肺炎克雷伯氏菌的DhaT基因和DhaB再激活酶基因。图6示出了构建质粒DNA的方法，所述质粒DNA只包含IacZ启动子下游的肺炎克雷伯氏菌的DhaT基因。图7示出了构建质粒DNA的方法，所述质粒DNA包含IacZ启动子下游的1，3_丙二醇氧化还原酶活性YqhD(E)基因(源于大肠杆菌)和DhaB再激活酶基因。图8示出了构建质粒DNA的方法，所述质粒DNA只包含IacZ启动子下游的1，3_丙二醇氧化还原酶活性YqhD (E)基因(源于大肠杆菌)。图9示出了构建质粒DNA的方法，所述质粒DNA包含IacZ启动子下游的1，3_丙二醇氧化还原酶活性YqhD(K)基因(源于肺炎克雷伯氏菌)和DhaB再激活酶基因。图10示出了构建质粒DNA的方法，所述质粒DNA只包含IacZ启动子下游的 1，3-丙二醇氧化还原酶活性YqhD(K)基因(源于肺炎克雷伯氏菌)。图11是一组示出了培养液组分的图表，所述培养液在本发明中使用的重组菌株的一步培养后获得。图12是一组示出了残留丙三醇浓度和培养液中产生的1，3-丙二醇浓度的图表， 所述培养液在本发明中使用的重组菌株的第二步培养后获得。图13示出了根据丙三醇浓度的本发明中使用的重组菌株的培养特征。图14示出了本发明中使用的重组菌株根据吹气速率的培养特征。图15示出了本发明中使用的重组菌株根据PH的培养特征特征。图16示出了本发明中使用的重组菌株根据微生物细胞数量的培养特征。通过以下的详细描述和附属的权利要求书，本发明的其他特征和实施方案将更清楚明白。
具体实施例方式
一方面，本发明针对通过培养微生物突变体生产1，3-丙二醇的方法，在所述微生物突变体中，转录激活因子编码基因或二羟基丙酮激酶编码基因被缺失或被失活，并且该微生物能够使用丙三醇作为碳源产生1，3"丙二醇，所述方法包括以下步骤(a)在无丙三醇的培养基中培养微生物突变体以使微生物菌株的细胞生长；(b)将丙三醇添加到微生物细胞生长的培养液中，并进一步培养细胞以产生1，3-丙二醇；及(c)回收产生的1，3-丙二丙三醇代谢途径由两个代谢途径组成氧化代谢途径和还原代谢途径(图1)。在氧化代谢过程中，NAD+依赖型丙三醇脱氢酶将丙三醇氧化为二羟基丙酮(DHA)，同时产生 NADH，然后其被DHA激酶转化为二羟基丙酮磷酸(DHAP)。通过糖酵解使二羟基丙酮磷酸 (DHAP)代谢同时用作生长所需的碳源和能源。在氧化代谢过程中，产生包括2，3-丁二醇、 乙酸、乙醇、乳酸和琥珀酸的副产物。同时，在还原代谢过程中，通过脱水酶的作用将丙三醇转化为3-羟基丙醛，然后通过NADH-依赖型氧化还原酶的作用还原为1，3-丙二醇，同时形成NAD+。在本发明中，培养的产生1，3-丙二醇的突变体是微生物菌株，其中丙三醇代谢过程的氧化途径涉及的基因编码蛋白被缺失或被失活，且其只通过还原途径只产生1，3-丙二醇，不产生包括2，3 - 丁二醇、乙醇、乳酸和琥珀酸的副产物。丙三醇的氧化和还原代谢途径相互联系紧密以维持细胞中NAD+-NADH的平衡，且将编码四种酶(即丙三醇脱水酶(dhaB)、l，3-丙二醇还原酶(dhaT)、丙三醇脱氢酶(dhaD) 和二羟基丙酮激酶(dhaK))的基因集群地排列在染色体上并通过共存的转录调节基因 DhaR在相同的调节子中调控。在本发明中，能够产生1，3-丙二醇的微生物可能是选自柠檬酸细菌属、梭状芽胞杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属和乳杆菌属的菌株。优选地，本发明使用的是肺炎克雷伯氏菌。本发明中使用的突变微生物是肺炎克雷伯氏菌，所述转录激活因子基因优选为 DhaR,并且所述二羟基丙酮激酶基因优选选自DhaK、DhaL, DhaM和DhaK’。在本发明中，所述突变体丙三醇氧化途径涉及的蛋白优选为丙三醇脱氢酶、转录激活因子和二羟基丙酮激酶。以下列方式构建本发明一个实施方案中使用的重组微生物且其中丙三醇氧化途径被阻断。通过删除肺炎克雷伯氏菌株染色体中的丙三醇脱氢酶基因(DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再激活因子II基因 (DhaBA2)构建肺炎克雷伯氏菌突变体(AK菌株)。用重组载体转化突变体，该重组载体包含1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再激活因子II基因(DhaBA2)，这些基因涉及丙三醇还原途径，从而恢复还原途径。因此，构建了只缺失1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和转录激活因子基因(DhaR)的突变体(图2)。因此，本发明一个实施方案中使用的突变体的特征在于，丙三醇脱氢酶基因 (DhaD)和转录激活因子基因(DhaR)被缺失或被失活。在该过程中，将IacZ启动子(Plaez)插入到涉及还原途径的基因上游，以使所述基因不受DhaR调节子的调控，由此使用诱导物人工控制所述基因的表达。
以下列方式构建本发明另一实施方案中使用的重组微生物且其中丙三醇氧化途径被阻断。通过删除肺炎克雷伯氏菌株染色体中的转录激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再激活因子II基因(DhaBA2)构建肺炎克雷伯氏菌突变体(AR菌株)。用重组载体转化突变体，所述重组载体包含1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶激活因子II基因(DhaBA2)，这些基因涉及丙三醇的还原途径，从而恢复所述还原途径。因此，构建了只缺失转录激活因子基因(DhaR)的突变体(图 2)。因此，本发明另一实施方案中使用的突变体的特征在于，转录激活因子基因 (DhaR)被缺失或被失活。另一方面，本发明针对通过培养微生物突变体生产1，3-丙二醇的方法，所述微生物突变体能够使用丙三醇作为碳源产生1，3-丙二醇，且其中将含有1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因的载体引入到肺炎克雷伯氏菌突变体(AK菌株)中，所述突变体缺失丙三醇脱氢酶基因(DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再激活因子II基因(DhaBA2)，或其中将1，3_丙二醇氧化还原酶编码基因插入到突变体(AK菌株)的染色体中，所述方法包括以下步骤(a)在无丙三醇的培养基中培养微生物突变体以使微生物菌株的细胞生长；(b)将丙三醇添加到微生物细胞生长的培养液中，并进一步培养细胞以产生1，3-丙二醇；及(c)回收产生的1，3-丙二醇。在本发明一实施方案中，发现丙三醇脱氢酶基因(DhaD)和转录激活因子基因 (DhaR)缺失的肺炎克雷伯氏菌和转录激活因子基因(DhaR)缺失的肺炎克雷伯氏菌在含有丙三醇的培养基中产生1，3-丙二醇，且除了少量的乙酸外不产生氧化途径的副产物，但是其产生1，3-丙二醇的能力低于野生型亲代菌株产生1，3-丙二醇的能力。为了克服这个问题，在无丙三醇培养基中先培养重组菌株以使微生物细胞生长并在含有丙三醇的培养基中进一步培养该重组菌株可产生高产量的1，3-丙二醇，且不产生副产物。在本发明一实施方案中，发现两步法培养肺炎克雷伯氏菌Cu菌株时，丙三醇到 1，3-丙二醇的转化率为35% (mol/mol)，然而，两步法培养重组菌株时，丙三醇到1，3-丙二醇的转化率为70% (mol/mol)，其明显提高。在本发明两步法培养中，优选添加的丙三醇的浓度为5-50 g/L，更优选的为5-20 g/L，最优选为10 g/L。本发明一实施方案中，发现吹气速率为0 vvm时，消耗很少的丙三醇或不消耗丙三醇，且吹气速率为0. 2 vvm.O. 5 vvm和1. 0 vvm时，丙三醇的消耗率与1，3-丙二醇的产量相似。在本发明另一实施方案中，发现至培养结束培养基的PH值分别维持在5、6、7和8 时，PH值为6的1，3-丙二醇的产量最高。而且，指示菌株生长程度的0D_值分别达到0、 0. 5、1、2和3时，添加丙三醇至终浓度为20 g/L。在这种情况下，如图12所示，OD600值越高，1，3-丙二醇的产量越高。为了制备本发明一实施方案中使用的突变体，通过同源重组方法使用质粒DNA消除(cured)的肺炎克雷伯氏菌MGH78578菌株(在下文中称为“Cu”)作为亲代菌株，将DhaB 酶再激活因子、DhaT基因、DhaR调节基因和dha调节子的DhaD基因替换为阿泊拉霉素抗性基因，从而制备了丙三醇氧化和还原途径均缺失的重组菌株(在下文中称为“AK”菌株)。 为了恢复AK菌株的丙三醇还原途径，制备用于恢复丙三醇还原途径的质粒DNA。通过扩增DhaB再激活酶基因(orfW)-orfX DNA片段和1，3-丙二醇氧化还原酶活性基因dhaT或 YQhD (源于大肠杆菌)或yqhD同源基因(源于肺炎克雷伯氏菌)，并将扩增产物插入到 pGEM TEasy载体的IacZ启动子下游而制备质粒DNA。因此，用于恢复丙三醇还原途径的质粒DNA将AK菌株转化为产生1，3-丙二醇的重组菌株。在本发明一实施方案中，发现丙三醇脱氢酶基因(DhaD)和转录激活因子基因 (DhaR)缺失的肺炎克雷伯氏菌和转录激活因子基因(DhaR)缺失的肺炎克雷伯氏菌在含有丙三醇的培养基中产生1，3-丙二醇，且除了少量的乙酸外不产生氧化途径的副产物。为了制备本发明一实施方案中使用的突变体，通过同源重组方法使用质粒DNA消除的肺炎克雷伯氏菌MGH78578菌株(在下文中称为“Cu”)作为亲代菌株，将dha调节子的 DhaB酶再激活因子、DhaT基因和DhaR调节基因替换为阿泊拉霉素抗性基因，从而制备了丙三醇氧化和还原途径均缺失的重组菌株(在下文中称为“AR”菌株)。为了恢复在本发明的一个实施例中制备的AR菌株的丙三醇还原途径，用于恢复丙三醇还原途径的质粒DNA将 AK菌株转化为重组菌株，该重组菌株能够产生1，3-丙二醇且不产生副产物。使用常规的分离技术从突变体的培养液中回收1，3-丙二醇，所述分离技术例如， 蒸馏、电渗析法、蒸发、色谱法、溶剂萃取、反应萃取，且这些技术在分离高纯物质时一般可结合使用。本文中所使用的术语基因“缺失”是指基因从染色体或质粒中被删除的状态，以使该基因编码的蛋白质不能产生。术语基因“失活”是指基因处于插入、易位或部分删除的状态，以使该基因编码的蛋白质不能产生。使用本领域已知的常规基因操作方法将基因插入宿主细胞的染色体中。例如，可使用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体和非病毒载体进行基因插入。
实施例在下文中，本发明将参照具体实施例进行详细描述。对于本领域技术人员显而易见的是这些实施例仅用于说明目的，而不限制本发明的保护范围。在以下实施例中，制备了肺炎雷伯氏菌菌株的丙三醇氧化和还原途径均阻断的突变体，并且再次恢复了丙三醇还原途径，从而制备能够产生1，3-丙二醇而没有副产物的突变体。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，可通过阻断微生物的丙三醇氧化途径而制备能够产生1，3-丙二醇而没有副产物的突变体，所述微生物能够从丙三醇产生1，3-丙二醇，并且培养这种突变体能带来相同的结果。同样，在以下实施例中，用含有涉及丙三醇还原途径的基因的载体转化的菌株，去恢复丙三醇氧化和还原途径均阻断的突变体菌株的丙三醇还原途径。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，使用常规插入方法将丙三醇还原途径的基因插入到突变体的染色体中，从而获得的菌株能够带来相同的结果。实施例1:制备丙三醇氧化和还原代谢途径均被阻断的重组菌株
为了重新设计丙三醇代谢途径，制备了重组菌株(AK和AR)，其中在肺炎克雷伯氏菌 MGH 78578 (ATCC 700721)中的丙三醇代谢途径完全被阻断。使用质粒DNA消除的肺炎克雷伯氏菌MGH 78578菌株(取名为"Cu")作为亲代菌株，利用同源重组方法，将DhaB酶再激活因子、DhaT基因、DhaR调节基因和dha调节子的DhaD基因替换为阿泊拉霉素抗性基因(图2)，从而制备丙三醇氧化和还原途径均缺失的重组菌株AK。与此同时，通过使用阿泊拉霉素抗性基因替代DhaB酶再激活因子、DhaT基因和DhaR调节基因来制备重组菌株AR。此处，使用人工可控制的IacZ启动子替代DhaB 基因上游的DhaR依赖型启动子。无抗生素的液体培养基中，培养几次肺炎克雷伯氏菌MGH 78578，之后从培养液中选择菌落接种到含有或不含四环素的培养基中。从菌落中选择由于缺失质粒DNA不能在含有四环素的培养基中生长的菌落并取名为“肺炎克雷伯氏菌MGH78578 Cu”。将选择的菌落用于制备重组菌株的亲代菌株。使用肺炎克雷伯氏菌MGH78578菌株的染色体DNA作为模板，并使用以下引物，通过PCR扩增用于制备同源重组的质粒的DNA片段(图2)。用于扩增dhaBI基因片段的引物
SEQ ID NO: 1: 5，-TCTAGAATGAAAAGATCAAAACGATTT-3， (dhaBI XbaI_480bpF) SEQ ID NO: 2: 5，-GGATCCGTCAGCGGCAATCTGCAC-3， (dhaBI BamHI-480bpR) 用于扩增dhaK基因片段的引物
SEQ ID NO: 3: 5，-AAGCTTCATGCTCTCCGGCGCCTGTC-3， (dhaK HindII1-200-700 bpF) SEQ ID NO: 4: 5，-AGATCTATTTGGTCCAGCGAGCTGAAGC-3， (dhaK BglII-200_700bpR) 用于扩增dhaR基因片段的引物
SEQ ID NO: 5: 5，-AGATCTCCTGGGATTTCGCGACGGCA-3， (dhaR bglII-200_700bpF) SEQ ID NO: 6: 5，-AAGCTTTCGACAATCGGTTTTAAGGTG-3， (dhaR HindIII-200_700bpR) 用于扩增Apr基因片段的引物
SEQ ID NO: 7: 5，-GTTAACCTGACGCCGTTGGATACACC-3’ Apr HpaI F SEQ ID NO: 8: 5’-AGATCTAAAAGCTTATGAGCTCAGCCAATCGA-3’ Apr HindIII-BglIIR 将扩增的DNA片段克隆到pGEM TCasy载体中并测序。然后，如图3和图4所示，使用所述载体构建了质粒DNAs。在如图3所示的方法中，构建用于制备AK菌株的质粒DNA，该质粒DNA包含以下连接构建DhaB基因氨基端(dhaB’)-LacZ启动子(Plaez)-阿泊拉霉素抗性基因-DhaK 基因氨基端(dhaK’)。在如图4所示的方法中，构建用于制备AR菌株的质粒DNA，该质粒 DNA包含以下连接DhaB基因氨基端(dhaB’)-LacZ启动子(Plaez)-阿泊拉霉素抗性基因-DhaR基因氨基端(dhaR')。用BamHI-Bgl II处理各质粒，并且收集的DNA片段通过电穿孔法引入到肺炎克雷伯氏菌Cu菌株中。然后，从Cu菌株细胞中分离在补充添加阿泊拉霉素的培养基中形成菌落的重组菌株。从而，获得了缺失DhaB酶再激活因子、DhaT基因、DhaR调节基因和dha 调节子的DhaD基因并且插入IacZ启动子和阿泊拉霉素抗性基因的重组菌株AK，以及缺失 DhaB酶再激活因子、DhaT基因、DhaR调节基因并插入IacZ启动子和阿泊拉霉素抗性基因的重组菌株AR。实施例2:制备恢复丙三醇还原途径的菌株 (1)制备用于恢复丙三醇还原途径的质粒DNA
使用以下示出的引物序列扩增DhaB再激活酶基因(OrfW)-OrfX DNA片段和1，3 -丙二醇氧化还原酶活性基因dhaT或yqhD (源于大肠杆菌)或yqhD同源基因(源于肺炎克雷伯氏菌)。将扩增的所述基因克隆到PGEM TEasy载体中并测序。然后，如图5所示，使用所述载体制备质粒DNA。SEQ ID NO: 95' -AGATCTATGAGCTATCGTATGTTTGA-3' (dhaT-Bglll F) SEQ ID NO: 10 :5’-CTCGAGAAGCTTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT-
3， (dhaT-Hindlll/XhoI R)
SEQ ID NO: 11:5，-AGATCTATGAACAACTTTAATCTGCAC-3， (yqhD-BglII F)
SEQ ID NO: 12: 5，-AGATCTATGAATAATTTCGACCTGCA-3， (yqhD-HindIII/Xhol R)
SEQ ID NO: 13: 5，-AGATCTATGAATAATTTCGACCTGCA-3， (yqhD Kle BglII F) SEQ ID NO: 14: 5’-CTCGAGAAGCTTAGCGTGCAGCCTCGTAAAT-3’ (yqhD Kle HindIII， XhoI R)
图5和6既示出了构建含有IacZ启动子下游的肺炎克雷伯氏菌的DhaT基因和DhaB 再激活酶基因的质粒DNA的过程，也示出了构建仅含有IacZ启动子下游DhaT基因的质粒 DNA的过程。图7和8既示出了构建含有1，3_丙二醇氧化还原酶活性YqhD(E)基因(源于大肠杆菌)和IacZ启动子下游的DhaB激活酶基因的质粒DNA的过程，也示出了仅含有 IacZ启动子下游YqhD(E)基因的质粒DNA的过程。图9和10既示出了构建含有1，3_丙二醇氧化还原酶活性YqhD (K)基因(源于肺炎克雷伯氏菌)和IacZ启动子下游DhaB再激活酶基因的质粒DNA的过程，也示出了仅含有IacZ启动子下游YqhD(K)基因的质粒DNA 的过程。(2)制备恢复丙三醇还原途径的重组菌株
以上构建的六种质粒DNAs的每一种含有基因编码1，3-丙二醇氧化还原活性酶，并通过电穿孔法将含有PBR322和DhaB再激活酶基因的质粒DNAs引入到每个AK和AR菌株中， 其中所述菌株的丙三醇厌氧代谢途径被阻断，从而制备了恢复丙三醇还原途径的重组菌株 (表1)。在重组菌株中，引入到亲代菌株Cu中的每个质粒被作为对照。在该实施例中构建的重组菌株保藏在韩国生命工学研究院生物资源中心(表2)。表1 本发明中使用的或构建的重组菌株和质粒DNAs
权利要求
1.一种通过培养微生物突变体生产1，3-丙二醇的方法，其中在所述微生物突变体中， 转录激活因子编码基因或二羟基丙酮激酶编码基因被缺失或被失活，并且该微生物能够使用丙三醇作为碳源产生1，3-丙二醇，所述方法包括以下步骤(a)在无丙三醇的培养基中培养微生物突变体以使微生物菌株的细胞生长；(b)将丙三醇添加到微生物细胞生长的培养液中，并进一步培养细胞以产生1，3-丙二醇；及(c)回收产生的1，3-丙二醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述能够产生1，3-丙二醇的微生物选自柠檬酸细菌属(以trobac ter)、梭状芽胞杆菌属ipios iridium)、肠杆菌属、克雷伯氏菌属{Klebsiella)禾口乳杆菌属 Hactobacillus)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中微生物突变体中丙三醇脱氢酶-编码基因缺失或失活。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述能够产生1，3-丙二醇的微生物是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella / ^腫twiae)，所述转录激活因子编码基因是DhaR，且二羟基丙酮激酶编码基因选自DhaK、DhaL, DhaM和DhaK'。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在微生物突变体中丙三醇脱氢酶编码基因(DhaD)和转录激活因子基因(DhaR)被缺失或被失活。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在微生物突变体中转录激活因子基因 (DhaR)被缺失或被失活。
7.—种通过培养微生物突变体生产1，3-丙二醇的方法，所述微生物突变体能够使用丙三醇作为碳源产生1，3-丙二醇，且其中将含有1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因的载体引入到肺炎克雷伯氏菌突变体(AK菌株)中，该突变体的丙三醇脱氢酶基因(DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再激活因子II 基因(DhaBA》被缺失，或其中将1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因插入到突变体(AK菌株)的染色体中，所述方法包括以下步骤(a)在无丙三醇的培养基中培养微生物突变体以使微生物菌株的细胞生长；(b)将丙三醇添加到微生物细胞生长的培养液中，并进一步培养细胞以产生1，3_丙二醇；及(c)回收产生的1，3-丙二醇。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述添加的丙三醇浓度为5-50g/L。
9.一种通过培养微生物突变体生产1，3-丙二醇的方法，所述微生物突变体能够使用丙三醇作为碳源产生1，3-丙二醇，且其中将含有1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因和丙三醇脱水酶激活因子编码基因的载体引入到肺炎克雷伯氏菌突变体(AK菌株)中，该突变体的丙三醇脱氢酶基因(DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化还原酶基因 (DhaT)和丙三醇脱水酶再激活因子II基因(DhaBA2)被缺失，或其中将1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因和丙三醇脱水酶激活因子编码基因插入到突变体(AK菌株)的染色体中， 所述方法包括以下步骤(a)在无丙三醇的培养基中培养微生物突变体以使微生物菌株的细胞生长；(b)将丙三醇添加到微生物细胞生长的培养液中，并进一步培养细胞以产生1，3-丙二醇；及(c)回收产生的1，3-丙二醇。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述添加的丙三醇浓度为5-50g/L。
11.一种通过培养微生物突变体生产1，3-丙二醇的方法，所述微生物突变体能够使用丙三醇作为碳源产生1，3-丙二醇，且其中将含有1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因的载体引入肺炎克雷伯氏菌突变体(AR菌株)中，该突变体的转录激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再激活因子II基因(DhaBA2)被缺失，或其中将1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因插入到突变体(AR菌株)的染色体中，所述方法包括以下步骤(a)在无丙三醇的培养基中培养微生物突变体以使微生物菌株的细胞生长；(b)将丙三醇添加到微生物细胞生长的培养液中，并进一步培养细胞以产生1，3_丙二醇；及(c)回收产生的1，3-丙二醇。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述添加的丙三醇浓度为5-50g/L。
13.—种通过培养微生物突变体生产1，3-丙二醇的方法，所述微生物突变体能够使用丙三醇作为碳源产生1，3-丙二醇，且其中将含有1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因和丙三醇脱水酶再激活因子编码基因的载体引入肺炎克雷伯氏菌突变体(AR菌株)中，该突变体的转录激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再激活因子II基因(DhaBA2)被缺失，或其中将1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因和丙三醇脱水酶激活因子编码基因插入到突变体(AR菌株)的染色体中，所述方法包括以下步骤(a)在无丙三醇的培养基中培养微生物突变体以使微生物菌株的细胞生长；(b)将丙三醇添加到微生物细胞生长的培养液中，并进一步培养细胞以产生1，3-丙二醇；及(c)回收产生的1，3-丙二醇。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述添加的丙三醇浓度为5-50g/L。
全文摘要
本发明涉及通过培养丙三醇氧化途径阻断的重组菌株生产1,3-丙二醇的方法，更特别的是涉及通过重组菌株的两步法培养生产1,3-丙二醇的方法，所述重组菌株中在丙三醇代谢途径中产生副产物的氧化代谢途径被阻断。两步法培养产生副产物的丙三醇氧化途径被阻断的重组菌株，可产生增加产量的1,3-丙二醇，且不产生增加纯化成本的产物。
文档编号C12N15/63GK102388141SQ200980156240
公开日2012年3月21日 申请日期2009年3月12日 优先权日2009年3月12日
发明者吴白禄, 崔珉镐, 徐正又, 徐美渶, 许仙宴, 金哲镐 申请人:韩国生命工学研究院